מזין ללא גזירת "מלנוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנוש

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להבדיל תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים למלנוציטים בוגרים בעלי פיגמנט מלא. שיטה זו יכולה לסייע בזיהוי גורמי מפתח במהלך התפתחות מלנוציטים. בנוסף, פרוטוקול זה יאפשר לנו לזהות גורמים שהשתבשו במהלך התפתחות המחלה, כמו גם לסנן תרופות חשובות ובמהלך גילוי תרופות.

היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא מאפשר לנו לייצר מספר רב של מלנוציטים בעלי פיגמנט מלא. בעוד שבידוד מלנוציטים מחולים מביא בדרך כלל למעט תאים יחסית. לאחר ציטוט והקפאה של חלבון ג'לטיני, יש להפשיר ולהשעות מחדש אליקוט של מיליליטר אחד ב-19 מיליליטר של DMEM f12.

לאחר מכן הכניסו חמישה מיליליטר מהתערובת הזו על צלחת תרבית רקמה אחת של 10 סנטימטרים. לאחר הכנת מספר צלחות כאלה, המשך לדגור אותן למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, התחל להכין צלחות מצופות PO, למינין ופיברונקטין על ידי הוספת PBS המכיל 15 מיקרוגרם למיליליטר PO לצלחת תרבית.

לאחר מכן דגרו את הצלחות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח. לאחר מכן, שאפו את התמיסה ושטפו את הכלים שלוש פעמים עם 1X PBS. המשך בציפוי על ידי הוספת 10 מיליליטר PBS המכילים מיקרוגרם אחד למיליליטר עכבר, למינין 1 ושני מיקרוגרם למיליליטר פיברונקטין.

לאחר מכן, דגרו את הכלים כפי שתואר קודם לכן. כדי להתחיל, הוסף 0.1% ג'לטין ב- PBS לכלי של 10 סנטימטר. והשאירו אותו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

בזמן שהצלחת הזו מצופה, הניחו פיברובלסטים עובריים קפואים של עכברים, או MEFs באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס כדי להפשיר אותם במהירות. לאחר מכן, שאפו את הג'לטין מהצלחת וצלחת MEFs בצפיפות של כ-50,000 תאים לסנטימטר רבוע ב-DMEM בתוספת סרום בקר עוברי של 10 אחוז. לאחר דגירה של המנה למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס, שאפו את המדיום ושטפו את צלחת ה- MEF המוכנה עם 1X PBS.

המשך להוסיף 10 מיליליטר של מדיום hESC שהוכן בעבר המכיל תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים בקיצור hPSCs, לצלחת של 10 סנטימטרים. לאחר זריעת תאים בצפיפות של 5 מיליון תאים למנה, דגרו את הצלחות ב-37 מעלות צלזיוס בחמישה אחוזי פחמן דו חמצני. המשך להאכיל את התאים מדי יום ב -10 מיליליטר של מדיום hESC טרי.

לפני תחילת ההתמיינות, בדוק את הצלחת לאיתור מושבות שנראות מכילות תאים מובחנים, גבולות לא סדירים או מרכזים שקופים. תחת מיקרוסקופ מנתח במכסה המנוע של זרימה למינרית עקור מכנית כל מושבה לא סדירה כזו בעזרת פיפטה. כדי לבצע ציפוי בחלבון ג'לטיני כגון מטריג'ל, יש לנקוט תחילה ולהקפיא את החלבון בחלקי מיליליטר אחד על מנת למנוע מחזורי הפשרה חוזרים ונשנים.

לאחר מכן, הפשירו והשעו אליקוט קפוא של מיליליטר אחד עם 19 מיליליטר של DMEM f12. המשיכו לצלחת חמישה מיליליטר מהתערובת הזו על צלחת של 10 סנטימטר ודגרו על הכלים למשך שעה ב- RT. לאחר מכן, יש לשאוב את החלבון הג'לטיני מיד לפני ציפוי התאים ולשטוף עם DMEM F12. בזמן שהצלחת הזו מצופה, בחר צלחת שבה hPSCs נמצאים בכ-80% מפגש.

המשך לשאוף את מדיום hESC. ואז לשטוף את התאים עם PBS. לאחר הסרת ה-PBS, הוסף לצלחת שלושה מיליליטר של 0.05% טריפסין-EDTA.

המשיכו לנער במרץ את הצלחת אופקית במשך שתי דקות עד שה-MEFs נצפים במיקרוסקופ כדי להתחיל להתרומם כתאים בודדים. במהלך תקופה זו, צפו שמושבות ה-hPSC יישארו מחוברות לצלחת. המשך לשאוב את הטריפסין לאחר שה-MEFs התרוממו אך לפני שמושבות ה-hPSC התנתקו.

לאחר מכן, לצלחת, הוסף 10 מיליליטר של מדיום hESC המכיל 10 מיקרו-מולרי Y-27632 דיהידרוכלוריד מעכב ROCK. לאחר מכן נתק את התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מעל המושבות. לאחר מכן, חזרו למנה עם חלבון ג'לטיני ושאבו את התמיסה.

שטפו את המנה הזו עם DMEM f12 כדי להסיר גושים. ולתוכו לוחים hPSCs ביחס של 1 ל-2. לאחר מכן, לצלחת, הוסף מדיום hESC המכיל 10 מיקרו-מולרי Y-27632 דיהידרוכלוריד עד 10 מיליליטר.

דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הזינו את התאים מדי יום במדיום בתוספת מעכב ROCK. כאשר ה-hPSCs מגיעים למפגש של 80%, המשיכו ליזום התמיינות עצבית וייעדנו את נקודת הזמן הזו ליום 0.

כדי להתחיל בהתמיינות יש להזין את התאים ביום 0 וביום 1 ב-10 מיליליטר של התמיינות KSR המכילה 100 ננו-מולרי LDN-193189 של מעכב MP ו-10 מיקרו-מולרי SB 431542, מעכב של אקטיב ונודאל. המשך ביום השני על ידי החלפת המדיום בזה המכיל את אותם ריכוזים של BNP ומעכבי אקטיבין וצמתים בתוספת שלושה CHIR99021 מיקרו-מולרי, אגוניסט Wnt. לאחר מכן, ביום השלישי, הזינו את התאים במדיום התמיינות KSR, בתוספת 10 431542 SB מיקרומולרית בלבד ושלושה CHIR99021 מיקרו-מולרי.

לאחר הכנה תערובת של 75% מדיום דיפרנציאיון KSR ומדיום התמיינות 25% N2 המכיל גם שלושה מיקרו-מולרים של Wnt Agonist. האכילו את התאים ב -15 מיליליטר של נוזל זה ביום 4 ו -5. לאחר מכן, בימים 6 ו-7 הזינו את התאים ב-15 מיליליטר של מדיום המורכב מ-50% מדיום התמיינות KSR ו-50% מדיום התמיינות N2 שנוסף גם עם שלושה מיקרו-מולרים CHIR99021-25 ננוגרם למיליליטר BMP4 ו-100 ננו-מולרי EDN3.

לאחר מכן, בימים 8 ו-9 הזינו את התאים ב-20 מיליליטר של מדיום התמיינות של 25% KSR ו-75% מדיום התמיינות N2 בתוספת אותם ריכוזים של גורמים ששימשו בימים 6 ו-7. המשך להמשיך עם התמיינות עצבית ביום 10 על ידי הזנת התאים ב-20 מיליליטר של מדיום התמיינות N2 המכיל שלושה מיקרו-מולאריים CHIR99021-25 ננוגרם למיליליטר BMP4 ו-100 ננו-מולרי EDN3. ביום ה-11 יש לשאוב את התמיסה מכלים שצופו בעבר ב-PO lamanin 1 ופיברונקטין.

לאחר מכן השאירו את הצלחות חשופות במכסה המנוע לתרבית רקמות למשך כ-10 עד 15 דקות, ואפשרו להן להתייבש לחלוטין. המשך להסיר את המדיום מתאי יום 11 ולשטוף אותם עם PBS. לאחר מכן, הוסיפו למנה ארבעה מיליליטר של תמיסת ניתוק תאים ודגרו אותה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות.

לאחר הדגירה מוסיפים למנה חמישה מיליליטר של מדיום מלנוציט מלא. והשעיה מחדש של התאים על ידי פיפטינג ידני למעלה ולמטה עד שהם מתרוממים מהצלחת. העבירו את התרחיף לצינור של 15 מיליליטר וסובבו את התאים כלפי מטה למשך חמש דקות ב-200 Gs.לאחר ספירת תאים באמצעות Triypan Blue Exclusion והמוציטומטר, השעו אותם מחדש במדיום מלנוציטים מלא בצפיפות של 2X10 לתאים השישי למיליליטר.

צלחת 10 טיפות מיקרוליטר של מתלה התא על הכלים המיובשים והמצופים. ודא שהטיפות קרובות זו לזו אך אינן נוגעות, בעלות קצוות מוגדרים היטב ואינן פועלות. כדי לאפשר לתאים להידבק, הניחו לטיפות לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 20 דקות.

לאחר מכן, הוסיפו לאט לאט 10 מיליליטר של מדיום מלנוציט מלא לתבשיל והקפידו לא להפריע לתאים המחוברים. לאחר מכן, העבירו את המנה לחממה. האכילו את התאים כל יומיים-שלושה במדיום מלנוציטים מלא.

וצפו לצפות בפיגמנטציה באשכולות תאים עד סוף השבוע הראשון. פעם בשבוע, תאי מעבר על ידי שיוכם תחילה לתמיסת ניתוק תאים כפי שתואר קודם לכן. לאחר איסוף וצנטריפוגה התאים יש לשטוף אותם פעמיים במדיום נוירו-בסיסי רגיל.

לאחר מכן, צבחו מחדש את התאים ביחס של 1 עד 6 במדיום מלנוציטים מלא על כלים מצופים ב-PO, למנין 1 ופיברונקטין. בסביבות 30 יום של התמיינות התאים ייראו פיגמנטיים עמוקים. אשר ניתן לדמיין בקלות כאשר הוא מצופה בצפיפות גבוהה או גלולה בעת מעבר.

מוצגת כאן תמונת שדה בהירה של תאים מקו תאי גזע עובריים אנושיים טרנסגניים psox10 GFP שתורבו עד היום ה-11 של פרוטוקול ההתמיינות המתואר לפני שהתאים מצופים מחדש. בתרביות אלה ניכרים רכסים כהים ומוגדרים של תאים. כאשר תרביות אלה הוערכו לאות GFP, הרכסים הכהים הועשרו עבור תאים חיוביים ל-sox10.

מכיוון ש-sox10 הוא גורם שעתוק המווסת על ידי תאי גזע של פסגה עצבית ונשמר במלנובלסטים, תוצאות אלה מצביעות על כך שעד היום ה-11 שיטת התמיינות זו הועשרה לתאים שבסופו של דבר יובילו למלנוציטים. כראיה לכך, עד היום ה-20 של תרביות הפרוטוקול הכילו מלנוציטים פיגמנטיים ללא פיגמנטים, בוגרים ובוגרים לחלוטין. ביום ה-25 נצפים אותם סוגי תאים בתרביות.

נוכחותם של מלנוציטים מתבגרים ופיגמנטיים בתכשירים אלה מאושרת באמצעות צביעה בשני חלבונים לייצור מלנין. TYRP2, המשמש כסמן הן של מלנובלסטים והן של מלנוציטים ו-TYRP1 שהוא סמן מלנוציטים בשלב מאוחר המתבטא כאן רק במלנוציטים פיגמנטיים. לאחר השליטה, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי להבדיל תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים למלנוציטים בוגרים בעלי פיגמנט מלא תוך 25 יום.

הפרוטוקול ממשיך דרך התפתחות מלנוציטים רגילה על ידי התקדמות תחילה דרך מצב הפסגה העצבית וכן שלב המלנובלסטים.