מבחנים איכותיים וכמוני עבור זיהוי ואפיון של antimicrobials החלבון

המטרה הכוללת של ניסויים אלה היא לסנן ולאפיין במהירות אנזימים לפעילות אנטי-מיקרוביאלית. לבדיקת דיפוזיה ושחרור צבע יש תועלת לגילוי פונקציונלי של אנטי-מיקרוביאלים חדשים עם פעילות ליטית כנגד מטרות ספציפיות כגון חיידק פתוגני מעניין. היתרונות העיקריים של טכניקות אלו הם שהן פשוטות לביצוע, מספקות גמישות לשינוי פרמטרים ניסיוניים וניתן לבצע אותן עם ציוד מעבדה הנפוץ ברוב מעבדות המיקרוביולוגיה.

לפני תחילת בדיקת דיפוזיה של מיקרו-סלייד, יש לקבוע את ריכוז האנזים האנטי-מיקרוביאלי שיש להעריך באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA, על פי פרוטוקול היצרן. בצע דילול סדרתי של האנזים האנטי-מיקרוביאלי, תוך שימוש ב-PBS כמאגר תגובה. הוציאו את החלבון לצינורות מיקרופוגה בודדים והתאימו את הנפחים ל-20 מיליליטר באמצעות PBS.

לאחר מכן, הכינו תמיסת אגרוז של 0.5% על ידי המסת 0.25 גרם אגרוז ב -50 מיליליטר PBS. מחממים תמיסה זו לרתיחה עד להמסה מלאה של האגרוז. קבע מים שאבדו בתהליך ההיתוך לפי משקל והוסף בחזרה לתמיסה.

כדי לעכב צמיחת חיידקים מזהמת במהלך הדגירה של הבדיקה, הוסף 15 מיקרוליטר של 10% נתרן אזיד במים לתמיסת האגרוז, והתאם את טמפרטורת התמיסה ל-50 מעלות צלזיוס באמבט מים. אם משתמשים בתאים ברי קיימא כמצע, השמיט את אזיד הנתרן מתמיסת האגרוז. הפשירו את מצע החיידקים שנהרג בחום על קרח.

השעו מחדש את מצע החיידקים ב-12 מיליליטר של תמיסת האגרוז כך שיתאימו בערך לעכירות של תקן עכירות שקילות מקפרלנד 2.0. השווה את עכירות התמיסות על ידי הדמיית קו שחור על רקע לבן דרך התמיסות, הוספת מצע חיידקי לאגרוז עד להשגת העכירות המשוערת. מיד אך בזהירות, הזרם שלושה מיליליטר מתמיסת מצע האגרוז לכל מיקרו-שקופית, וודא שהתמיסה לא תעלה על גדותיה של המיקרו-שקופית.

לאחר שהמגלשות התמצקו, השתמש במקדח שעם בקוטר 4.8 מילימטר כדי לנקב שלוש בארות בשכבת מצע האגרוז של כל מיקרו-שקופית. הוסף 20 מיקרוליטר מכל דילול סדרתי של חלבון מותאם לבארות המתאימות. השתמש באלבומין סרום בקר בבאר בקרה שלילית.

כבקרה חיובית, השתמש באנזימים בקטריוליטיים ידועים המתאימים לסובסטרט כגון ליזוזים. דגרו את המגלשות בתא לחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, או טמפרטורת הפעילות האופטימלית של האנזים. משך הדגירה תלוי בריכוז ובפעילות הספציפית של האנזים המיקרוביאלי.

זמן תגובה טיפוסי הוא כ-16 שעות. לאחר השלמת הדגירה, התבונן בשקופיות באור עקיף, וצלם תמונות של הבדיקה המתפתחת. השתמש במצלמת רפלקס דיגיטלית עם עדשה אחת עם עדשת 60 מילימטר במרחק מוקד של כ -30 סנטימטרים.

במבחן שחרור הצבע שיודגם בקטע הבא, המצע מקושר קוולנטית לצבע Remazol Brilliant Blue R או RBB. התחל פרוטוקול זה על ידי יצירת תמיסת RBB 200 מילי-מולר. ממיסים 1.25 גרם RBB בתמיסת נתרן הידרוקסיד טרייה.

לאחר מכן, השעו מחדש תאי חיידקים שנהרגו בחום בריכוז של 0.5 גרם משקל רטוב ב-30 מיליליטר של תמיסת RBB. עבור פפטידוגליקן מטוהר, השעו מחדש את הפפטידוגליקן בריכוז של 0.3 גרם משקל רטוב ב-30 מיליליטר של תמיסת RBB. מכיוון שהשלבים הבאים זהים, ללא קשר למצע בו נעשה שימוש, התיוג יודגם רק עבור תאי החיידקים.

דגרו את תערובת התגובה על פלטפורמה מסתובבת למשך שש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין. לאחר שש שעות, העבירו את תערובת התגובה לאינקובטור של ארבע מעלות צלזיוס ודגרו למשך 12 שעות נוספות בערבוב עדין. בסיום הדגירה, קצרו את המצע הצבוע על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 3000 x גרם למשך 30 דקות.

שפכו את תמיסת הצבע מגלולת המצע. השעו את הגלולה ביסודיות במים מסוג I ואחריהם צנטריפוגה. השקה את התאים המסומנים בצבע שלוש עד חמש פעמים באופן זה כדי להסיר צבע מסיס שאינו מקושר באופן קוולנטי מהמצעים.

לכביסות סופיות, העבירו את חלק הגלולה שישמש בבדיקת שחרור הצבע לצינורות מיקרופוגה של 1.5 מיליליטר. הסופרנטנט של הכביסה האחרונה צריך להיות ברור בעוד המצע נשאר כחול. אחסן את המצע הצבוע תלוי בכמות מינימלית של מים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן לשימוש.

כדי להתכונן לבדיקת שחרור הצבע, אפשר למצע הצבוע הקפוא לחזור לטמפרטורת החדר, ולשטוף פעמיים עם מאגר הבדיקה שנקבע אמפירית עבור האנזים. PBS משמש במקרה זה. חשב את נפח תרחיף המצע הדרוש על ידי הכפלת נפח התגובה של 200 מיקרוליטר במספר בדיקות שחרור הצבע שיש לבצע.

להכנת מתלה המצע, הוסף תחילה את המצע הצבוע לנפח המתאים של PBS. בצע דילול אחד לאחד, ובצע מדידה ראשונית של הצפיפות האופטית ב-595 ננומטר, תוך שימוש ב-PBS כריק. הוסף כמויות מצטברות של המצע הצבוע למתלה עד להשגת צפיפות אופטית של 2.0 ב-595 ננומטר.

בהדגמה זו, בדיקת שחרור הצבע תשמש לקביעת תנאי הדגירה האופטימליים עבור חלבון אנטי-מיקרוביאלי. ראשית, הכינו תרחיף אנטי-מיקרוביאלי של חלבון מלאי על ידי התאמת הריכוז למיליגרם אחד למיליליטר באמצעות PBS כמתואר בטקסט הפרוטוקול. לאחר מכן יש לדלל את התרחיף האנטי-מיקרוביאלי של חלבון המלאי לריכוז של 100 ננוגרם למיקרוליטר.

ריכוז זה נותן מסת תגובה סופית של מיקרוגרם אחד של חלבון לכל נפח שנוסף לתגובת הבדיקה. בצע את מבחני התגובה בצינורות מיקרופוגה של 0.5 מיליליטר להערכת הטווח התרמי. עבור כל מצב תרמי, הוסף 10 מיקרוליטר מחלבון המלאי ל -200 מיקרוליטר של תרחיף מצע מוכן.

דגירה במחזור תרמי למשך שמונה שעות עם ערבוב על ידי היפוך פעם בשעה. לאחר הדגירה, עצרו את התגובות על ידי הוספת 25 מיקרוליטר אתנול לכל צינור מיקרופוגה. להסרת מצע בלתי מסיס לא מעוכל, צנטריפוגה ב 3000 x גרם למשך שתי דקות.

לאחר מכן, תוך הקפדה לא לשבש את הגלולה של המצע הלא מעוכל, העבירו 150 מיקרוליטר של חומר התגובה עבור כל תערובת תגובה למיקרו-פלטה עם תחתית שטוחה של 96 בארות. כדי לכמת את הפעילות האנזימטית, השתמש בספקטרופוטומטר מיקרו-פלטות כדי למדוד את הספיגה של הסופרנטנט ב-595 ננומטר. ספיגה מוגברת על ידי הצבע המסיס המשתחרר לתוך הסופרנטנט מהמצע המסומן היא מדידה כמותית של פעילות אנזימטית.

מבחן דיפוזיה של מיקרו-שקופיות שימש להערכה איכותית של פעילותו של חלבון אנטי-מיקרוביאלי לא ידוע כנגד מצע תאים שלמים של סלמונלה אנטריקה. האנטי-מיקרוביאלי נוסף בכמויות הולכות וגדלות מבארות A עד F, ו-PBS שימש לבקרות שליליות. לאחר שש שעות נצפה גודל האזור הצלול של הידרוליזה שנוצר סביב כל באר.

פעילות אנזימטית גבוהה מתייחסת איכותית לאזור גדול יותר בעוד שפעילות אנזימטית נמוכה מתייחסת איכותית לאזור קטן יותר. בדיקת שחרור הצבע הכמותית שימשה לקביעת טמפרטורת התגובה האופטימלית עבור חלבון אנטי-מיקרוביאלי. כפי שניתן לראות מכמויות הצבע הכחול בסופרנטנטים של התגובה, ויחידות הפעילות הנגזרות ממדידות הספיגה ב-595 ננומטר, 35 מעלות צלזיוס היא הטמפרטורה האופטימלית.

בדיקת שחרור הצבע שימשה גם לקביעת טווח הפעילות של חלבון אנטי-מיקרוביאלי לא ידוע כנגד מצע הרג חום של Bacillus subtilis. השוואה לטווח הפעילות של אלפא-כימוטריפסין גילתה כי לאנזים האנטי-מיקרוביאלי הלא ידוע יש זיקה כמעט כפולה לסובסטרט. בנוסף, בעוד שפעילות אלפא-כימוטריפסין מתחילה להתייצב סביב 0.3 מיקרוגרם, הפעילות של האנזים הלא ידוע המשיכה לעלות בכל כמויות האנזימים.

לאחר השליטה, ניתן להשלים את בדיקת דיפוזיה של מיקרו-שקופיות תוך 30 דקות. ניתן להשלים את בדיקת שחרור הצבע תוך שעה. זמני הדגירה עבור כל בדיקה יהיו תלויים בפעילות האנזים ובריכוזיהם.

בהרחבת נהלים אלה, ניתן לשנות את שיטת שחרור הצבע כדי לקבוע את ההשפעות הכימיות המשפיעות על הפעילות האנזימטית של האנזים האנטי-מיקרוביאלי על ידי מניפולציה של היבטים של התגובה כגון pH חוצץ ומליחות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לסנן ולאפיין במהירות אנזימים לפעילות אנטי-מיקרוביאלית באמצעות מבחני דיפוזיה ושחרור צבע של מיקרו-שקופיות.