טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח Xenopus כליה

המטרה הכוללת של הליך זה היא למקד מיקרו-הזרקות לכליה המתפתחת של קסנופוס. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית כגון כיצד נוצרת הכליה ואילו גנים חשובים לתהליך זה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא ממקסמת את האספקה של ריאגנטים מוזרקים לרקמה ממוקדת.

הדמיה של שיטה זו חשובה מכיוון שזיהוי הבלסטומר הנכון למיקרו-הזרקה ממוקדת הוא קריטי. כדי להתחיל בהליך זה, שני האשכים בודדו מצפרדע זכר בודד והונחו בצלחת פטרי בגודל 60 מילימטר מלאה ב-10 מילילטר של תמיסת אחסון אשכים. לאחר מכן אחסן את האשכים בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, נאספו ביצים מנקבת צפרדע בצלחת פטרי של 100 מילימטר. שופכים עודפי מים מצלחת הפטרי. לאחר מכן חתכו רבע אשך ב-Testes Storage Solution.

מעבירים את חתיכת האשך לצלחת הפטרי המכילה את הביצים. לאחר מכן, חותכים את חלק האשכים לחתיכות קטנות. מוסיפים MMR בתוספת גנטמיצין לצלחת הפטרי כדי לכסות את הביצים.

מערבבים אותם על ידי סיבוב המנה ולאחר מכן ממתינים כ -30 דקות עד שההפריה תתבצע בטמפרטורת החדר. לאחר ההפריה הצד הפיגמנטי של העוברים צריך להיות פונה כלפי מעלה. הסר MMR מצלחת הפטרי באמצעות פיפטת העברה והוסף מספיק תמיסת דה-ג'לי כדי לכסות את העוברים.

לאחר מכן, סובבו את המנה במהלך הדקות הבאות כדי להמיס את שכבת הג'לי על העוברים. ברגע שהעוברים נוגעים זה בזה במרכז המנה, מעיל הג'לי הוסר. הסר את תמיסת הג'לי בעזרת פיפטת העברה.

לאחר מכן, שטפו את העוברים ללא ג'לי 3 עד 5 פעמים ב-MMR בתוספת גנטמיצין על ידי שפיכת ה-MMR בזהירות ומילוי הכלי ב-MMR חדש. אל תוציא את כל ה-MMR מהצלחת, מה שעלול לפגוע בעוברים. לאחר מכן, הסר ביצים לא מופרות או חתיכות אשך מצלחת הפטרי.

כדי לעכב את התפתחותם, הניחו מחצית מהעוברים מהפריה בודדת בצלחת פטרי שנשמרה ב-14 מעלות צלזיוס, ואת החצי השני של העוברים בצלחת פטרי שנשמרה ב-18 מעלות צלזיוס. עוברים יתפתחו לאט יותר ב-14 מעלות צלזיוס מאשר ב-18 מעלות צלזיוס. מאפשר מספר סטים של זריקות ממצמד מופרה יחיד.

הכן את תמיסת ההזרקה המכילה נקודה אפס ננוגרם אחד לכל ננוליטר mRNA של חלבון פלואורסצנטי אדום הקשור לממברנה. בזמן שהעוברים מתפתחים לשלב של 4 תאים או 8 תאים. שמור את תמיסת ההזרקה על קרח עד לשימוש.

לאחר מכן, טען צינור נימי זכוכית חלופי בגודל שבעה אינץ' לתוך מושך מחט כאשר החלק העליון של הצינור החלופי מיושר עם החלק העליון של מארז מושך המחט. הגדר את ערך מספר החום שתיים ל-800 ואת ערך המשיכה ל-650 ולחץ על לחצן המשיכה כדי למשוך את המחט. לאחר מכן, גזור את קצה המחט הנמשכת עם זוג מלקחיים של דומונט.

החלק את קולט המיקרופיפטה על גב המחט. לאחר מכן, החלק את טבעת ה-O של החור הגדול על גב המחט מאחורי הקולט. כעת, מלאו את המחט בשמן מינרלי באמצעות מחט היפרדרמית בגודל 27, והקפידו לא להכניס בועות אוויר למחט.

החלק את המחט על הבוכנה של המיקרו-מזרק, והושב את המחט לתוך החור הגדול של מרווח הפלסטיק הלבן המותקן על הבוכנה. אבטח את המחט על ידי הידוק הקולט. לאחר מכן, לחץ והחזק את כפתור הריק" בתיבת הבקרה של המיקרו-מזרק עד שיהיו שני צפצופים.

לאחר מכן, פיפטה שלושה מיקרוליטרים של תמיסת הזרקה על פיסת פרפילם. לאחר מכן, הכנס את קצה המחט לחרוז תמיסת ההזרקה על הפרפילם. לחץ והחזק את כפתור המילוי בתיבת הבקרה של המיקרו-מזרק כדי למשוך את תמיסת ההזרקה לתוך המחט.

לפני מיקרו-הזרקה, חשוב להבין את חלוקות התאים המוקדמות של עובר הקסנופוס. לעובר התא הבודד יש קוטב בעל פיגמנט כהה, חיה ומוט צמחי לבן ועולמי. בעובר שני התאים המחשוף הראשון מתרחש בדרך כלל בין הצד השמאלי והימני של העובר.

תאים אלה תורמים באותה מידה לשושלת הפרונפרית. המחשוף השני מחלק את חצאי הגב והגחון של העובר ומוביל לעובר בן 4 תאים. תאי הגב קטנים יותר ובעלי פחות פיגמנט מאשר תאי הגחון.

אם מזריקים לעובר בן 4 תאים, יש להזריק את הבלסטומר הגחוני השמאלי כדי למקד את הכליה השמאלית. המחשוף השלישי חוצה את צד החיה והצומח. התוצאה היא עובר בן 8 תאים.

בשלב זה ישנם ארבעה בלסטומרים של בעלי חיים וארבעה בלסטומרים צמחיים. כדי למקד את הכליה השמאלית של עובר בן 8 תאים, יש להזריק לתוך הגחון השמאלי, בלסטומיר צמחי. לאחר מכן, מלאו צלחת פטרי בגודל 60 מילימטר מרופדת ברשת פוליאסטר 500 מיקרון בחמישה אחוז פיקול ב-MMR בתוספת גנטמיצין.

פיפטה בזהירות 20 עד 30 עוברים בני 8 תאים לתוך הצלחת. בעזרת לולאת שיער יש לתפעל את העוברים כך שהבלסטומר שיש להזריק פונה למחט. כדי למקד את הכליה השמאלית, יישר את העוברים כך שהבלסטומרים הצמחיים הגחוניים השמאליים של עוברים בעלי 8 תאים יפנו למחט.

הזרקו 10 ננוליטר של תמיסת הזרקה לתוך הבלסטומר הנבחר של כל עובר בצלחת. לאחר מכן, העבירו את העוברים המוזרקים לבארות של צלחת תרבית עם חמישה אחוז פיקול ב-MMR בתוספת גנטמיצין. דגרו על העוברים המוזרקים בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס למשך כשעה עד שעתיים כדי לאפשר לבלסטומרים המוזרקים להחלים.

לאחר מכן, העבירו את העוברים שהוזרקו לבארות חדשות בצלחת התרבית המלאה ב-MMR בתוספת גנטמיצין. דגירה של העוברים בטמפרטורה של 14 עד 22 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים לשלב 38 עד 40. בהליך זה מעבירים 10 עד 20 עוברים בשלב 38 עד 40 לבקבוקון זכוכית.

הוסף לבקבוקון 10 מיקרוליטר של חמישה אחוז בנזוקאין ב-100 אחוז אתנול. מערבבים על ידי היפוך הבקבוקון וממתינים 10 דקות להרדמת העוברים. לאחר מכן, הסר את MMR מהבקבוקון ומלא אותו ב- MEMFA.

לאחר מכן, הנח אותו על פלטפורמת נדנדה תלת מימדית למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שעה הוציאו את MEMFA מהבקבוקון ומלאו אותו ב-100 אחוז מתנול. לאחר מכן, הניחו את הבקבוקון על משטח נדנדה תלת מימדי למשך עשר דקות בטמפרטורת החדר.

חזור על שלב שטיפה זה פעם נוספת ואחסן את העוברים ב-100 אחוז מתנול למשך הלילה במינוס 20 מעלות צלזיוס. העוברים מקובעים כעת ומוכנים לצביעה חיסונית. סכימה זו מראה איזה בלסטומר להזריק למיקוד של הפרונפרוסים השמאליים של עוברי קסנופוס בשלב 8 התאים באמצעות mRNA של חלבון פלואורסצנטי אדום הקשור לממברנה כעוקב.

לוקטליזציה של עוקב לאחר הזרקה בבלסטומר הצמחי הגחוני השמאלי מוצג באדום בעוד שהכליה מסומנת בירוק. תמונה זו מראה שהכליה הייתה מוכתמת בירוק בנוגדנים 3G8 ו-4A6. הנה מבט מקרוב על אזור הכליות המראה את ה-tracer loacalization והנה התמונה הממוזגת המציגה את הלוקליזציה המשותפת של העוקב עם הכליה.

מוצגת כאן תמונה קונפוקלית של הכליה של עובר שני מוכתם ב-3G8 ו-4A6. זהו הלוקליזציה של העוקב האדום בכליה וברקמה הסובבת וזו התמונה הממוזגת המציגה את הלוקליזציה המשותפת של העוקב 3G8 ו-4A6 בכליה. לפני ביצוע הליך זה חשוב להכיר את עובר הקסנופוס המוקדם.

זה יאפשר לך למקד כראוי למיקרו-הזרקות דרך מפת דהיית הקסנופוס המבוססת. לאחר שליטה, ניתן להתאים טכניקה זו כדי למקד לרקמות אחרות כמו הצינור העצבי או הלב.