Name: טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח Xenopus כליה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-03T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: למד טכניקת מיקרו-הזרקה מכוונת לכליה המתפתחת ב-Xenopus laevis. שיטה זו מאפשרת חקר תהליכי התפתחות כליה וזיהוי גנים מרכזיים בתהליך זה בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק NIDDK (K01DK092320) ומימון אתחול מתוך מחלקת ילדים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת טקסס מקגוורן.

<ol><li>Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+for+the+study+of+kidney+development%3A+Use+of+the+pronephros+in+the+analysis+of+organ+induction+and+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning.</a> Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).</li>
<li>Brandli, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+molecular+anatomy+of+the+Xenopus+pronephric+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards a molecular anatomy of the Xenopus pronephric kidney.</a> Int. J. Dev. Biol. 43 (5), 381-395 (1999).</li>
<li>Hensey, C., Dolan, V., Brady, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus+pronephros+as+a+model+system+for+the+study+of+kidney+development+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol.+Dial.+Transplant%22%5BJournal%5D)">The Xenopus pronephros as a model system for the study of kidney development and pathophysiology.</a> Nephrol. Dial. Transplant. 17, (Suppl 9) 73-74 (2002).</li>
<li>Carroll, T., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+between+Pax-8+and+lim-1+in+embryonic+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development.</a> Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).</li>
<li>Zhou, X., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric tubules.</a> Dev. Biol. 271 (2), 322-338 (2004).</li>
<li>Raciti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+pronephric+kidney+revealed+by+large-scale+gene+expression+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Organization of the pronephric kidney revealed by large-scale gene expression mapping.</a> Genome Biol. 9 (5), 84(2008).</li>
<li>Moody, S. A., Kline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+fate+during+cleavage+of+frog+%28Xenopus+laevis%29+blastomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Embryol.+Berl%22%5BJournal%5D)">Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres.</a> Anat. Embryol. Berl. 182 (4), 347-362 (1990).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+stage+of+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 16-cell stage of Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell+stage+of+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 32-cell stage of Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).</li>
<li>Bauer, D. V., Huang, S., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cleavage+stage+origin+of+Spemann%27s+Organizer%3A+Analysis+of+the+movements+of+blastomere+clones+before+and+during+gastrulation+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">The cleavage stage origin of Spemann's Organizer: Analysis of the movements of blastomere clones before and during gastrulation in Xenopus.</a> Dev. 120 (5), 1179-1189 (1994).</li>
<li>Karpinka, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenbase%2C+the+Xenopus+model+organism+database%3B+new+virtualized+system%2C+data+types+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes.</a> Nucleic Acids Res. 43, 756-763 (2015).</li>
<li>Davidson, L. A., Marsden, M., Keller, R., Desimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+alpha5beta1+and+fibronectin+regulate+polarized+cell+protrusions+required+for+Xenopus+convergence+and+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin alpha5beta1 and fibronectin regulate polarized cell protrusions required for Xenopus convergence and extension.</a> Curr. Biol. 16 (9), 833-844 (2006).</li>
<li>Wallingford, J. B., Carroll, T. J., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precocious+expression+of+the+Wilms%27+tumor+gene+xWT1+inhibits+embryonic+kidney+development+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Precocious expression of the Wilms' tumor gene xWT1 inhibits embryonic kidney development in Xenopus laevis.</a> Dev. Biol. 202, 103-112 (1998).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+laevis.+A+Laboratory+Manual%22">Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).</li>
<li>Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. The Xenopus pronephros: A kidney model making leaps toward understanding tubule development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+RK+%22Xenopus+Development%22">Xenopus Development</a>. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley. 215-238 (2014).</li>
<li>Lienkamp, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+kidney+tubules+elongate+using+a+planar+cell+polarity-dependent+rosette-based+mechanism+of+convergent+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent rosette-based mechanism of convergent extension.</a> Nat. Genet. 44 (12), 1382-1387 (2012).</li>
<li>Lyons, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+in+pronephric+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Requirement of Wnt/β-catenin signaling in pronephric kidney development.</a> Mech. Dev. 126 (3-4), 142-159 (2009).</li>
<li>Miller, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pronephric+tubulogenesis+requires+Daam1-mediated+planar+cell+polarity+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Pronephric tubulogenesis requires Daam1-mediated planar cell polarity signaling.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 22, 1654-1667 (2011).</li>
<li>Vize, P. D., Jones, E. A., Pfister, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Xenopus+pronephric+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the Xenopus pronephric system.</a> Dev. Biol. 171 (2), 531-540 (1995).</li>
<li>Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. Chapter 12: The Xenopus Pronephros: A Kidney Model Making Leaps toward Understanding Tubule Development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+RK+%22Xenopus+Development%22">Xenopus Development</a>. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley and Sons. Oxford. (2014).</li>
<li>Taira, M., Otani, H., Jamrich, M., Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+LIM+class+homeobox+gene+Xlim-1+in+pronephros+and+CNS+cell+lineages+of+Xenopus+embryos+is+affected+by+retinoic+acid+and+exogastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of the LIM class homeobox gene Xlim-1 in pronephros and CNS cell lineages of Xenopus embryos is affected by retinoic acid and exogastrulation.</a> Development. 120, 1525-1536 (1994).</li>
<li>Weber, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+the+tissue-specific+transcription+factor+HNF1+alpha+%28LFB1%29+during+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of the tissue-specific transcription factor HNF1 alpha (LFB1) during Xenopus development.</a> Int. Dev. Biol. 40 (1), 297-304 (1996).</li>
<li>Carroll, T. J., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+between+Pax-8+and+lim-1+in+embryonic+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development.</a> Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).</li>
<li>Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+injected+DNA+templates+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos.</a> Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).</li>
<li>Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chloride+conductance+channel+ClC-K+is+a+specific+marker+for+the+Xenopus+pronephric+distal+tubule+and+duct%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr.+Patterns%22%5BJournal%5D)">The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct.</a> Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).</li>
<li>Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Na%2B%2C+K%2B-ATPase+alpha+subunit+requires+gastrulation+in+the+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo.</a> Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%3A+A+systematical+%26+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical & chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. , Garland Publishing, Inc. NY. (1994).</li>
<li>Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+functional+role+of+the+cytoskeleton+in+determination+of+the+dorsoventral+axis+in+Xenopus+laevis+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).</li>
<li>Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastomeres+show+differential+fate+changes+in+8-cell+Xenopus+laevis+embryos+that+are+rotated+90+degrees+before+the+first+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage.</a> Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).</li>
<li>Colman, A., Drummond, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stability+and+movement+of+mRNA+in+Xenopus+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morph%22%5BJournal%5D)">The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

מיקוד כִּליַת רֵאשִׁית לפתח עוברי Xenopus מסתמכת על זיהוי הזרקת blastomere הנכון. הזרקה של blastomere V2 של עוברים 8 תאים מטרות כִּליַת רֵאשִׁית שמאל 18. זה משאיר את כִּליַת רֵאשִׁית התקינה הנגדית כמו שליטה פנימית. אם morpholino מציאה או ביטוי יתר RNA משמש המשנה את ההתפתחות בכליה, כִּליַת רֵאשִׁית התקינה הנגדית יכולה לשמש כדי להשוות את ההשפעות של מציאת גן או ביטוי יתר על כִּליַת רֵאשִׁית השמאל. במקרה זה, בקרות נאותות כגון morpholino שליטה תואמת או מבנה RNA שליל...

הכליה העוברית Xenopus, את כִּליַת רֵאשִׁית, הוא מודל טוב ללימוד פיתוח כליות ומחלות. עובר לפתח חיצוני, הם גדולים, יכולים להיות מיוצרים בכמויות גדולות, והם מניפולציות בקלות באמצעות microinjection או הליכים כירורגיים. בנוסף, הגנים לפיקוח על בניית כליות אצל יונקים ודו-חיים הם משומר. כליות יונקות להתקדם דרך שלושה שלבים: כִּליַת רֵאשִׁית, הכליה, ו metanephros 1, בעוד דו חיים עובריים כִּליַת רֵאשִׁית ודו-חי בוגרים יש metanephros. יחידת הסינון הבסיסית של צורות כליות אלה היא נפרון, ושניהם יונקים ודו-חיים דורשים את אותה מפלי איתות ואירועים אינדוקטיביים לעבור nephrogenesis 2, 3. כִּליַת רֵאשִׁית Xenopus מכילה נפרון בודד מורכב הפרוקסימלי, ביניים, דיסטלי וחיבור tubules, וכן glomus (מקביל ל glomerulus היונק) 1, 4-6 (איור 1 </strאונג&gt;). הווה נפרון הבודד, הגדול Xenopus כִּליַת רֵאשִׁית הופך אותו מתאים כמודל פשוט לחקר הגנים המעורבים בתהליכי פיתוח כליות ומחלות. מפות גורל התא הוקמו עבור עוברי Xenopus מוקדם, והם זמינים באופן חופשי באינטרנט ב Xenbase 7-11. כאן אנו מתארים טכניקה microinjection של קליעים נותבים השושלת למקד את כִּליַת רֵאשִׁית Xenopus פיתוח, אם כי באותה טכניקה ניתן להתאים למקד ברקמות אחרות כגון הלב או העיניים. קליעים נותבים השושלת הם תוויות (כולל צבעים חיוניים, dextrans שכותרתו fluorescently, אנזימים לגילוי histochemically, ו mRNA קידוד חלבוני ניאון) כי ניתן להזריק לתוך blastomere מוקדם, המאפשר הדמיה של הצאצאים של התא במהלך ההתפתחות. פרוטוקול זה מנצל mRNA MEM-RFP, קרום קידוד ממוקד חלבון פלואורסצנטי אדום 12, כמו נותב השושלת. טק microinjection הממוקדniques עבור בלסטומרים בודדים עוברים 4 ו 8 תאים המתואר כאן יכול להיות מנוצל להזרקה עם morpholinos להפיל ביטוי גנים, או עם RNA אקסוגני overexpress הגן של עניין. באמצעות הזרקה לתוך blastomere הגחון, הצמחי, בעיקר כִּליַת רֵאשִׁית של העובר תהיה ממוקדת, עוזבת את כִּליַת רֵאשִׁית הנגדית כביקורת התפתחותית. שיתוף ההזרקה נותב מוודאת כי blastomere הנכון הוזרק, ומופעים אשר רקמות בעובר נבעו blastomere המוזרק, אימות מיקוד של כִּליַת רֵאשִׁית. Immunostaining של כִּליַת רֵאשִׁית מאפשר הדמיה של מידת הצלחה של tubules pronephric היה ממוקד. תופעות התבטאות יתר ו מציאה אז יכול להיות הבקיע נגד הצד הנגדי של העובר, אשר משמש כביקורת התפתחותי, והוא יכול לשמש כדי לחשב את מדד pronephric 13. הזמינות של מפות גורל התא מאפשרת טכניקת microinjection ממוקדת זה כדי לשמש יעד רקמות othאה מאשר כִּליַת רֵאשִׁית, ואת שיתוף ההזרקה נותב ניאון מאפשר microinjection המתמקדת בכל רקמות להיות מאומתת לפני הניתוח. במהלך microinjection העובר, טמפרטורה התפתחותי צריכה להיות מוסדרת בחוזקה, בהתחשב בכך את קצב התפתחות Xenopus תלוי מאוד עליו 14. עובר צריך להיות מודגרות בטמפרטורות קרירות (14 - 16 מעלות צלזיוס) במשך 4 ו זריקות 8 תאים כי זמן הפיתוח הוא האטה. בגיל 22 ° C, זמן הפיתוח מ -1 הבמה (תא 1) לביים 3 (4 תאים) הוא כ 2 שעות, תוך 16 ° C זמן הפיתוח לשלב 3 הוא כ 4 שעות. זה לוקח בערך 15 דקות לסיום מעובר 4 תאים לעובר 8 תאים (שלב 4) על 22 מעלות צלזיוס, אבל לוקח בערך 30 דקות על 16 מעלות צלזיוס. באופן דומה, על 22 מעלות צלזיוס, זה לוקח רק 30 דקות עבור עובר 8 תאים כדי להתקדם עובר 16 תאים (שלב 5). הפעם הוא עלה ל 45 דקות ב 16 מעלות צלזיוס. הrefore, כדאי להאט את קצב הפיתוח של עוברים כדי לאפשר מספיק זמן עבור זריקות בשלב 8 תאים לפני העוברים להתקדם לשלב 16 תאים. בנוסף, בטמפרטורות צמיחה יכולות להיות מווסתות כדי להאיץ או להאט התפתחות עוברית עד הכליות פתחו באופן מלא. האפידרמיס של עובר ראשן שלבית Xenopus הוא יחסית שקוף, המאפשר הדמיה קלה של כִּליַת רֵאשִׁית בפיתוח בלי דיסקציה או סליקה של הרקמה 15. בשל השקיפות היחסית של עוברי Xenopus, הדמיה תא חי הוא גם אפשרי 16,17. כל הר immunostaining לדמיין את כִּליַת רֵאשִׁית אפשרי עם נוגדנים נקבע כי התווית הפרוקסימלי, ביניים, דיסטלי ו tubules חיבור של שלב 38 - 40 עוברים המאפשרים הערכת התפתחות pronephric ממוקד לאחר מניפולציה של ביטוי גנים העוברים Xenopus 18-20.

<table><tbody><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>פישר</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי&nbsp;</td><td>פישר</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>פישר</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>פישר</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>פישר</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת גנטמיצין, 50 מ"ג/מ"ל</td><td>אמרסקו</td><td>E737-20 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>L-ציסטאין, 99%+</td><td>אקרוס אורגניקס</td><td>52-90-4</td><td></td></tr><tr><td></td><td>פיקול פישר</td><td>BP525-100</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 100 מ"מ x 15 מ"מ</td><td>פישר</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>מיני מקרר II</td><td>Boekel</td><td>260009</td><td>אינקובטור ספסל לעוברים.</td></tr><tr>פלסמיד <td></td><td></td><td>Gap43-RFP</td><td>לייצור RNA מעקב. סימוכין: Davidson et al., 2006.</td></tr><tr><td>רודמין דקסטרן, 10,000 מ"ו.</td><td>Invitrogen</td><td>D1817</td><td>Tracer.</td></tr><tr><td>דרגת ביולוגיה מולקולרית, USP מים מטוהרים סטריליים</td><td>קורנינג</td><td>46-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>7 אינץ' צינורות החלפת דראמונד</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/XL</td><td>מחטי מיקרו-הזרקה.</td></tr><tr><td>מושך מחט</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים</td><td>Dumont</td><td>11252-30</td><td>לשבירת קצה מחט מיקרו-הזרקה.</td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>מיקרו-מזרק.</td></tr><tr><td>שמן מינרלי, כבד</td><td>פישר</td><td>CAS 8042-47-5</td><td>שמן למחטים.</td></tr><tr><td>27 גרם מחט היפודרמית מונוגז'קט</td><td>Covidien</td><td>8881200508</td><td>להעמסת שמן מינרלי למחט מיקרו-הזרקה.</td></tr><tr><td>5 מ"ל מזרק Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309646</td><td>להעמסת שמן מינרלי למחט מיקרו-הזרקה.</td></tr><tr><td>צלחת פטרי 60 מ"מ x 15 מ"מ</td><td>פישר</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>רשת פוליאסטר 800 מיקרון</td><td>חלקים קטנים</td><td>CMY-0800-C</td><td></td></tr><tr><td>צנרת העברה</td><td>פישר</td><td>13-711-7M</td><td>להעברת עוברים. חותכים את הקצה כך שהעוברים ייקלטו בקלות על ידי הפיפטה.</td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים 6 בארות</td><td>Nest Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>פישר</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"מ x 45 מ"מ בקבוקון הברגה</td><td>פישר</td><td>03-339-25B</td><td>לקיבוע, צביעה ואחסון עוברים.</td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים 24 בארות</td><td>קן ביוטכנולוגיה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספקטרום</td><td>בנזוקאין</td><td>BE130</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>פישר</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>פישר</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (PBS) 1x אבקה</td><td>פישר</td><td>BP661-50</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>פישר</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>3D Mini Rocker, דגם 135</td><td>Denville Scientific</td><td>57281</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים, ממוצא ניו זילנדי</td><td>Invitrogen</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>Fisher</td><td>S227I-25</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן מונוקלונלי 3G8</td><td>European Xenopus Resource Center</td><td></td><td>נוגדן ראשוני לתיוג פרוקסימלי צינורות.</td></tr><tr><td>נוגדן חד-שבטי 4A6</td><td>European Xenopus Resource Center</td><td></td><td>נוגדן ראשוני לסימון צינורות ביניים, דיסטליים וחיבור.</td></tr><tr><td>anti-RFP pAb, מטוהר IgG/rabbit</td><td>MBL</td><td>PM005</td><td>נוגדן ראשוני לסימון עוקב Gap43-RFP.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 עז נגד עכברים IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11001</td><td>נוגדן משני לתיוג צינורות כליה.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 עז נגד ארנב IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21428</td><td>נוגדן משני לסימון עוקב Gap43-RFP.</td></tr><tr><td>9 צלחת ספוט חלל</td><td>קורנינג</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>בנזיל בנזואט</td><td>פישר</td><td>105862500</td><td>אופציונלי - לפינוי עוברים</td></tr><tr><td>בנזיל אלכוהול</td><td>פישר</td><td>A396-500</td><td>אופציונלי - לפינוי עוברים</td></tr></tbody></table>

טכניקה לכוון microinjection אל פיתוח<em&gt; xenopus</em&gt; כליה

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

הכליה העוברית של Xenopus laevis (צפרדע), את כִּליַת רֵאשִׁית, מורכב נפרון יחיד, והוא יכול לשמש כמודל למחלת כליות. עוברי Xenopus הם גדולים, לפתח חיצונית, ניתן להשפיע בקלות על ידי microinjection או הליכים כירורגיים. בנוסף, מפות גורל הוקמו עבור עוברי Xenopus מוקדם. microinjection ממוקד לתוך blastomere הפרט כי בסופו של דבר יהיה להצמיח איבר או רקמה של עניין ניתן להשתמש כדי overexpress או להפיל ביטוי גנים באופן סלקטיבי בתוך האזור המוגבל הזאת, הפחתת השפעות משניות בשאר העובר המתפתח. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לנצל מפות גורל Xenopus הוקמה כדי למקד את הכליה Xenopus פיתוח (להלן כִּליַת רֵאשִׁית), באמצעות microinjection לתוך blastomere ספציפיים של עוברים תאים 8 4 ו. הזרקה של קליעי נותבים שושלת מאפשרת אימות של המיקוד הספציפי של הזריקה.לאחר עוברים פתחו לשלב 38 - 40, כל הר immunostaining משמש כדי לחזות התפתחות pronephric, והתרומה ידי תאים ממוקדים אל כִּליַת רֵאשִׁית ניתן להעריך. באותה טכניקה ניתן להתאים למקד סוגי רקמות אחרות בנוסף כִּליַת רֵאשִׁית.

Microinjections של 4 ו-תאים 8 עוברי Xenopus עם mRNA MEM-RFP להראות רמות שונות של מיקוד אל כִּליַת רֵאשִׁית. איור 4 מראה הבמה 40 עוברים עם דפוסי ביטוי mRNA MEM-RFP הנכון. עובר הוזרקו ב blastomere הגחון השמאלי (איור 4 א), מיון עבור דפוס הביטוי ההולם של mRNA MEM-RFP. בנוסף להביע MEM-RFP ב הפרוקסימלי, ביניים, דיסטלי וחיבור tubules של הכליה, עוברים מוזרק כראוי צפויים להראות הקרינה באפידרמיס של הראש, חדק, והזנב....

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש במפות גורל ועוקבי שושלת כדי למקד זריקות לבלסטומרים בודדים המולידים כליה של עוברי Xenopus laevis.

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ביצוע מיקרו-הזרקות ממוקדות לכליה של Xenopus בשלבי התפתחות. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית, כגון האופן שבו הכליה נוצרת ואילו גנים חשובים לתהליך זה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא ממקסמת את הובלת הרכיבים המוזרקים לרקמה המיועדת.הדמיה של שיטה זו היא חשובה מכיוון שזיהוי הבלסטומר הנכון להזרקה מיקרוסקופית ממוקדת הוא קריטי. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, יש לבודד את שתי האשכים מצפר קרפד זכר בודד ולהניחם בצלחת פטרי בקוטר 60 מילימטר הממולאת ב-10 מיליליטר של תמיסת אחסון אשכים. לאחר מכן, יש לאחסן את האשכים בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס.בשלב הבא, נאספו ביצים מנקבת צפרדע בתוך צלחת פטרי בקוטר 100 מילימטר. יש לשפוך את עודפי המים מהצלחת. לאחר מכן, יש לחתוך רבע מאשכול אשכים בתוך תמיסת אחסון אשכים (Testes Storage Solution).העבירו את נתח האשכים לצלוחית הפטרי המכילה את הביצים. לאחר מכן, חתכו את חלק האשכים לחתיכות קטנות. הוסיפו MMR בתוספת Gentamycin לצלוחית הפטרי כך שיכסו את הביצים.ערבבו אותם על ידי סיבוב של הפיתרי, ולאחר מכן המתינו כ-30 דקות להתרחשות ההפריה בטמפרטורת החדר. לאחר ההפריה, הצד הפיגמנטי של העוברים צריך להיות פונה כלפי מעלה. הסירו את ה-MMR מהפיתרי באמצעות פיפט העברה והוסיפו מספיק מתמיסת ה-de-jelly כדי לכסות את העוברים.לאחר מכן, סובבו בעדינות את הצלחת במהלך הדקות הבאות כדי להמיס את מעטפת הג'לי העוטפת את העוברים. כאשר העוברים נוגעים זה בזה במרכז הצלחת, ניתן לומר שמעטפת הג'לי הוסרה. הסירו את תמיסת הסרת הג'לי באמצעות פיפטת העברה.בשלב הבא, שטפו את העובריים לאחר הסרת הג'ל 3 עד 5 פעמים ב-MMR בתוספת Gentamycin, על ידי שפיכה זהירה של ה-MMR ומילוי הצלחת ב-MMR חדש. אין להסיר את כל ה-MMR מהצלחת, שכן הדבר עלול לפגוע בעובריים. לאחר מכן, הסירו מהצלחת הפטרי כל ביציות שלא הופרו או חתיכות של אשכים.כדי ליצור פריסה של שלבי ההתפתחות, העבירו מחצית מהעוברים מהפריה אחת לצלח פטרי הנשמר בטמפרטורה של 14 degrees Celsius, ואת מחצית העוברים השנייה לצלח פטרי הנשמר בטמפרטורה של 18 degrees Celsius. העוברים יתפתחו לאט יותר ב-14 degrees Celsius מאשר ב-18 degrees Celsius. דבר זה יאפשר ביצוע של מספר סבבי הזרקות מתוך מקבץ הפרייה בודד.הכינו את תמיסת ההזרקה המכילה 0.01 ng/nL של mRNA של Membrane-bound Red Fluorescent Protein. בזמן שהעוברים מתפתחים לשלב של 4 תאים או 8 תאים, שמרו את תמיסת ההזרקה על קרח עד לשימוש.לאחר מכן, הכניסו צינור נימי זכוכית חלופי באורך שבעה אינץ' למכשיר משיכת מחטים (needle puller), כך שחלקו העליון של הצינור החלופי יהיה מיושר עם החלק העליון של מארז המכשיר. הגדירו את ערך החימום מספר שתיים ל-800 ואת ערך המשיכה ל-650, ולחצו על כפתור המשיכה כדי למשוך את המחט. לאחר מכן, גזרו את קצה המחט שנמשכה באמצעות פינצטת Dumont.השחילו את תפס המיקרופיפטה אל גב המחט. לאחר מכן, השחילו את אטם ה-O-ring בעל החור הגדול אל גב המחט, מאחור לתפס. כעת, מלאו את המחט בשמן מינרלי באמצעות מחט היפרדרמית בכילוי 27, והקפידו שלא יחדרו בועות אוויר לתוך המחט.החליקו את המחט על הבוכנה של המיקרו-מזרק, והושיבו את המחט בתוך החור הגדול של המרווח הפלסטי הלבן המותקן על הבוכנה. הדקו את המחט על ידי הידוק התפס. לאחר מכן, לחצו והחזיקו את כפתור ה-"Empty" בתיבת הבקרה של המיקרו-מזרק עד לשמיעת שני צפצופים.לאחר מכן, העבירו בפיפטה 3 µL מתמיס ההזרקה על פיסת פאראפילם (parafilm). לאחר מכן, הכניסו את קצה המחט לתוך טיפת תמיס ההזרקה שעל הפאראפילם. לחצו והחזיקו את כפתור ה-"Fill" בתיבת הבקרה של המיקרו-מזרק כדי לשאוב את תמיס ההזרקה אל תוך המחט.לפני ביצוע המיקרו-הזרקה, חשוב להבין את חלוקות התאים המוקדמות של עובר ה-xenopus. עובר התא הבודד כולל קוטב אנימלי בעל פיגמנט כהה וקוטב וגטלי לבן ועשיר בחלמון. בעובר בעל שני תאים, הביקוע הראשון מתרחש בדרך כלל בין הצד השמאלי לצד הימני של העובר.תאים אלו תורמים באופן שווה לשושלת הפרונפרית (pronephric lineage). השסע השני מחלק את המחצית הגבנית (dorsal) והבטנית (ventral) שלו שלו העובר, מה שמוביל לעובר בעל 4 תאים. התאים הגבניים קטנים יותר ומכילים פחות פיגמנט מהתאים הבטניים.במידה ומבצעים הזרקה לעובר בשלב 4 תאים, יש להזריק לבלסטומר הבטני השמאלי כדי להתמקד בכליה השמאלית. השסע השלישי חוצה את הצדדים האנימליים והווגטליים, ובכך נוצר עובר בשלב 8 תאים.בשלב זה ישנם ארבעה בלאסטומרים אנימליים וארבעה בלאסטומרים וגטליים. כדי להתמקד בכליה השמאלית של עובר בן 8 תאים, יש להזריק לבלאסטומר הוגטלי הוונטרלי השמאלי. לאחר מכן, מלאו צלחת פטרי בקוטר 60 מילימטר המרופדת ברשת פוליאסטר של 500 מיקרון ב-5% fycol ב-MMR בתוספת Gentamycin.העבירו בזהירות באמצעות פיפט 20 עד 30 עוברים בשלב 8 תאים אל תוך הצלחת. השתמשו בלולאת שיער כדי להניע את העוברים כך שהבלסטומרה המיועדת להזרקה תפנה לכיוון המחט. כדי לכוון לכליה השמאלית, יישרו את העוברים כך שהבלסטומרות הוונטרליות-ווגטליות השמאליות של עוברים בשלב 8 תאים יפנו לכיוון המחט.הזריקו 10 nanoliters מתמיס ההזרקה אל הבלסטומר שנבחר בכל עובר בצלחת. לאחר מכן, העבירו את העוברים המוזרקים לבארי של פלטת תרבית המכילה five percent fycol ב-MMR בתוספת Gentamycin. דגרו את העוברים המוזרקים בטמפרטורה של 16 °C למשך כשעה עד שעתיים כדי לאפשר לבלסטומרים המוזרקים להחלים.לאחר מכן, העבירו את העובריים שעברו מיקרו-הזרקה לבארות חדשות בלוח התרבית הממולאות ב-MMR בתוספת Gentamycin. דגרו את העובריים בטמפרטורה של 14 עד 22 °C עד שיגיעו לשלבים 38 עד 40. בהליך זה, העבירו 10 עד 20 עובריים בשלבים 38 עד 40 לבקבוק זכוכית.הוסף למבחנה 10 µL של בנזוקאין בריכוז 5% ב-100% אתנול. ערבב על ידי היפוך המבחנה והמתן 10 דקות להרדמת העובריים. לאחר מכן, הסר את ה-MMR מהמבחנה ומלא אותה ב-MEMFA.לאחר מכן, הניחו את המבחנה על פלטפורמה נדנדת תלת-ממדית למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר שעה, הוציאו את ה-MEMFA מהמבחנה ומלאו אותה ב-100% methanol. לאחר מכן, הניחו את המבחנה על פלטפורמה נדנדת תלת-ממדית למשך עשר דקות בטמפרטורת החדר.חזור על שלב שטיפה זה פעם אחת נוספת ואחסן את העוברים ב-100% מתנול למשך לילה בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. העוברים מקובעים כעת ומוכנים לצביעה אימונוהיסטוכימית. תרשים זה מראה באיזה בלאסטומר יש להזריק כדי לכוון לפרונפרוס השמאלי של עוברי xenopus בשלב 8 התאים, תוך שימוש ב-mRNA של חלבון פלואורסצנטי אדום קשור לממברנה כסימן מעקב.מיקום הסמן לאחר הזרקה לבלסטומרה הצמחית-בטנית השמאלית מוצג באדום, בעוד הכליה מסומנת בירוק. תמונה זו מראה כי הכליה נצבעה בירוק באמצעות הנוגדנים 3G8 ו-4A6. כאן מוצגת תמונת תקריב של אזור הכליה המראה את מיקום הסמן, וכאן מוצגת התמונה המאוחדת המראה את הלוקליזציה המשותפת של הסמן עם הכליה.כאן מוצגת תמונה קונפוקלית של כליות של עובר שני שנצבעו ב-3G8 ו-4A6. זוהי הלוקליזציה של הסמן האדום בכליות וברקמה הסובבת, וזוהי התמונה הממוזגת המראה קו-לוקליזציה של הסמנים 3G8 ו-4A6 בכליות. לפני ביצוע הליך זה, חשוב להכיר את עובר ה-xenopus בשלביו המוקדמים.פעולה זו תאפשר לכם לבצע מיקוד מדויק של מיקרו-הזרקות באמצעות מפת ה-fade המקובלת של ה-xenopus. לאחר שבישלתם את הטכניקה, ניתן להתאימה למיקוד ברקמות אחרות, כגון צינור העצבים או הלב.

technique-to-target-microinjection-to-the-developing-xenopus-kidney

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

כאן אנו מדגימים microinjection cytoplasmic...

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

Microinjection היא שיטה מבוססת ויעילה החדרת חומרים זרים לתוך עוברי דג הזברה מופרית. כאן, אנו להפגין טכניקה microinjection חזקים לביצוע overexpression mRNA, ואת הגן morpholino oligonucleotide מציאה מחקרים דג הזברה.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

תרבויות Explant עצביות מן<em&gt; Xenopus laevis</em

סרטון זה מתאר טכניקה של מיקרו-הזרקה של עוברים כדי להעביר תרכובות לתוך שק החלמון של דג הזברה.

מיקרו-הזרקה עוברית: טכניקה להעברת תרכובת לחלמון דג הזברה

סרטון זה מדגים מיקרו-הזרקה תוך ורידית של נפרוטוקסינים לווריד הזנב של עובר דג זברה כדי לחקור את ההשפעות הכימיות שלהם על תפקוד הכליות.

מיקרו-הזרקה תוך ורידית של נפרוטוקסינים לעובר דג זברה: טכניקה להעברת חומרים נפרוטוקסיים לזרם הדם של עובר דג זברה

שיטות המייצרות עוברי morphant חיוניות ללמוד מנגנוני התפתחות ורשתות רגולציה גן. כוכב הים Patiria miniata הוא מערכת מודל מתעורר ללימודים אלה. כאן אנו מציגים פרוטוקול לקבלת תאי רבייה, בהפקת תרבויות של עוברים, וmicroinjection המהיר של zygotes ממין זה.

שיטה לMicroinjection של Minata Patiria Zygotes

כתב היד כאן מספקת מערכת פשוטה של שיטות לניתוח ההפרשה ודיפוזיה של ligands מתויג fluorescently ב Xenopus. זה מספק הקשר לבדיקת היכולת של חלבונים אחרים לשנות הפצת יגנד ומאפשר ניסויים שעשויות לתת תובנה מנגנוני ויסות הדרגתיים מורפוגן.

באמצעות ניתוח של Confocal<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; לחקירת מאפננים של עירובים מורפוגן Wnt וששש

פציעות כליות הנגרמות nephrotoxins, הכולל תרופות החל אנטיביוטיקה כימותרפיות, שיכולות לגרום להפרעות מורכבות בפתוגנזה ששרידיו מובנים. פרוטוקול זה מדגים כיצד דג הזברה יכול לשמש בסיס לפיתוח מודלים למחלות של תנאים אלה, אשר יכול להיות מיושם על זיהוי של צעדים renoprotective.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

מתוארים נהלים אופטימליים לבידוד זקיקים בודדים, מיקרו-הזרקות RNA ציטופלזמיות, הסרת שכבות התאים הסובבות וביטוי חלבון בביציות Xenopus. בנוסף, מוצגת שיטה פשוטה לשינויי תמיסה מהירים בניסויים אלקטרופיזיולוגיים עם תעלות יונים מגודרות ליגנד.

Xenopus ביציות: שיטות אופטימיזציה עבור Microinjection, הסרת שכבות ניידות זקיקים, ושינויי פתרון מהירים בניסויי אלקטרו

פרוטוקול זה מדגים שיטה מבוססת הקרינה לדמיין את כלי הדם וכדי לכמת את המורכבות שלה tropis Xenopus . כלי הדם ניתן הדמיה דקות לאחר הזרקת צבע פלואורסצנטי לתוך הלב הפועם של עובר לאחר מניפולציות גנטיות ו / או תרופתי ללמוד התפתחות הלב וכלי הדם in vivo .

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד להחדיר מיקרוקל DNA/dotap תערובת לתוך eyebuds של יום אחד xenopus זריזה העוברים, וכיצד התמונה ולשחזר חלבון פלורסנט בודדים ירוק (gfp) המבטא האופטית סיבי סוכת ב tectal מידות של . שלמים וחיים של...

הזרקת דנ א לתוך eyebuds ב xenopus זריזה העוברים והדמיה של gfp המבטא האופטי axonal הביע בשלמותו, חי xenopus tadpoles

למד טכניקת מיקרו-הזרקה מכוונת לכליה המתפתחת ב-Xenopus laevis. שיטה זו מאפשרת חקר תהליכי התפתחות כליה וזיהוי גנים מרכזיים בתהליך זה בביולוגיה התפתחותית.

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח

גלה סרטונים נוספים