מזין ללא גזירת "מלנוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנוש

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להבדיל תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים למלנוציטים בוגרים בעלי פיגמנטציה מלאה. שיטה זו יכולה לסייע בזיהוי גורמים מרכזיים במהלך התפתחות המלנוציטים. בנוסף, פרוטוקול זה יאפשר לנו לזהות גורמים שהשתבשו במהלך התפתחות מחלה, וכן לסרוק תרופות חשובות ובמסגרת גילוי תרופות.

היתרון המרכזי של פרוטוקול זה הוא שהוא מאפשר לנו להפיק מספרים גדולים של מלנוציטים בעלי פיגמנטציה מלאה. זאת בעוד שבידוד מלנוציטים מחולים מביא בדרך כלל למספר תאים מועט יחסית. לאחר חלוקה למנות והקפאה של חלבון ג'לטיני, הפשיר והשעה מנה של 1 מיליליטר ב-19 מיליליטר של DMEM f12.

לאחר מכן, העבירו חמישה milliliters של תערובת זו לצלח תרבית רקמה בודד בקוטר 10 סנטימטרים. לאחר הכנת מספר צלחות דומות, הדגירו אותן למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. כעת, התחילו בהכנת צלחות מצופות ב-PO, laminin ו-fibronectin על ידי הוספת PBS המכיל 15 micrograms ל-milliliter של PO לצלח תרבית.

לאחר מכן, הדגרי את הצלחות למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C בתוך אינקובטור לח. לאחר מכן, שאבי את התמיסה ושטפי את הצלחות שלוש פעמים ב-1X PBS. המשיכי את תהליך הציפוי על ידי הוספת 10 milliliters של PBS המכיל 1 µg/mL של mouse laminin 1 ו-2 µg/mL של fibronectin.

לאחר מכן, דגרו את הצלחות כפי שתואר בעבר. ראשית, הוסיפו 0.1% gelatin ב-PBS לצלחת בעלת קוטר של 10 סנטימטרים. השאירו אותה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

בזמן ציפוי הפלטה, הניחו פיברובלסטים עובריים של עכבר קפואים (MEFs) במקלח מים בטמפרטורה של 37 °C להפשרה מהירה. לאחר מכן, שאבו את הג'לטין מהצלחת והעבירו את ה-MEFs בצפיפות של כ-50,000 תאים לסנטימטר רבוע לתוך DMEM המועשר ב-10% fetal bovine serum. לאחר דגירה של הצלחת למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C, שאבו את המצע ושטפו את פלטת ה-MEF המוכנה עם 1X PBS.

הוסיפו 10 milliliters של מצע hESC שהוכן מראש ומכיל תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs), לצלחת של 10 centimeter. לאחר זריעת התאים בצפיפות של 5 מיליון תאים לצלחת, הדגרירו את הצלחתיות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ובריכוז של five percent carbon dioxide. המשיכו להזין את התאים מדי יום ב-10 milliliters של מצע hESC טרי.

לפני תחילת הדיפרנציאציה, יש לבחון את הפלטה לאיתור מושבות שנראה כי הן מכילות תאים מובחנים, גבולות לא סדירים או מרכזים שקופים. תחת מיקרוסקופ דיסקסינג בתוך מ 크게 מזרם למינרי, יש להסיר מכנית מושבות לא סדירות כאלה באמצעות פיפטה. לצורך ביצוע ציפוי בחלבון ג'לטיני כגון Matrigel, יש תחילה לחלק את החלבון לאליקוטים ולהקפיאו בחלקים של מיליליטר אחד, כדי למנוע מחזורי הקפאה והפשרה חוזרים.

לאחר מכן, הפשיר והשהה מחדש אליקוט קפוא של 1 ml ב-19 ml של DMEM f12. העבר 5 ml מתערובת זו לצלחת בקוטר 10 ס"מ והדגר את הצלחות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (RT). לאחר מכן, שאב את החלבון הג'לטיני מיד לפני זריעת התאים ושטוף עם DMEM F12. בעוד הצלחת עוברת ציפוי, בחר צלחת שבה ה-hPSCs נמצאים בבקיעה (confluency) של כ-80%.

שאבו את המצע של ה-hESC. לאחר מכן, שטפו את התאים ב-PBS. לאחר הסרת ה-PBS, הוסיפו לצלחית שלוש מיליליטר של 0.05%trypsin-EDTA.

יש לנער את הצלחת בעוצמה ובצורה אופקית במשך שתי דקות, עד שניתן להבחין תחת מיקרוסקופ שה-MEFs מתחילים להינתק כתאים בודדים. במהלך זמן זה, צפויות מושבות ה-hPSC להישאר צמודות לצלחת. יש לשאוב את ה-trypsin לאחר שה-MEFs נתקו, אך לפני שמושבות ה-hPSC נפרדו מהמצע.

לאחר מכן, הוסיפו לצלחת 10 milliliters של מצע hESC המכיל 10 micromolar של Y-27632 dihydrochloride, מעכב ROCK. לאחר מכן,נתקו את התאים על ידי פיפוט מעלה ומטה מעל המושבות. לאחר מכן, החזירו אותם לצלוחית עם חלבון ג'לטין ושאבו את התמיסה.

שטפו את הכלי ב-DMEM f12 כדי להסיר גושים. לאחר מכן, זרעו לתוכו hPSCs ביחס של 1 ל-2. לאחר מכן, הוסיפו לצלחת מצע hESC המכיל 10 micromolar Y-27632 dihydrochloride עד לנפח של 10 milliliters.

דגרו את התאים ב-37 °C למשך הלילה. האכילו את התאים מדי יום במדיום המועשר במעכב ROCK. כאשר ה-hPSCs מגיעים ל-80% confluency, התחילו בתהליך הדיפרנציאציה העצבית והגדירו נקודת זמן זו כיום 0.

כדי להתחיל את הדיפרנציאציה, האכילו את התאים ביום 0 וביום 1 עם 10 milliliters של KSR differentiation המכיל 100 nanomolar של LDN-193189, מעכב MP, ו-10 micromolar של SB 431542, מעכב של activin ו-Nodal. המשיכו ביום 2 על ידי החלפת המצע במצע המכיל את אותם ריכוזים של BNP ומעכבי activin ו-Nodal, בתוספת של three micromolar של CHIR99021, אגוניסט של Wnt. לאחר מכן, ביום 3, האכילו את התאים במצע KSR differentiation, בתוספת של 10 micromolar של SB 431542 בלבד ו-three micromolar של CHIR99021.

לאחר הכנת תערובת של 75% מצע בידוד KSR ו-25% מצע בידוד N2 המכילה גם 3 µM של Wnt Agonist, יש להזין את התאים ב-15 ml מנוזל זה ביום 4 וביום 5. לאחר מכן, בימים 6 ו-7, יש להזין את התאים ב-15 ml של מצע המורכב מ-50% מצע בידוד KSR ו-50% מצע בידוד N2, אשר הועשרו בנוסף ב-3 µM CHIR99021, ב-25 ng/mL BMP4 וב-100 nM EDN3.

לאחר מכן, בימים 8 ו-9, האכילו את התאים ב-20 milliliters של מצע דיפרנציאציה המורכב מ-25%KSR ו-75%N2, בתוספת של אותן ריכוזים של גורמים ששימשו בימים 6 ו-7. המשיכו בדיפרנציאציה עצבית ביום 10 על ידי האכלת התאים ב-20 milliliters של מצע דיפרנציאציה N2 המכיל three micromolar CHIR99021, 25 nanograms per milliliter BMP4 ו-100 nanomolar EDN3. ביום 11, שאבו את התמיסה מצלחות שצופו מראש ב-PO laminin 1 ובפיברונקטין.

לאחר מכן, השאירו את הצלחות ללא מכסה במCב תרביות רקמה למשך כ-10 עד 15 דקות, כדי לאפשר להן להתייבש לחלוטין. המשיכו בהסרת המצע מהתאים מיום 11 ושטפו אותם ב-PBS. לאחר מכן, הוסיפו ארבעה מיליליטר של תמיסה לניתוק תאים לצלח והדגירו אותו בטמפרטורה של 37 °C למשך 25 דקות.

לאחר הדגירה, הוסיפו למנה חמישה מיליליטר של מצע מלא למלנוציטים. השביו את התאים על ידי פיפוט ידני למעלה ולמטה עד להסרתם מהפלטה. העבירו את התו suspension למבחנה של 15 מיליליטר וסובבו את התאים בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-200 Gs. לאחר ספירת התאים באמצעות שיטת הדחת Trypan Blue והמוציטומטר, השביו אותם במצע מלא למלנוציטים בריכוז של 2X10⁶ תאים למיליליטר.

טפטפו נשירים של 10 µL מתרחיף התאים על הצלחות המצופות והמיובשות. ודאו שהנשירים קרובים זה לזה אך אינם נוגעים, בעלי קצוות מוגדרים היטב ואינם נשפכים. כדי לאפשר לתאים להיקשר, השאירו את הנשירים בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 20 דקות.

לאחר מכן, הוסיפו באיטיות 10 milliliters של מצע מלא למלנוציטים (full melanocyte medium) לצלוחית, תוך הקפדה שלא להפריע לתאים ההיצמדים. לאחר מכן, העבירו את הצלוחית לאינקובטור. האכילו את התאים כל יומיים עד שלושה ימים באמצעות מצע מלא למלנוציטים (full melanocyte medium).

ומצפים להבחין בפיגמנטציה בצברי תאים עד סוף השבוע הראשון. אחת לשבוע, העבירו את התאים (passage) על ידי שילובם ראשית עם תמיסס לפירוק תאים כפי שתואר קודם לכן. לאחר איסוף וסנטריפוגציה של התאים, שטפו אותם פעמיים במצע neurobasal נקי.

לאחר מכן, יש לזרוע מחדש את התאים ביחס של אחת לשש במצע מלא למלנוציטים בצלחות מצופות PO, lamanin 1 ופיברונקטין. לאחר כ-30 ימי התמיינות, התאים ייראו בעלי פיגמנטציה עמוקה. ניתן להבחין בכך בקלות כאשר הם נזרעים בצפיפות גבוהה או כאשר הם נאספים כמשקע בעת מעבר.

כאן מוצגת תמונת שדה בהיר (bright field) של תאים משורת תאי גזע עובריים אנושיים טרנסגנית psox10 GFP, שגודלו עד היום ה-11 של פרוטוקול ההבדלה המתואר, לפני זריעת התאים מחדש. בתרביות אלו ניתן להבחין ברכסים כהים ומוגדרים של תאים. כאשר תרבויות אלו נבחנו לאיתור אות GFP, נמצא כי הרכסים הכהים עשירים בתאים חיוביים ל-sox10.

מכיוון ש-sox10 הוא פקטור שעתוק המועלה על ידי תאי גזע של הרכס העצבי ונשמר במלנובלסטים, תוצאות אלו מצביעות על כך שעד ליום 11 שיטה זו של דיפרנציאציה העשירה לתאים שיולידו בסופו של דבר מלנוציטים. כראיה לכך, עד ליום 20 של הפרוטוקול הכילו התרביות מלנוציטים לא פיגמנטריים, מלנוציטים בשבילי התבגרות ומלנוציטים פיגמנטריים בוגרים לחלוטין. ביום 25, נצפים אותם סוגי תאים בתרביות.

נוכחותם של מלנוציטים בשליבי הבשלה ובעלי פיגמנטציה בתכשירים אלו מאושרת באמצעות צביעה של שני חלבונים המעורבים בייצור מלנין: TYRP2, המשמש כסמן הן למלנובלסטים והן למלנוציטים, ו-TYRP1, המהווה סמן למלנוציטים בשלב מאוחר המבוטא כאן רק במלנוציטים בעלי פיגמנטציה. לאחר השליטה בפרוטוקול זה, ניתן להשתמש בו כדי לגזור תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים למלנוציטים בוגרים בעלי פיגמנטציה מלאה בתוך 25 ימים.

הפרוטוקול מתבצע דרך התפתחות נורמלית של מלנוציטים, על ידי מעבר ראשוני דרך מצב הרכס העצבי (neural crest) וכן דרך שלב המלנובלאסטים.