encapsulating ציטוכרום

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להכמיס cytochrome c בתוך סול-ג'לים של Silical. עיבוד של ג'לים אלו בתנאי על-קריטיות כדי ליצור ביו-אארוג'לים, ושימוש בביו-אארוג'לים אלו לזיהוי מהיר של nitric oxide באמצעות תגובה בשלב הגז. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי החישה הביולוגית והאנליזה הביולוגית, כגון אילו תנאים נחוצים כדי ש-cytochrome c יישאר פעיל כאשר הוא מוכמס בתוך אארוג'ל בעל נקבוביות גבוהה?

החשיבות של טכניקה זו טמונה בכך שהיא מהווה הליך פשוט לכלילה של חלבון במטריצה שבה חלבונים לא נכללו לעיתים קרובות בהצלחה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי cytochrome c, היא עשויה להוביל גם לפיתוחים פרוצדורליים לכלילה של חלבונים אחרים בארוגלים, בעלי חשיבות פוטנציאלית עבור מכשירים ביו-אנליטיים עתידיים. הכין תמיסה עם ריכוז Cytochrome c בטווח של 0.7 עד millimolar.

בנוסף לתמיסה מדוללת של cytochrome c בריכוז 0.105 millimolar, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, סמנו כלי פלסטיק חד-פעמי מפוליפרופילן בנפח 50 milliliter, כוס A. הניחו את הכוס על כף של מאזניים אנליטיים, והשתמשו בפיפט פסטור מזכוכית כדי להוסיף 1.88 grams של tetra methoxy silane לכוס. אפסו את המאזניים.

לאחר מכן, העבירו בפיפטה 2.88 grams של methanol לכלי כימי A. כסו את כלי כימי A ב-parafilm. לאחר מכן, הוסיפו מגנט Stir bar לכלי כימי חד-פעמי מ-polypropylene בנפח 50 milliliter המסומן ככלי כימי B, והניחו אותו על כף של מאזנ אנליטי. השתמשו בפיפטת זכוכית כדי להוסיף 0.75 grams של מים, ו-3.00 grams של methanol לפני כיסוי כלי כימי B ב-parafilm.

התחילו לערבב את התוכן של כלי ביקר B על לוח ערבוב בתוך מ 빠르게. לאחר מכן, השתמשו במזרק כדי להחדיר 5 µL של תמיסת ammonium hydroxide בריכוז 28.0% עד 30.0% דרך כיסוי ה-parafilm אל תוך התערובת תוך כדי ערבוב. מיד עם השלמת שלב זה, הוסיפו את התוכן של כלי ביקר A אל כלי ביקר B. ערבבו את התערובת במשך 20 דקות כאשר היא מכוסה ב-parafilm.

בזמן שמרכיבי תמיסת הסול של הסיליקה מעורבבים, הכינו שמונה עד תשעה מבחנות סנקיליציה מפוליפרופילן ומכסים תואמים. כסו את קצה המכסה של המבחנה בניילון נצמד כדי ליצור משטח שטוח עליו ייווצר הג'ל, והניחו את המכסה מעליו.

יש לוודא שנייר הניילון נשאר שלם בתוך הפקק. סדרו את המבחנות כאשר הפקק פונה כלפי מטה על גבי משטח העבודה והחלקים התחתונים הפתוחים פונים כלפי מעלה. לאחר מכן, גזרו חתיכות של Parafilm שישמשו לכיסוי של כל מבחנה.

עם השלמת ערבוב הסול, העבירו 3 milliliters של תערובת הסול לכלי כימי חד-פעמי ונקי מ-polypropylene בנפח 50 milliliter. בעזרת פסטורית זכוכית, טפטפו באיטיות רבה 500 microliters של תמיסת cytochrome c מדוללת בריכוז 0.105 millimolar לאורך דופן הכלי אל תוך 3 milliliter של תערובת הסול, בפרק זמן של כדקה אחת. הקפידו לערבב את התערובת בעדינות באמצעות סיבוב בזמן הוספת ה-cytochrome c כדי למנוע היווצרות גושים אדומים גדולים.

העבירו באמצעות פיפט 0.5 milliliters של תמיסת הסול של הסיליקה והציטוכרום c שהתקבלה לתוך כל תבנית שהוכנה. כמו כן, העבירו באמצעות פיפט 0.5 milliliters של תמיסת הסול של הסיליקה הפשוטה שנותרה לתוך תבנית אחת או שתיים, כדי שישמשו כדגימות ביקורת במהלך תהליך הייבוש העל-קריטי. כסו את פתחי התבניות הפונים כלפי מעלה ב-parafilm, והניחו במקרר למשך לילה, או למשך 12 שעות לפחות, כדי להפיק סול-ג'לים.

הוציאו את התבניות מהמקרר. הסירו את ה-parafilm מהחלק העליון של תבנית אחת המכילה sol gel של cytochrome c, וכן הסירו את הפקק ואת ניילון המגן מהחלק התחתון. לאחר הוספת מעט ethanol מבקבוק שטיפה לתוך התבנית, השתמשו בקצה הדיסקה העגול של בוכנת מזרק כדי לדחוף בזהירות את הג'ל מתוך התבנית ואל תוך מבחנה מזכוכית (scintillation vial) נקייה בנפח 20 milliliter המכילה כ-5 milliliters של ethanol.

חזור על הליך הסרת הג'ל עד שכל ג'לי ה-cytochrome c יתווספו למבחנה, וכל ג'לי הסיליקה יתווספו למבחנה נפרדת. לאחר מכן, מלא את המבחנות עד למעלה באתנול. סגור את הפקקים ושמור בטמפרטורה של בין 2 ל-8 degrees celsius.

בכל ארבע שעות במהלך היום, הוצא את הג'לים מהמקרר. שפוך את האתנול מהג'לים והחלף אותו באתנול טרי. במשך שלושה ימים נוספים, השקע את ג'לי הסול הרטובים באצטון, תוך שפיכה והוספה של אצטון טרי שלוש פעמים ביום.

קררו מכשיר לייבוש בנקודה קריטית ל-10 degrees celsius, על ידי הגדרת הטמפרטורה של סירקולטור המחובר אליו ל-8 degrees celsius. לאחר שהמכשיר הגיע ל-10 degrees celsius, בצעו בדיקת דליפה למכשיר כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר שווידאתם שהמכשיר אינו דולף, שפכו בזהירות את הג'לים הרטובים מבקבוקי הסצינתיליציה, יחד עם רוב האצטון, אל שלושת החלקים הארוכים של סירת ההעברה.

הוסיפו עוד אצטון במידה ונדרש, כדי להבטיח שכל הג'לים טבולים לחלוטין באצטון לפני איטום המכל (boat) בתוך המכשיר. פתחו את שסתום המילוי של המכשיר כדי להוסיף פחמן דו-חמצני. לאחר שניתן להבחין בפחמן הדו-חמצני שוקע לתחתית המכשיר דרך חלון התצפית, פתחו את שסתום הניקוז כדי לשחרר אצטון למשך חמש דקות.

חדירת האצטון לתחתית תתרחש לפני שהמכשיר יתמלא לחלוטין בפחמן דו-חמצני. לכן, השאירו את שסתום המילוי פתוח במהלך הניקוז כדי שהמכשיר ימשיך להתמלא. לאחר מכן, סגרו את שסתום הניקוז.

השאירו את שסתום המילוי פתוח מעט. בתחילה, התערובת שמתנקזת מכילה מים, מכיוון שהאצטון אינו אנहाइडרמי. קיימת אפשרות להיווצרות קיפאון, סתימה ועליית לחץ בצינור הניקוז.

אם מזוהה סתימה, סגרו את שסתום הניקוז עד להמסת הסתימה. לאחר חמש דקות, פתחו את שסתום הניקוז למשך חמש דקות נוספות וכווןנו את שסתום המילוי כך שיהיה פתוח מספיק כדי שהמכשיר יישאר מלא לאורך כל זמן הניקוז. לאחר חמש דקות, סגרו את שסתום הניקוז והשאירו את שסתום המילוי פתוח מעט.

לאחר מכן, חזור על שלב ניקוז זה פעם נוספת, לאחר חמש דקות. עם סיום שלבי הניקוז, סגור את שסתום המילוי ונקז את הפחמן הדו-חמצני הנוזלי, כך שהמפלס יישאר גלוי ממש מעל השיניים של הסירה דרך חלון המכשיר. לאחר מכן, הגדר את הטמפרטורה של המעגל המחובר למכשיר ל-40 degrees celsius כדי להבטיח שהפחמן הדו-חמצני הנוזלי יעלה מעל הטמפרטורה והלחץ הקריטיים שלו.

לאחר כ-15 דקות, צפו במעבר מנוזל לנוזל על-קריטי דרך חלון המכשיר, כאשר המניסקוס של הנוזל מעל שיני הסירה נעלם. לאחר זמן שיווי משקל של 15 דקות לפחות, פתחו מעט את שסתום השחרור כדי להתחיל בשחרור הנוזל העל-קריטי. במהלך כ-45 דקות, המשיכו לפתוח את שסתום השחרור בהדרגה ובצורה רחבה יותר, כך שניתן יהיה לשמוע רשרוש קבוע אך חלש מאוד של הנוזל המשוחרר, ועד שניתן יהיה להבחין במד הלחץ יורד לאט עד לאפס.

לאחר שהלחץ במכשיר יירד לאפס, פתח את דלת המכשיר. הוצא את סירת הדגימה, והשתמש בפינצטה כדי להעביר את האירוגלים שייבשו acabado לבקבוקוני סצינפילציה מזכוכית נקייה.

אירוגלי הסיליקה עם הציטוכרום c מוכנים כעת לשימוש לצורך זיהוי נוכחות של גז תחמוצת החנקן, לאחר האפיון המתואר בפרוטוקול הכתוב. מוצגים כאן אירוגלים המכילים 15 µM ציטוכרום c בבופר פוטסיום פוספט בריכוזים של 4.4 mM, 40 mM ו-70 mM, בהשוואה למטבע של דיים. מוצגים כאן ספקטרה מייצגת של ציטוכרום c בבופר בהשוואה לציטוכרום c המגולמאים באירוגלים תחת תנאים שונים.

שיא הסורט (soret peak) של הציטוכרום c באורך גל של 409 ננומטר נותר ללא שינוי מהותי בתוך אירוגלים, ומראה הסטה אדומה מאפיינת כאשר הביואירוגלים נחשפים לתחמוצת חנקן (nitric oxide) בשלב הגז. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו מסנתזים סול-ג'לים של סיליקה, מקפסיליים ציטוכרום c לתוך סול-ג'לים אלה, ומייבשים סול-ג'לים מורכבים אלו לאירוגלים. מידע נוסף ניתן למצוא בפרוטוקול הטקסט העוסק באפיון הביואירוגלים ובשימוש בהם לזיהוי תחמוצת חנקן בשלב הגז.