Name: שליטה אופטית של חלבון עצבי באמצעות חומצות אמינו לא טבעי מקודדים גנטיים בנוירונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: למדו שליטה אופטית בחלבונים עצביים באמצעות חומצות אמינו לא טבעיות מקודדות גנטית בנוירונים היפוקמפיים. שיטה זו מאפשרת חקר תפקידי חלבונים ספציפיים באותות עצביים עם רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר S. Szobota על הדיון המועיל על תרביית תאי עצב וטרנספקציה של Ca-P. L.W. מודה על תמיכתם של מענק החדשנות של סאלק, המכון לרפואה רגנרטיבית בקליפורניה (RN1-00577-1) והמכונים הלאומיים לבריאות (1DP2OD004744).

<ol><li>Fork, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Stimulation+of+Nerve+Cells+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia.</a> Science. 171 (3974), 907-908 (1971).</li>
<li>Callaway, E. M., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photostimulation+using+caged+glutamate+reveals+functional+circuitry+in+living+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (16), 7661-7665 (1993).</li>
<li>Cambridge, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxycycline-dependent+photoactivated+gene+expression+in+eukaryotic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Doxycycline-dependent photoactivated gene expression in eukaryotic systems.</a> Nat. Methods. 6 (7), 527-531 (2009).</li>
<li>Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+cortical+neurons+form+fine-scale+functional+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks.</a> Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).</li>
<li>Bernstein, J. G., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+tools+for+analyzing+the+neural+circuits+of+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cogn.+Sci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior.</a> Trends Cogn. Sci. 15 (12), 592-600 (2011).</li>
<li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+application+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The development and application of optogenetics.</a> Annu. Rev. Neurosci. 34 (1), 389-412 (2011).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+in+neural+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li>
<li>Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+ion+channels+for+remote+control+of+neuronal+firing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing.</a> Nat. Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).</li>
<li>Volgraf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+control+of+an+ionotropic+glutamate+receptor+with+an+optical+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch.</a> Nat. Chem. Biol. 2 (1), 47-52 (2006).</li>
<li>Szobota, S., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Optical control of neuronal activity.</a> Annu. Rev. Biophys. 39 (1), 329-348 (2010).</li>
<li>England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific%2C+photochemical+proteolysis+applied+to+ion+channels+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (20), 11025-11030 (1997).</li>
<li>England, P. M., Lester, H. A., Dougherty, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+disulfide+connectivity+using+backbone+ester+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mapping disulfide connectivity using backbone ester hydrolysis.</a> Biochemistry. 38 (43), 14409-14415 (1999).</li>
<li>Philipson, K. D., Gallivan, J. P., Brandt, G. S., Dougherty, D. A., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+caged+cysteine+and+caged+tyrosine+into+a+transmembrane+segment+of+the+nicotinic+ACh+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Incorporation of caged cysteine and caged tyrosine into a transmembrane segment of the nicotinic ACh receptor.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 281 (1), C195-C206 (2001).</li>
<li>Tong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+decaging+leads+to+substantial+membrane+trafficking+during+modulation+of+an+inward+rectifier+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tyrosine decaging leads to substantial membrane trafficking during modulation of an inward rectifier potassium channel.</a> J. Gen. Physiol. 117 (2), 103-118 (2001).</li>
<li>Liu, C. C., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+new+chemistries+to+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Adding new chemistries to the genetic code.</a> Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 413-444 (2010).</li>
<li>Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic code of Escherichia coli.</a> Science. 292 (5516), 498-500 (2001).</li>
<li>Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic code.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35 (1), 225-249 (2006).</li>
<li>Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+code+for+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic code for biological studies.</a> Chem. Biol. 16 (3), 323-336 (2009).</li>
<li>Shen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoding+unnatural+amino+acids+in+neural+stem+cells+and+optically+reporting+voltage-sensitive+domain+changes+in+differentiated+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons.</a> Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoding+unnatural+amino+acids+for+cellular+and+neuronal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies.</a> Nat. Neurosci. 10 (8), 1063-1072 (2007).</li>
<li>Kang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+expression+of+a+light-activatable+potassium+channel+using+unnatural+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo expression of a light-activatable potassium channel using unnatural amino acids.</a> Neuron. 80 (2), 358-370 (2013).</li>
<li>Bichet, D., Haass, F. A., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+functional+studies+with+structures+of+inward-rectifier+K%28%2B%29+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Merging functional studies with structures of inward-rectifier K(+) channels.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 957-967 (2003).</li>
<li>Burrone, J., O'Byrne, M., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forms+of+synaptic+plasticity+triggered+by+selective+suppression+of+activity+in+individual+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiple forms of synaptic plasticity triggered by selective suppression of activity in individual neurons.</a> Nature. 420 (6914), 414-418 (2002).</li>
<li>Johns, D. C., Marx, R., Mains, R. E., O'Rourke, B., Marban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+genetic+suppression+of+neuronal+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inducible genetic suppression of neuronal excitability.</a> J. Neurosci. 19 (5), 1691-1697 (1999).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular Cloning: A laboratory manual</a>. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).</li>
<li>Beaudoin, G. M. III, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+pyramidal+neurons+from+the+early+postnatal+mouse+hippocampus+and+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex.</a> Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).</li>
<li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMolleman%2C+A+%22Patch+Clamping%3A+An+Introductory+Guide+To+Patch+Clamp+Electrophysiology%22">Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. (2003).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e239(2007).</li>
<li>Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+protein+phosphorylation+with+a+genetically+encoded+photocaged+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid.</a> Nat. Chem. Biol. 3 (12), 769-772 (2007).</li>
<li>Coin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+chemical+probes+in+cells+reveal+the+binding+path+of+urocortin-I+to+CRF+class+B+GPCR%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR.</a> Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).</li>
<li>Takimoto, J. K., Xiang, Z., Kang, J. Y., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esterification+of+an+unnatural+amino+acid+structurally+deviating+from+canonical+amino+acids+promotes+its+uptake+and+incorporation+into+proteins+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Esterification of an unnatural amino acid structurally deviating from canonical amino acids promotes its uptake and incorporation into proteins in mammalian cells.</a> Chembiochem. 11 (16), 2268-2272 (2010).</li>
<li>Parrish, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+Genetic+Code+of+Caenorhabditis+elegans+Using+Bacterial+Aminoacyl-tRNA+Synthetase%2FtRNA+Pairs%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Expanding the Genetic Code of Caenorhabditis elegans Using Bacterial Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Pairs.</a> ACS Chem. Biol. 7 (7), 1292-1302 (2012).</li>
<li>Lu, H., Klaassen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+distribution+and+thyroid+hormone+regulation+of+Pept1+and+Pept2+mRNA+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Tissue distribution and thyroid hormone regulation of Pept1 and Pept2 mRNA in rodents.</a> Peptides. 27 (4), 850-857 (2006).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li>
<li>Plaster, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Kir2.1+cause+the+developmental+and+episodic+electrical+phenotypes+of+Andersen%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mutations in Kir2.1 cause the developmental and episodic electrical phenotypes of Andersen's syndrome.</a> Cell. 105 (4), 511-519 (2001).</li>
<li>Priori, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+form+of+short+QT+syndrome+%28SQT3%29+is+caused+by+a+mutation+in+the+KCNJ2+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">A novel form of short QT syndrome (SQT3) is caused by a mutation in the KCNJ2 gene.</a> Circ. Res. 96 (7), 800-807 (2005).</li>
<li>Beene, D. L., Dougherty, D. A., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+mapping+ion+channel+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Unnatural amino acid mutagenesis in mapping ion channel function.</a> Curr Opin Neurobiol. 13 (3), 264-270 (2003).</li>
<li>Hoppmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoding+photoswitchable+click+amino+acids+in+Escherichia+coli+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Genetically encoding photoswitchable click amino acids in Escherichia coli and mammalian cells.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).</li>
<li>Hoppmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Formation+of+an+Azo+Bridge+on+Proteins+Controllable+by+Visible+Light%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">In Situ Formation of an Azo Bridge on Proteins Controllable by Visible Light.</a> J Am Chem Soc. 137 (35), 11218-11221 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כדי להשיג צילום אפנון יעיל, השלב הראשוני החשוב הוא להחליט היכן לשלב את UAA photoresponsive ב חלבון המטרה. מידע מבני ותפקודי של חלבון המטרה מאוד עוזר להנחות את הבחירה של אתרי מועמדים. במקביל, לעניין תקנת אור היה לקבוע איזה אתר הוא מתאים ביותר. לאחר בחירת אתרי מועמדים, אנו ממליצים לבדוק באתרים בשורות תא יונקים כגון הכליה העוברית האנושי (HEK) תאים לתרבות ומניפולציה קלות, לפני שתמשיך הנוירונים עיקריים in vivo. כדי לזהות אתר עבור photoactivation Kir2.1 מספר אתרים לאורך הנקבובי...

לעומת גירוי חשמלי קונבנציונלי, photostimulation מציעה רזולוציה של זמן ומרחב גדול עם הפרעה מינימאלית למערכת הפיזיולוגית של דגימות. מאז ההפגנה של שימוש בלייזר כדי לעורר נוירונים ב -1971 1, בדרכים יצירתיות רבות הומצאו אקסוגני לשלוט הפעילות העצבית עם אור. שחרור אופטי של אגוניסטים photocaged כבר זמן רב בשימוש ללמוד תגובה פיזיולוגית של הרשת העצבית הליגנדים 2,3,4. טכניקה זו הגבילה סגולית עקב דיפוזיה של אגוניסטים בכלוב. סגולי גנטי מושגת ectopically ידי ערוצי opsin רגיש לאור בעת ומשאבות 5,6,7, וזה יושם בהצלחה לווסת רשתות נוירונים שנבחרו אורגניזמים מודל מגוונים. עם זאת, זה יהיה קשה ליישם את השיטה לשלוט אופטי שונים חלבונים עצביים אחרים, מאז השתלת photoresponsiveness מן החלבונים opsin לחלבונים אחרים would דורש הנדסה אינטנסיבית שעשויות לשנות את התכונות הטבעיות של החלבון נחקר. מבחינת כימית קשירה ליגנד רגיש אקסוגניים לחלבון הוכיח דרך נוספת לשלוט על הפונקציונליות של חלבוני ערוץ 8,9,10. ליגנד מוצג או ממדפי אתר הקישור של החלבון דרך photoisomerization של מחצית azobenzene. כימית קשירה מגבילה את היישום בעיקר לצד תאיים של חלבונים בממברנה, למעט הצד התאי וחלבונים תאיים. Photoresponsive Uaas, לאחר שולבו חלבונים, לספק אסטרטגיה כללית לתמרן חלבונים עם אור. ב המאמצים המוקדמים, tRNAs acylated כימית עם Uaas photocaged היו microinjected לתוך ביציות Xenopus לשלב את Uaas לתוך קולטנים הממברנה תעלות יונים 11, אשר קידמו את ההבנה של יחסי מבנה-תפקידם 12,13,14.גישת microinjection זה מתמצה בעיקר ביציות גדולות. התאגדות גנטית של UAA עוקפת את acylation ו microinjection מאתגר מבחינה הטכנית tRNA באמצעות זוג מאונך tRNA / synthetase, אשר משלב את UAA באמצעות תרגום חלבון אנדוגני בתאי חי 15,16,17,18. UAA התאגדות לחלבונים עצביים הודגמה הנוירונים עיקריים ותאי גזע עצביים 19,20. לאחרונה, photoresponsive UAA כבר שולב גנטי לתוך חלבון עצבי במוח יונקי in vivo בפעם הראשונה 21. התקדמות אלה מאפשרים ללמוד חלבונים עצביים עם Uaas בסביבת הסלולר מולדתם. כלפי פנים Kir2.1 ערוץ אשלגן לתיקון הוא מיישר חזק שעובר K + זרמים יותר בקלות לתוך מאשר מחוץ לתא, והוא חיוני בוויסות תהליכים פיזיולוגיים כולל רגישות התא, הטון של כלי הדם, קצב הלב, מחדשזרימת מלח סופית ואינסולין לשחרר 22. התבטאות יתר של Kir2.1 hyperpolarizes פוטנציאל הממברנה של הנוירון היעד, אשר הופך להיות פחות 23,24 להתרגש. כדי לשלוט Kir2.1 אופטית בתאים המקוריים שלו, קאנג et al. מאוגד גנטי תמונת מגיבי UAA לתוך Kir2.1 לידי הביטוי בתאי יונקים, נוירונים מוח עכבר עוברי 21. דופק קצר של אור הצליח להמיר את UAA לתוך חומצה אמינית טבעית Cys, ובכך הפעלת חלבון Kir2.1 היעד. כאשר אשלגן צילום מושרה זה לתיקון כלפי פנים (PIRK) חלבון ערוץ התבטא הנוירונים עיקריים בהיפוקמפוס עכברוש, הוא הדחיק ירי עצבי בתגובת הפעלת אור. בנוסף, ערוץ PIRK התבטא הניאוקורטקס העכבר העוברי, וזרם האור מופעל PIRK ב נוירונים בקליפת המוח נמדד. היישום המוצלח של טכנולוגית UAA in vivo במוח היונקים פותח את הדלת כדי לשלוט אופטי חלבונים עצבייםבסביבה האם שלהם, אשר תאפשר לנתיחה אופטית של תהליכים ומנגנונים עצביים ברמה המולקולרית. בפרוטוקול זה אנו מתארים הליכי התאגדות גנטית של Uaas לתוך הנוירונים עיקריים בתרבות במוח העכבר העוברי in vivo. Photoresponsive UAA CMN ו Kir2.1 משמש כדי להמחיש את התהליך. שיטות להעריך התאגדות UAA מוצלחת שליטה אופטית של פעילות חלבון עצבית מסופקות. פרוטוקול זה מספק מדריך ברור גנטי קידוד Uaas בנוירונים ובחי, וכדי אופטי ויסות תפקוד חלבון עצבי באמצעות UAA photoresponsive. אנו מצפים פרוטוקול זה כדי להקל על אימוץ הטכנולוגיה in vivo UAA עבור הנוירולוגיה מחקרים ביולוגיים optogenetic.

<table><tbody><tr><td>משקפי כיסוי, עיגולים, 12 מ"מ, עובי 0.13-0.17 מ"מ</td><td>Carolina Biologicals</td><td>633029</td><td></td></tr><tr><td>Corning BioCoat Poly-D-Lysine</td><td>Corning Discovery Labware</td><td>354210</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-תמיסת גלוקוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>כלי מדע עדין מעוקל של מרית איריס</td><td></td><td>10092-12</td><td></td></tr><tr><td>סכין חיתוך - קצה</td> <td>זוויתי עדיןFine Science Tool</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I תוסף</td><td>תזונה Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>MITO+ Serum Extender</td><td>BD Biosciences</td><td>355006</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 ומיקרו; m מסננת תאים</td><td>קורנינג מדעי החיים</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>BES (N,N-Bis (2-הידרוקסיאתיל)-2-חומצה אמינואתנסולפונית, N, N-ביס(2-הידרוקסיאתיל)טאורין)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>B6420</td><td></td></tr><tr><td>מקור אור LED &ndash; LED שחור 385</td><td>Prizmatix בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אגרוז, נקודת התכה נמוכה, דירוג אנליטי</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr></tbody></table>

שליטה אופטית של חלבון עצבי באמצעות חומצות אמינו לא טבעי מקודדים גנטיים בנוירונים

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

פוטוסטימולציה היא דרך לא פולשנית לשלוט באירועים ביולוגיים ברזולוציה מרחבית וזמנית מצוינת. רצויות שיטות חדשות לוויסות פוטו של חלבונים אנדוגניים המתבטאים בסביבתם הטבעית. כאן, אנו מציגים גישה לשליטה אופטית בתפקוד של חלבון עצבי ישירות בתאי עצב באמצעות חומצת אמינו לא טבעית מקודדת גנטית (Uaa). על ידי שימוש בזוג tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase אורתוגונלי כדי לדכא את קודון הענבר, Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) תגובתי לאור משולב באופן ספציפי בנקבוביות של חלבון עצבי Kir2.1, תעלת אשלגן מתקנת פנימה. ה-Cmn המגושם חוסם פיזית את נקבוביות הערוץ, מה שהופך את Kir2.1 ללא מוליך. תאורת אור ממירה באופן מיידי את Cmn לחומצת אמינו טבעית קטנה יותר Cys, ומפעילה את פונקציית ערוץ Kir2.1. אנו מבטאים את תעלותהאשלגן (PIRK) הניתנות להשראת תעלות אשלגן (PIRK) בתאי עצב ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדות, ומדגימים כי הפעלת האור של PIRK מפסיקה את הירי העצבי עקב זרימת זרם K+ דרך ערוצי Kir2.1 המופעלים. באמצעות אלקטרופורציה ברחם, אנו מבטאים PIRK גם בניאו-קורטקס העכבר העוברי in vivo, ומראים את הפעלת האור של PIRK בנוירונים ניאו-קורטיקליים. קידוד גנטי של Uaa אינו מטיל מגבלות על סוג חלבון המטרה או המיקום התאי, ומשפחה של Uaas פוטו-ריאקטיביים זמינה לווסת שאריות חומצות אמינו טבעיות שונות. לפיכך, לטכניקה זו יש פוטנציאל להיות מיושם באופן כללי על חלבונים עצביים רבים כדי להשיג ויסות אופטי של תהליכים שונים במוח. הפרוטוקול הנוכחי מציג הליך נגיש לשילוב UAA מורכב בתאי עצב במבחנה וב-vivo כדי להשיג בקרת פוטו של פעילות החלבון העצבי ברמה המולקולרית.

כדי גנטי לשלב UAA לתוך חלבון בנוירונים, הצעד החשוב הראשון הוא לעצב גן מתאים בונה למסור ולהביע גנים ביעילות בנוירונים. ישנם שלושה מרכיבים גנטיים עבור התאגדות UAA: (1) גן המטרה עם קודון עצירה ענבר TAG הציג באתר הנבחר עבור התאגדות UAA (2) tRNA מאונך להכיר קודון עצירה TAG מוטציה, ו (3) aminoacyl מאונך -tRNA synthetase לחייב את UAA על tRNA המאונך. כל רכיב צריך להיות מונע על ידי האמרגן המתאים. קלטות גנים שלוש אלה יכולים להיכלל פלסמיד אחד או מופרדות בכמה ...

כאן, מוצג הליך להפעלה סלקטיבית של חלבון עצבי עם פולס קצר של אור על ידי קידוד גנטי של חומצת אמינו לא טבעית תגובתית-אור לחלבון עצבי מטרה המתבטא בתאי עצב בתרבית או in vivo.

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע בקרה אופטית על תפקודה של חלבון נוירונלי באמצעות חומצת אמינו לא טבעית, המקודדת גנטית, בנוירונים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע לתרומתו של חלבון נוירונלי ספציפי לאיתות נוירונלי בתפקוד המוח, תוך רזולוציה מרחבית-זמנית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא הפוטנציאל ליישום שלה על חלבונים נוירונליים שונים כדי להשיג רגולציה אופטית של תהליכים נוירונליים מגוונים.התחילו את הפרוצדורה על ידי זריעת נוירונים מההיפוקמפוס על לוחות כיסוי בתוך פלטת 24 בארות עם 500 µL של מצע גידול, לאחר סינון דרך רשת ניילון של 40 µm. לאחר מכן, דגרו את תרבית הנוירונים בטמפרטורה של 35 °C באינקובטור לח עם 5% CO2 ו-95% אוויר למשך שבועיים עד שלושה שבועות. ביום הטרנספקציה, הכינו תמיסת calcium chloride טרייה בריכוז 2.5 M במים מזוקקים פעמיים, וסננו אותה סטרילית באמצעות מסנן של 0.22 µm.בשלב הבא, הכין תמיסת 2X BBS טרייה ב-pH 7, וסנן אותה בסינון סטרילי באמצעות מסנן של 0.22 micrometre. לאחר מכן, החלף את מצע גידול התרבית ב-500 microlitres של מצע טרנספקציה טרי ומחומם מראש, ואל תשפוך את מצע הגידול הישן. הכן את תמיסת הטרנספקציה מיד לפני הוספתה לתרבית על ידי ערבוב של calcium chloride ומים מזוקקים פעמיים, תוך כדי ניעור איטי של המבחנה.המשיכו לערבב את המבחנה והוסיפו לאט את ה-DNA לתמיסה. לאחר מכן, הוסיפו בטיפות של תמיסת 2X BBS buffer. הכנת תמיסת 2X BBS buffer היא שלב קריטי בטרנספקציה באמצעות סידן-פוספט, ומומלץ לכייל את ה-pH האופטימלי עבור תמיסת 2X BBS buffer בטווח שבין 6.90 ל-7.15 עבור מבני DNA או דגימות חדשים.לאחר מכן, הוסיפו מיד 30 µL מתמיס הטרנספקציה לכל כיסוי זכוכית (cover slip) של תרבית הנוירונים. נערנער את צלחת התרבית מספר פעמים כדי לערבב את התמיסה, והדגרירו אותה בטמפרטורה של 35 °C למשך 45 דקות עד שעה. לאחר כשעה, יש להבחין בשכבה של משקעי סידן-פוספט עדינים המכסים את הנוירונים.בשלב הבא, החליפו את מצע הטרנספקציה ב-500 microlitres של בופר שטיפה שחומם מראש, והדגירו אותו בטמפרטורה של 35 degrees Celcius למשך 15 עד 20 דקות. משקעי סידן הפוספט אמורים להיעלם לאחר השטיפה. כעת, החליפו את בופר השטיפה ב-500 microlitres של מצע גידול טרי.לאחר מכן, החליפו את מצע הגידול במצע המקורי שנשמר. לאחר מכן, הוסיפו לתרבית חומצת אמינו לא טבעית Cmn ששורבבה מראש ב-50 microlitres של מצע גידול חם, כך שתתקבל ריכוז סופי של one millimolar. דגרו את התרבית שעברה טרנספקציה ב-35 degrees Celcius למשך 12 עד 48 שעות לפני התיעוד.בנוהל זה, הכינו את התמיסות התוך-ותחומי-תאיות. במערך שלנו, נורת LED עם פליטה של 385 nanometres מותקנת לצד המיקרוסקופ כדי להעביר אור למרחק של one centimetre מנקודת המוקד בזווית של 45 מעלות. לאחר מכן, משכו מספר פיפטות patch באמצעות אלקטרודת זכוכית בעזרת מכשיר למשיכת מיקרו-פיפטות (micro pipette puller).לאחר מכן, הוצא לבידה של תרביות נוירונים מהאינקובטור ושטוף אותה פעם אחת בתמיסה החוץ-תאית. השקה את מתקן הניסוי בתמיסה החוץ-תאית. לאחר מכן, הנח את הלבידה על פלטפורמת מיקרוסקופ האלקטרופיזיולוגיה, תוך שימוש בטכניקות patch clamping סטנדרטיות.בצעו פאץ' (Patch) לנוירון שטרנספקט עם M-citrine פלואורסצנטי. לאחר מכן, רשמו את הפעילות הנוירונלית באמצעות שיטת ה-current clamp. ראשית, כוון את פוטנציאל המנוחה לסביב 72- millivolts.לאחר מכן, הזרק זרם מדורג כדי להשרות פריקה רציפה של פוטנציאלי פעולה בתדר של 5 עד 15 Hertz. תוך כדי ההקלטה, הזרק פולסי LED בודדים לנוירון, ועקב אחר השינויים בפוטנציאלי הפעולה שלו. לאחר מכן, הוסף 0.5 millimolar barium chloride לאמבט, כדי להחזיר את פוטנציאלי הפעולה.בתנאי פרוסה מוחית חיה (acute brain slice), בצעו patch לניורון עם פלואורסצנציית M-cherry GFP מאזור הנאו-קורטקס (neocortical region). לאחר מכן, רשמו את פעילות ה-PIRK באמצעות שיטת voltage ramp. באופן ספציפי, נטרו את זרמי הפנימה הספציפיים ל-Kir2.1 ב-100 millivolts שליליים.לאחר מכן, הגישו פולסים בודדים של LED לנוירון תוך כדי הקלטה, ועקבו האם חלבי PIRK הופעלו. ברגע ש-PIRK מופעל, זרמים פנימה ב-100 millivolts שליליים יעלו באופן משמעותי. לסיום, הוסיפו 0.5 millimolar barium chloride לאמבט, ואמתו האם PIRK הושבת.מוצגות כאן תמונות לדגימאיות של תרביות נוירונים בריאות מההיפוקמפוס של חולדה. ושני נוירונים בריאים המראים גופי תא מלאים ודנדריטים ואקסונים בולטים. אלו הן תמונות DIC ופלואורסצנציה של תרביות נוירונים מההיפוקמפוס של חולדה in vitro, אשר עברו טרנספקציה לביטוי של PIRK ללא CMN.בנוכחות של 1 mM CMN, נוירונים שעברו טרנספקציה מסוגלים לבטא חלבוני PIRK M-citrine באורך מלא, ובכך להפגין פלואורסצנציה ירוקה. וכאן דוגמה לפולס אור בודד, המדכא את פעילותו של נוירון היפוקמפלי המבטא PIRK. תמונות פלואורסצנציה אלו של נוירונים קורטיקליים מעוברים של עכבר מראות שילוב מוצלח של CMN בתוך חלבוני GFP ו-Kir2.1 in vivo.בגרף זה, ההפעלה התלויה באור של PIRK מצוינת בזרמים שנמדדו מנוירונים של הניאוקורטקס בעכבר. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלות מוח הנגרמות מתפקוד לקוי של חלבונים נוירונליים ספציפיים, למשל, Kir2.1 מוטנטי בתסמונת אנדרסן, מכיוון שטכניקה זו מסייעת לחשוף אילו מעגלים מוחיים מושפעים מליקויי Kir2.1. לאחר רכישת המיומנות, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לשלוט בתפקוד של חלבונים נוירונליים באמצעות אור בסגוליות גבוהה בנוירונים חיים.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לשלב חומצות אמינו לא טבעיות בחלבונים בתאי עצב, כדי להשיג בקרה פוטו-כימית על חלבונים עצביים רצויים.

optical-control-neuronal-protein-using-genetically-encoded-unnatural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בקרה וניתוח של מעגלים...

Scalable Fluidic Injector מערכים עבור ויראלי הכוונת של 3-D מעגלים פגוע המוח

למבוגרים יליד נוירונים להביע ChR2 ניתן לטפל בהכנות פרוסה אלקטרו על מנת לבחון את תרומתם כלפי פונקציה של מעגלים עצביים חוש הריח.

באמצעות מערכי LED משתלמת עבור גירוי-תמונה של נוירונים

קח תרבית של Corynebacterium glutamicum, שעבר טרנספורמציה עם פלסמיד הנושא גן מדווח פלואורסצנטי במורד הזרם של האנטי-טרמינטור של חומצה ריבונוקלאית או רצף RAT, בצלחת מרובת בארות.במהלך השעתוק, ה-RAT-RNA יוצר מבנה לולאת גזע החוסם RNA פולימראז, ועוצר את ביטוי הגן המדווח.הפלסמיד גם מבטא באופן מכונן את LicV, חלבון היתוך המורכב מחלבון קושר RAT-RNA, LicT, ותחום ה-VVD הרגיש לאור כחול.בחושך, LicV נשאר מונומרי ואינו נקשר ללולאת הגזע RAT-RNA, החוסמת את השעתוק של הגן המדווח.האירו את התרבית באור כחול כדי לגרום...

בקרה אופטוגנטית על ביטוי גנים ב - Corynebacterium glutamicum

הפיתוח האחרון של כלים מדעי המוח המשלבים גנטיקה ואופטיקה, המכונה "optogenetics", מאפשר שליטה על פעילות מעגלים עצבית ברמה חסרת תקדים של רזולוציה מרחב ובזמן. כאן אנו מספקים פרוטוקול לשילוב בהקלטה vivo עם המניפולציה optogenetic של תת קבוצות גנטית מוגדרות של תאי עצב בקליפת המוח פירמידה וsubicular הקדם חזיתית.

שיטה לנאמנות גבוהה בקרת optogenetic של פרט פירמידת נוירונים<em&gt; בvivo</em

מאמר זה מתאר שיפור של קונבנציונאלי מתח פלמורומטריה (VCF) שבו פלואורסצנט טבעי חומצות אמינו (fUAA) משמשים במקום צבעים maleimide, כדי לבדוק סידורים מבניים בערוצי יון. ההליך כולל הזרקת Xenopus ביצית דנ"א, RNA / מטבע fUAA, ומדידות בו זמנית ו פלואורסצנטי.

מתח הידוק פלואומטריה ב<em&gt; קסנופוס</em&gt; ביציות באמצעות חומצות אמינו פלואורסצנטי לא טבעי

פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיה optogenetic כדי לווסת מיטוגן המופעל חלבון קינאז (MAPK) פעילות במהלך התמיינות תאים והתפתחות עובריים Xenopus . שיטה זו מאפשרת הפעלה הפיכה של המסלול איתות MAPK בתרבית תאים יונקים ועל אורגניזמים חיים תאיים, כמו עוברי Xenopus , עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה.

אור בתיווך אפנון הפוך של מיטוגן המופעל חלבון קינאז נתיב במהלך הבחנה Cell ו<em&gt; קסנופוס</em&gt; התפתחות עובריים

וזמינותו זריחה נתיישב מוצג כדי להעריך את היעילות של זוגות אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר/tRNA שילוב קאנונית-חומצות אמינו (ncAAs) לחלבונים מבוטא בתאי יונקים. היישום של ncAAs ללמוד G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs) מתואר, כולל צילום-crosslinking מיפוי של איגוד אתרים ו bioorthogonal GPCR תיוג על תאים חיים.

אופטימיזציה של שיתוף גנטי של חומר כימי רגשים לתוך GPCRs עבור צילום-crosslinking מיפוי וכימיה Bioorthogonal בתאים בתרבית של חיה

פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה על כיצד לשלב מלאכותי בתיווך microRNA RNA הפרעה optogenetics לעורר במיוחד presynaptic עם העיתון ons עם ביטוי מופחתת של gene (s) סלקטיבי בתוך מעגלים עצביים ללא פגע.

שילוב Optogenetics עם מיקרו Rna מלאכותי כדי לאפיין תופעות נוקאאוט גנטי על פונקציה Presynaptic בתוך מעגלים עצביים ללא פגע

עם מניפולציה אופטוגנטית של אוכלוסיות עצביות ספציפיות או אזורים במוח, התנהגות ניתן לשנות עם רזולוציה זמנית ומרחבית גבוהה בבעלי חיים נעים בחופשיות. באמצעות כלים אופטוגנטיים שונים בשילוב עם סיבים אופטיים מושתלים כרונית, ניתן לבצע מגוון של אפנון עצבי ובדיקות התנהגותיות.

מניפולציה אופטוגנטית של פעילות עצבית לווסת את ההתנהגות בעכברים נעים בחופשיות

שליטה אמינה בתאי יונקים מגיבים לאור דורשת סטנדרטיזציה של שיטות אופטוגנטיות. לקראת מטרה זו, מחקר זה מתאר צינור של בניית מעגלי גנים, הנדסת תאים, פעולת ציוד אופטוגנטי, ובדיקות אימות כדי לתקנן את המחקר של ביטוי גנים המושרה באור באמצעות מעגל גנים אופטוגנטי משוב שלילי כמקרה מבחן.

הנדסה אמינה ושליטה במעגלי גנים אופטוגנטיים יציבים בתאי יונקים

פרוטוקול זה מתאר את היישום של תחום מתג אלוסטרי מהונדס המופעל על ידי אור כחול (LightR) עבור בקרה מרחבית-טמפורלית הפיכה של פעילות החלבון. תוך שימוש ב-Src טירוזין קינאז כמודל, מחקר זה מציע פרוטוקול מפורט לפיתוח ואפיון Src מווסת אור (LightR-Src). הוא מדגים את הרבגוניות של גישה זו בכל סוגי האנזימים.

בקרה מרחבית-זמנית של פעילות החלבונים באמצעות ויסות אלוסטרי אופטוגנטי

למדו שליטה אופטית בחלבונים עצביים באמצעות חומצות אמינו לא טבעיות מקודדות גנטית בנוירונים היפוקמפיים. שיטה זו מאפשרת חקר תפקידי חלבונים ספציפיים באותות עצביים עם רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה.

שליטה אופטית של חלבון עצבי באמצעות חומצות אמינו לא טבעי מקודדים גנטיים בנוירונים

גלה סרטונים נוספים