שליטה אופטית של חלבון עצבי באמצעות חומצות אמינו לא טבעי מקודדים גנטיים בנוירונים
28 במרץ 2016
כאן, מוצג הליך להפעלה סלקטיבית של חלבון עצבי עם פולס קצר של אור על ידי קידוד גנטי של חומצת אמינו לא טבעית תגובתית-אור לחלבון עצבי מטרה המתבטא בתאי עצב בתרבית או in vivo.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לשלוט אופטית בתפקוד של חלבון עצבי באמצעות חומצת אמינו מקודדת גנטית ולא טבעית בנוירונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי תרומתו של חלבון עצבי ספציפי לאיתות עצבי בתפקוד המוח ברזולוציה מרחבית זמנית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שיש לה פוטנציאל ליישום על חלבונים עצביים שונים כדי להשיג ויסות אופטי של תהליכים עצביים שונים.
התחל הליך זה על ידי ציפוי נוירונים בהיפוקמפוס על גבי החלקות כיסוי בצלחת של 24 בארות עם 500 מיקרוליטר של מצע גדילה, לאחר סינון דרך רשת ניילון של 40 מיקרומטר. לאחר מכן, דגרו את התרבית העצבית בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס באינקובטור של חמישה אחוזי פחמן דו חמצני, 95 אחוז לחות באוויר למשך שבועיים עד שלושה. ביום הטרנספקציה, הכינו תמיסת סידן כלוריד טרייה של 2.5 מולרית במים מזוקקים כפולים, וסננו אותה סטרילית עם מסנן של 0.22 מיקרומטר.
לאחר מכן, הכינו 2X BBS טרי ב-pH 7, וסננו אותו סטרילי עם מסנן של 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן, החלף את מצע הגידול בתרבית ב-500 מיקרוליטר של אמצעי טרנספקציה טריים ומחוממים מראש, ואל תשליך את מצע הגידול הישן. הכן את תמיסת הטרנספקציה מיד לפני הוספתה לתרבית על ידי שילוב של סידן כלורי ומים מזוקקים כפולים, תוך ערבוב איטי של הצינור.
המשיכו לערבב את הצינור והוסיפו לאט DNA לתמיסה. לאחר מכן, הוסף מאגר BBS 2X טיפה. הכנת מאגר 2X BBS היא שלב קריטי בטרנספקציה של סידן פוסופט, וכדאי לכייל את ה-pH האופטימלי עבור מאגר 2X BBS בין 6.90 ל-7.15 עבור מבני DNA חדשים או הכנה.
לאחר מכן, הוסף מיד 30 מיקרוליטר של תמיסת הטרנספקציה לכל החלקת כיסוי של תרבית העצבים. נדנדו את צלחת התרבות כמה פעמים כדי לערבב את התמיסה, ודגרו אותה בחום של 35 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות עד שעה. לאחר כשעה יש להבחין בשכבה של משקעי סידן פוספט עדינים המכסה את הנוירונים.
לאחר מכן, החלף את אמצעי ההעברה ב-500 מיקרוליטר של מאגר כביסה מחומם מראש, ודגר אותו בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס למשך 15 עד 20 דקות. משקעי הסידן פוספט צריכים להיעלם לאחר הכביסה. כעת, החלף את מאגר הכביסה ב-500 מיקרוליטר של מצע גידול טרי.
לאחר מכן, החלף את מצע הגידול במדיה המקורית שנשמרה. לאחר מכן, הוסף לתרבית חומצת אמינו לא טבעית מעורבת מראש Cmn ב-50 מיקרוליטר של מצע גידול חם, המביא לריכוז סופי של מילי-מולרית אחת. דגרו על התרבית שעברה טרנספטציה ב-35 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 48 שעות לפני ההקלטה.
בהליך זה, הכינו את הפתרונות החוץ תאיים והתוך-תאיים. במערך שלנו, נורית ה-LED עם פליטה של 385 ננומטר מותקנת ליד המיקרוסקופ כדי לספק אור למרחק של סנטימטר אחד מנקודת המוקד בזווית של 45 מעלות. לאחר מכן, משוך כמה פיפטות תיקון עם אלקטרודת זכוכית באמצעות מושך מיקרו פיפטה.
לאחר מכן, קח כיסוי תרביות נוירונים מהאינקובטור ושטוף אותו פעם אחת בתמיסה החוץ-תאית. שופע את המתקן בתמיסה חוץ-תאית. לאחר מכן, הנח את הכיסוי על פלטפורמת המיקרוסקופ האלקטרופיזיולוגי, תוך שימוש בטכניקות הידוק טלאי סטנדרטיות.
טלאי נוירון שעבר טרנספטציה עם פלואורסצנטים M-ציטרין. לאחר מכן, רשמו את הפעילות העצבית בשיטת המהדק הנוכחית. ראשית, התאם את פוטנציאל המנוחה לסביבות 72 מילי-וולט שלילי.
לאחר מכן, הזרקו זרם צעד כדי לגרום לירי רציף של פוטנציאל פעולה ב-5 עד 15 הרץ. בזמן ההקלטה, העבירו פולסי LED בודדים לנוירון ועקוב אחר השינויים בפוטנציאל הפעולה שלו. לאחר מכן, הוסף 0.5 מילי-מולרי בריום כלוריד לאמבטיה, כדי לשחזר את פוטנציאל הפעולה.
בהגדרה של פרוסת מוח חריפה, טלאי נוירון עם פלואורסצנטים M-cherry GFP מהאזור הניאו-קורטיקלי. לאחר מכן, רשום את פעילות PIRK בשיטת רמפת המתח. באופן ספציפי, עקוב אחר הזרמים הפנימיים הספציפיים של Kir2.1 ב-100 מילי-וולט שליליים.
לאחר מכן, העבירו פולסי LED בודדים לנוירון בזמן ההקלטה, ועקבו אם חלבוני PIRK מופעלים. ברגע ש-PIRK מופעל, זרמים פנימה ב-100 מילי-וולט שליליים יגדלו משמעותית. בסוף, הוסיפו 0.5 מילי-מולרי בריום כלוריד לאמבטיה, וודאו אם PIRK מושבת.
מוצגות כאן תמונות לדוגמה של תרביות עצביות בריאות בהיפוקמפוס של חולדות. ושני נוירונים בריאים המציגים גופי תאים שמנמנים ודנדריטים ואקסונים בולטים. אלו הן תמונות ה-DIC והפלואורסצנטיות של תרביות נוירונים בהיפוקמפוס של חולדות במבחנה, ועברו טרנספטציה לביטוי PIRK ללא CMN.
בנוכחות CMN מילי-מולרי אחד, נוירונים שעברו טרנספטציה מסוגלים לבטא חלבוני PIRK M-citrine באורך מלא, ובכך להראות פלואורסצנטיות ירוקה. והנה דוגמה לפולס אור יחיד, המדכא את הפעילות של נוירון היפוקמפוס מבוטא PIRK. תמונות פלורוסנטיות אלה של נוירונים בקליפת המוח העוברית של עכברים מראות את השילוב המוצלח של CMN בחלבוני GFP ו-Kir2.1 in vivo.
בגרף זה, ההפעלה התלויה באור של PIRK מסומנת בזרמים שנרשמו מהנוירונים הניאו-קורטיקליים של העכבר. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלות מוח הנגרמות על ידי תפקוד לקוי של חלבונים עצביים ספציפיים, למשל, מוטציה של Kir2.1 בתסמונת אנדרסן, מכיוון שטכניקה זו עוזרת לחשוף אילו מעגלי מוח מושפעים מליקויים ב-Kir2.1. לאחר שליטה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לשלוט בתפקוד חלבונים עצביים עם אור בספציפיות גבוהה בנוירונים חיים.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לשלב חומצות אמינו לא טבעיות בחלבונים בתאי עצב כדי להשיג בקרת צילום על חלבונים עצביים מעניינים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לבקרה אופטית על תפקודם של חלבוני נוירונים באמצעות חומצת אמינו לא טבעית, המקודדת גנטית. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לבחון את תפקידם של חלבוני נוירונים ספציפיים באותות תאיים ובתפקוד המוח ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצב
- ביולוגיה של התא
- אופטוגנטיקה
רקע
- הבנת השיגנול הנוירונלי חיונית להשגת תובנות לגבי תפקודי המוח.
- בקרה אופטית של חלבונים יכולה להגביר את הדיוק הניסויי.
- חומצות אמינו לא טבעיות המקודדות גנטית מציעות נתיבים חדשים למחקר.
- ניתן להחיל שיטה זו על חלבונים נוירונליים שונים.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול להפעלה סלקטיבית של חלבונים עצביים.
- בחינת תרומתם של חלבונים ספציפיים לאותות עצביים.
- השגת בקרה אופטית על תהליכים עצביים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- זריעת נוירונים של ההיפוקמפוס על זכוכית כיסוי (coverslips) בלוחית בעלת 24 בארות.
- דגירה של תרביות נוירונים בסביבה מבוקרת.
- טרנספקציה של נוירונים באמצעות תמיסת סידן כלוריד.
- שימוש בחומצות אמינו לא טבעיות המקודדות גנטית להפעלת חלבונים.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת בקרה אופטית מדויקת של חלבוני נוירונים.
- היא מספקת תובנות לגבי תפקידם של חלבונים ספציפיים באיתות עצבי.
- הטכניקה היא רב-גונית וניתן להחילה על חלבונים שונים.
- היא משפרת את ההבנה של תהליכים נוירונליים בתפקוד המוח.
מסקנות
- הליך זה מהווה כלי בעל ערך למחקר במדעי המוח.
- הוא פותח אפשרויות חדשות לחקר תפקודי חלבונים בנוירונים.
- יישומים עתידיים עשויים להוביל לפריצות דרך בהבנת השליחויות במוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
החדרה של חומצות אמינו לא טבעיות (Uaa) המקודדות גנטית מאפשרת בקרה אופטית מדויקת על תפקודם של חלבונים עצביים, ומספקת רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה לניתוח תפקידיהם של חלבונים באיתות עצבי. גישה זו תומכת בהסרת סיכונים מנגנוניים ובתיקוף מטרות בשלבי הגילוי המוקדמים, במיוחד עבור תעלות יונים ומטרות עצביות המעורבות בהפרעות מוחיות. הרב-גוניות של השיטה ממצבת אותה כפלטפורמה רב-פעמית לחקירה תפקודית של מחלקות חלבונים מגוונות בתיקי מו"פ של מדעי העצבים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של תפקוד חלבונים עצביים בסביבות תאיות טבעיות.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד התרומה של חלבונים ספציפיים לאיתות עצבי.
- מקל על תיקוף פונקציונלי של מטרות בדיוק אופטי וב可-הפיכות.
- מספק פלטפורמה להערכה של וריאנטים של חלבונים הרלוונטיים למחלה in situ.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות עצביות מאושרות (validated) לסריקה המשכית של מודולטורים או וריאנטים גנטיים.
- מספק קריאות אלקטרו-פיזיולוגיות כמותיות וניתנות לשחזור עם הפעלה באמצעות אור.
- מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה על ידי בקרת פעילות החלבון באמצעות טריגרים אופטיים מוגדרים.
- תומך בהתאמה ניתנת להרחבה (scalable) לחלבונים נוירונליים אחרים באמצעות Uaas פוטוריאקטיביים זמינים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם מערכות רלוונטיות למחלה על ידי אפשור בקרה אופטית in vivo בנאוקורטקס של עוברי עכברים.
- מסייע בפיתוח ביומארקרים תרגומיים על ידי קישור הפעלת חלבונים לתפוקות נוירונליות פונקציונליות.
- תומך בהתקדמות מותאמת סיכונים על ידי הבהרת ההשפעה של תפקוד לקוי של חלבונים במעגלי המוח.
- מספק ביטחון ניבוי למודלים פרה-קליניים המכוונים לחלבונים נוירונליים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משלבת שלבים החל מגילוי מוקדם ועד לתיקוף פרה-קליני, ומאפשרת בדיקת היפותזות, הפחתת סיכונים של מטרות (target de-risking) וקבלת תוצאות תפקודיות הן במערכות נוירונליות in vitro והן במערכות in vivo.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקות מונחות-היפותזה של תפקוד חלבונים ומעורבות מסלולים בשליחה עצבית.
- סריקה: מספק פלטים אלקטרופיזיולוגיים כמותיים וניתנים לשחזור לסריקת תרכובות או סריקה גנטית.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה ישירה של פוטנציאלי פעולה וזרמי יונים בתגובה להפעלה אופטית.
- מחקר תרגומי: מגשר בין מחקרי in vitro ומחקרי in vivo להמשכיות במודלים רלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה מודולרית הניתנת להתאמה למספר חלבונים עצביים ולשאלות מחקר שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף יעדים נוירונליים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של פרוטוקולי בקרה אופטית לשם שחזוריות ויכולת הרחבה (scalability) בין פרויקטים.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות מסוג go/no-go על ידי אספקת ראיות פונקציונליות למעורבות היעד ולהרלוונטיות של המסלול.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של יעדים נוירונליים מותאם סיכון ותומך בהעברת ידע בין תוכניות שונות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות נוירונליות, מניפולציה גנטית ואלקטרופיזיולוגיה.
- נחוש גישה לציוד לגירוי אופטי ולתשתית להקלטת patch-clamp.
- דורש סטנדרטיזציה בין צוותים של פרוטוקולי שילוב Uaa ואספקת אור.
- ניתן להתאמה לחלבונים נוירונליים שונים ומערכות מודל בעזרת Uaas פוטו-ריאקטיביים זמינים.
- תלוי בשליטה מדויקת בתנאי הניסוי לקבלת תוצאות הניתנות לשחזור.
