Name: מבחנים איכותיים וכמוני עבור זיהוי ואפיון של antimicrobials החלבון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: למדו פרוטוקולים לסינון מהיר ואפיון אנזימים לפעילות אנטי-מיקרוביאלית באמצעות מבחני דיפוזיה ושחרור צבע. שיטות אלו מאפשרות הערכה איכותית וכמותית של פעילות אנזימטית נגד חיידקים פתוגניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי תאגיד MITRE באמצעות תוכנית החדשנות של MITRE (פרויקט 25MSR621-CA). המחברים רוצים להודות למארק מייבורי, Ph.D., ריצ'רד גיימס, Ph.D., ג'יימס פאטון, אלן מק גריגל, Ph.D., קארל פיקונאטו, Ph.D., וקרוליין גארי על תמיכתם וסקירת העבודה הזו.

<ol><li>Anand, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+activity+of+marine+bacteria+associated+with+sponges+from+the+waters+off+the+coast+of+South+East+India%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial activity of marine bacteria associated with sponges from the waters off the coast of South East India.</a> Microbiol Res. 161, 252-262 (2006).</li>
<li>Tagg, J. R., Dajani, A. S., Wannamaker, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriocins+of+gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Bacteriol+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacteriocins of gram-positive bacteria.</a> Bacteriol Rev. 40, 722-756 (1976).</li>
<li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+competition%3A+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 15-25 (2010).</li>
<li>Riley, M. A., Gordon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ecological+role+of+bacteriocins+in+bacterial+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ecological role of bacteriocins in bacterial competition.</a> Trends Microbiol. 7, 129-133 (1999).</li>
<li>Tenover, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+antimicrobial+resistance+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria.</a> Am J Med. 119, S3-S10 (2006).</li>
<li>Farris, M. H., Steinberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitrecin+A%2C+an+endolysin-like+bacteriolytic+enzyme+from+a+newly+isolated+soil+streptomycete%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mitrecin A, an endolysin-like bacteriolytic enzyme from a newly isolated soil streptomycete.</a> Lett Appl Microbiol. 58, 493-502 (2014).</li>
<li>Dehart, H. P., Heath, H. E., Heath, L. S., Leblanc, P. A., Sloan, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lysostaphin+Endopeptidase+Resistance+Gene+%28epr%29+Specifies+Modification+of+Peptidoglycan+Cross+Bridges+in+Staphylococcus+simulans+and+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Lysostaphin Endopeptidase Resistance Gene (epr) Specifies Modification of Peptidoglycan Cross Bridges in Staphylococcus simulans and Staphylococcus aureus.</a> Appl Environ Microbiol. 61, 2811(1995).</li>
<li>Srivastava, K. K., Siddique, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+chemical+composition+of+peptidoglycan+of+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Quantitative chemical composition of peptidoglycan of Listeria monocytogenes.</a> Infect Immun. 7, 700-703 (1973).</li>
<li>Heilmann, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+peptidoglycan+of+the+cell+walls+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">On the peptidoglycan of the cell walls of Pseudomonas aeruginosa.</a> Eur J Biochem. 31, 456-463 (1972).</li>
<li>Schumann, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchumann%2C+P+%22Taxonomy+of+Prokaryotes%22">Taxonomy of Prokaryotes</a>. Rainey, F., Oren, A. 38, Academic Press. (2011).</li>
<li>Lachica, R. V., Genigeorgis, C., Hoeprich, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metachromatic+agar-diffusion+methods+for+detecting+staphylococcal+nuclease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Metachromatic agar-diffusion methods for detecting staphylococcal nuclease activity.</a> Appl Microbiol. 21, 585-587 (1971).</li>
<li>Zhou, R., Chen, S., Recsei, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dye+release+assay+for+determination+of+lysostaphin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A dye release assay for determination of lysostaphin activity.</a> Anal Biochem. 171, 141-144 (1988).</li>
<li>Osserman, E. F., Lawlor, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+and+urinary+lysozyme+%28muramidase%29+in+monocytic+and+monomyelocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Serum and urinary lysozyme (muramidase) in monocytic and monomyelocytic leukemia.</a> J Exp Med. 124, 921-952 (1966).</li>
<li>Mancini, G., Carbonara, A. O., Heremans, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical+quantitation+of+antigens+by+single+radial+immunodiffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunochemistry%22%5BJournal%5D)">Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion.</a> Immunochemistry. 2, 235-254 (1965).</li>
<li>Ito, Y., Yamada, H., Imoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+assay+for+lysozyme+using+Micrococcus+luteus+labeled+with+a+blue+dye%2C+Remazol+brilliant+blue+R%2C+as+a+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Pharm+Bull.+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Colorimetric assay for lysozyme using Micrococcus luteus labeled with a blue dye, Remazol brilliant blue R, as a substrate.</a> Chem Pharm Bull. (Tokyo). 40, 1523-1526 (1992).</li>
<li>Hardt, M., Guo, Y., Henderson, G., Laine, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymogram+with+Remazol+brilliant+blue-labeled+Micrococcus+lysodeikticus+cells+for+the+detection+of+lysozymes%3A+example+of+a+new+lysozyme+activity+in+Formosan+termite+defense+secretions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Zymogram with Remazol brilliant blue-labeled Micrococcus lysodeikticus cells for the detection of lysozymes: example of a new lysozyme activity in Formosan termite defense secretions.</a> Anal Biochem. 312, 73-76 (2003).</li>
<li>Pettersson, B., Eriksson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardized+spectrophotometric+assay+of+endoglycanase+activities+using+dyed%2C+amorphous+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A standardized spectrophotometric assay of endoglycanase activities using dyed, amorphous polysaccharides.</a> Anal Biochem. 285, 220-224 (2000).</li>
<li>Gomez Ramirez, M., Rojas Avelizapa, L. I., Rojas Avelizapa, N. G., Cruz Camarillo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colloidal+chitin+stained+with+Remazol+Brilliant+Blue+R%2C+a+useful+substrate+to+select+chitinolytic+microorganisms+and+to+evaluate+chitinases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Colloidal chitin stained with Remazol Brilliant Blue R, a useful substrate to select chitinolytic microorganisms and to evaluate chitinases.</a> J Microbiol Methods. 56, 213-219 (2004).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים. חברת MITRE היא חברה שלא למטרות רווח פועלת מרכזי מחקר ופיתוח מספר במימון פדרלי (FFRDCs).

את assay דיפוזיה microslide ואת assay-שחרור לצבוע לספק יתרונות לגילוי ואפיון antimicrobials חלבון מזוהה קודם לכן. שיטות מהירות ורגישות אלה מאפשרות הקרנת תפוקה גבוהה של ספריות מקור אורגניזם לזיהוי אנזימים של עניין לפני השקעת משאבים במחקר גדול. כמו אנזימים היעד פרופיל גבוה מזוהים, וריאציות של מבחני זיהוי שניתן להשתמש בהם כדי לזהות את האנזים במהירות או כדי לקבוע מאפיינים ביוכימיים של האנזים. לדוגמא, במהלך תכנית טיהור חלבונים רבה שלבים, assay דיפוזיה microslide יכול לזהות במהירות שברים המכילים את אנזים עניין. בנוסף, אופטימה תגובה עבור האנזים יכולה להיקבע על ידי שינוי מאגרי התגובה וטמפרטורות דגירה ב assay צבען השחרור. טווח המסה האנזים הדרוש לגילוי ב assay דיפוזיה microslide היא פונקציה של characteri אנזיםstics. מגבלות איתור של assay בדרך כלל דורשים את השימוש כמויות גדולות יותר של האנזים מאשר assay צבען שחרור. במחקר זה, השוואה של מגבלות זיהוי של assay דיפוזיה microslide (איור 1) אל assay-השחרור לצבוע (איור 4) מאוירת כי assay דיפוזיה microslide הוא טכניקה רגישה פחות assay צבען השחרור. כאשר ריכוז אנזים הוא לא חשש, assay microslide מאפשר סינון ראשוני מהיר של ספריות לייצור antimicrobials חלבון נגד מצעי יעד עם דרישות עבודה וציוד נמוכות. למרות הדורשים יותר מאמץ וציוד, assay-השחרור לצבוע רגיש יותר לשחזור, מניב תוצאות כמותיות המאפשרות השוואה בין מבחנים-שחרור לצבוע של אנזימים זהים או שונים עבור מצע נתון. שתי השיטות מבוצעות בקלות ברוב מעבדות מיקרוביולוגית ללא צורך במכשור מיוחד מאוד. בשנות ה representaמבחנים מופרזים, האנזים השליט, α-chymotrypsin, זוהה על סכומים נמוכים כמו 100 ננוגרם (איור 5) באמצעות assay צבען השחרור, בעוד הכמות המינימאלית זוהתה assay דיפוזיה microslide הייתה 1 מיקרוגרם (מידע לא מוצג). מתן שירות כמו assay זיהוי איכותי אנזימים מיקרוביאלית, מספר וריאציות של assay דיפוזיה דווח 11,13. לאחר בדיקת מבחנים אלה, assay דיפוזיה microslide פותח עבור הרגישות הגבוהה יחסית שלה כמסך ראשוני שלה להקל שמירת תגובה. שונה מן העבודה של Lachica et al. 11, שבו שכבות agarose שמשו כדי לזהות את הייצור של nucleases ידי זנים של Staphylococcus aureus, assay דיפוזיה microslide פועל באופן דומה לשיטת immunodiffusion רדיאלי 14 כמו החלבון מפזר מהבאר אל agarose המכיל את המצע. Immunodiffu רדיאלישיטת שיאון עוצרת את הרחבת האזור של immunoprecipitation כאשר המערכת מגיעה לשיווי משקל היווצרות מורכב בין אנטיגן לשדר הנוגדנים בתוך agarose. לעומת זאת, המצע של assay דיפוזיה microslide בתחילה הוא מתעכל על ידי מיקרוביאלית החלבון לשדר באזור מתקדם בקצב מזורז לתמס סביב הבאר. הקוטר גדל וההולך של האזור ממשיך עד האנזים מאבד פעילות או המצע הוא מותש. שיעור הייצור של האזור לתמס הוא התחיל להאיץ את הטוהר, ולכן הפעילות הספציפית, של האנזים או הריכוז של האנזים הוסיף לעליות היטב. לקבלת כמותית להערכת הפעילות האנזימטית של antimicrobials חלבון נגד הרג חום B. subtilis, assay-שחרור לצבוע נבחר. מבחני Colorimetric באמצעות צבע R כחול מבריק Remazol (RBB) -labeled מצעים לאפשר הערכה צדדית ורגישה של פעילויותיו חלבון מיקרוביאליתty. הידרוליזה אנזימתי של תוצאות מצע שכותרתו RBB בשחרור מוצרים כחולים מסיסים שניתן למדוד בקלות על ידי ספקטרופוטומטר ב 595 ננומטר. כמה וריאציות של assay צבען שחרור RBB, פותח על מנת לאפיין אנזימים מיקרוביאלית חלבון אחרים, להראות את הגמישות של assay זה עבור יישום עם מצעים אחרים. לדוגמה, בקביעת ההשפעות של lysostaphin פעילות bacteriolytic, ג&#39;ואו, et al., דיווחו על assay צבען שחרור באמצעות תאים staphylococcal צבוע RBB ו פפטידוגליקן staphylococcal כמו מצעים 12. בשנת שינוי של היישום של assay צבען שחרור RBB זה, מצע luteus Micrococcus RBB שכותרתו הוצע לשימוש כאמצעי מהיר ורגיש לאבחן מסך למחלות כגון זיהום חיידקים ואת הנוכחות של קרצינומה ממארת, אשר יכול להיות מתואמים ברמות הביטוי ליזוזים אדם בדם סרום 15. בנוסף, מצעי תא חיידק שכותרתו RBB ישסימפוני שמש שיטת zymogram לצורך זיהוי של ליזוזים 16. אנו מדגימים את גבול גילוי וריד, נוחות, ואת השחזור של assay צבען השחרור, המאפשר הקרנת ספרייה מהירה לייצור אנזים. שינויים של assay לאפשר מבחני אפיון ביוכימי כמותית במורד הזרם, כולל השפעות בגין טמפרטורה, pH, ומליחות וכן את ההשפעות של אנזימים מפרקי חלבונים אחרים על פעילות חלבונים מיקרוביאלית 6. בנוסף, assay צבען שחרור כמותי שניתן להשתמש בהם כדי להשוות את פעילות האנזימים מרובים עבור מצע נתון. את assay צבען שחרור RBB דיווחה השירות עבור אנזימים עם פעילות נגד סוכרים בנוסף לאפיון וזיהוי של סוכני מיקרוביאלית חלבון. Pettersson ו אריקסון דיווחה על assay לאיתור פעילות endoglycanase באמצעות חרוזים פוליסכריד אמורפי, RBB צבוע של תאית, xylan, mannan, וצ&#39;יטב 17. בשנת רחבה של ממצאים אלה, שיטה רגישה לגילוי של אנזימי chitinase המיוצרים על ידי Bacillus thuringiensis Bt-107 פותח באמצעות כיטין קולואידים שכותרתו עם RBB 18. ממחקרים אלה ואחרים, מקורות זמינים מסחרית של מצעים צבוע RBB צמחו לשימוש זיהוי של פעילות glycolytic, כולל אלה נגד קרטין, amylopectin, amylose, גליקוגן, laminarin, ד-xylan, גלוקן אזו-שעורה, ועמילן. במחקר זה, אנו מדגימים את השירות של assay-שחרור לצבוע במתכונת microplate, צמצום נפח המצע שכותרתו RBB ואנזים הנדרש כדי להפיק את התוצאה colorimetric. כפי שמודגם באיור 4 ואיור 5, assay צבען שחרור microplate מספק גבול הגילוי נמוך assay דיפוזיה microslide לגילוי הפעילות האנזימטית. לגבי שימוש מהיר, שימור העבודה, וקלות הפרשנות, המיקרופוןassay דיפוזיה roslide מספק שירות מסכי תפוקה גבוהה ראשוניים עבור הנוכחות של פעילות מיקרוביאלית כמו גם האינדיקציה של נוכחות חלבון מיקרוביאלית בצעדי טיהור ובידוד חלבון במורד זרם. השילוב של מבחני שני אלה משלימים זה את זה את הסינון הראשוני ואפיון האולטימטיבי של antimicrobials חלבון הרומן

חומרים אנטי-מיקרוביאליים ממלאים תפקיד חיוני בהתמקדות במגוון רחב של מיקרואורגניזמים כגון וירוסים, פטריות וחיידקים. הפעילויות האנטי-מיקרוביאליות המיוצרות על ידי חיידקים שונים נעות בספציפיות המטרה מספקטרום רחב לספציפי למין, כולל פתוגנים חיידקיים רלוונטיים קלינית 1. בטבע, תרכובות אנטי-מיקרוביאליות של חלבונים כמו בקטריוצינים וליזינים מייצגות ארסנל מיקרוביאלי של כלים להגנה עצמית, שכפול ורכישת חומרים מזינים 2,3. משמשים כמתווכים של דינמיקת אוכלוסייה בתוך קהילות מיקרוביאליות, אנטי-מיקרוביאלים חלבונים מספקים יתרון תחרותי לאורגניזם המייצר על פני מינים רגישים שאינם מייצרים 4. כאנזימים רקומביננטיים ופרוביוטיקה, לחלבונים אלה יש גם חשיבות כלכלית וחברתית שכן הצורך במקורות חדשים לבקרת פתוגנים גדל עם כל התרחבות חדשה של עמידות אנטי-מיקרוביאלית בקרב אוכלוסיית החיידקים 5.
ההערכות הראשונות של אנטי-מיקרוביאלים חלבונים שהתגלו לאחרונה כוללות קביעת המאפיינים הפיזיקליים הבסיסיים הטבועים באנזים. שיטות לסינון מהיר של אנטי-מיקרוביאלים פוטנציאליים מאפשרות בחירת מועמדים בעלי פעילויות הידרוליטיות כנגד מצעי המטרה הרצויים. בדיקת דיפוזיה של מיקרו-שקופיות ובדיקת שחרור הצבע הכמותית מאפשרות שימוש במגוון מצעים בזיהוי הידרוליזה אנזימטית. עבור אנזימים אנטי-מיקרוביאליים חלבונים בעלי פעילות כנגד דופן תא החיידק, הרבגוניות של בדיקות אלה מאפשרת סריקה מהירה ויעילה, איכותית וכמותית כנגד תאי חיידקים ברי קיימא (בדיקת מיקרו-שקופיות בלבד), מצעי תאי חיידקים שלמים שנהרגו בחום, או פפטידוגליקן מטוהר מחיידק המטרה. לבדיקות אלה יש תועלת בגילוי אנזימים אנטי-מיקרוביאליים לשימוש בתחומים כגון טיפולים אלטרנטיביים, תוספי מזון ומעכבים של ייצור ביופילם.
בדיקת דיפוזיה של מיקרו-שקופיות ובדיקת שחרור הצבע הן שיטות מודגמות לזיהוי ואפיון של חלבונים אנטי-מיקרוביאלים חדשים. מבחן דיפוזיה של מיקרו-שקופיות מספק אומדן יחסי (איכותי) של הפעילות האנטי-מיקרוביאלית ומאפשר הסקה מינימלית של ריכוז האנזים ופעילותו. באמצעות שיטה זו, הפעילות מדומיינת בקלות כהתפתחות של אזור ליזה עם היעדר פעילות וכתוצאה מכך חוסר היווצרות אזור. קצב התפתחות האזור וקוטר האזור מעידים על כמות וטוהר האנזים הקיים בדגימה; עם זאת, קצב זה ואיכות פינוי המצע בתוך האזור יכולים להיות מושפעים גם מנוכחות מזהמים, שלמות תגובת ההידרוליזה וסוג המצע. מזהמים מפריעים יכולים להשפיע על קצב דיפוזיה של האנזים מהבאר, בעוד שהידרוליזה לא שלמה או וריאציה של סוג המצע עלולים לגרום לאזור עכור של ליזה 6.
בדיקת שחרור הצבע מעריכה כמותית את כמות תוצרי הצבע הכחול המבריק של Remazol המקושרים קוולנטית המשתחררים לסופרנטנט התגובה מהמצע שעבר הידרוליזה אנזימטית. לשיטה יש שונות קלה בלבד הקשורה להבדל במצע, ובכך מאפשרת רגישות רבה יותר לזיהוי הידרוליזה בהשוואה לבדיקת דיפוזיה של מיקרו-שקופיות. תכונות אלו מאפשרות לשיטה להיות שימושית באפיון התכונות הביוכימיות של האנזים ובסטנדרטיזציה של הבדיקה להשוואה בין אנזימים אנטי-מיקרוביאליים שונים.
בפרוטוקול זה, אנו מספקים שיטות לביצוע בדיקת דיפוזיה בסיסית של מיקרו-שקופיות ובדיקת שחרור צבע, תוך הדגמת קנה המידה של גבולות הזיהוי והשונות עבור כל אחד מהם. הבדיקות משמשות לביצוע הערכות בסיסיות של חלבון אנטי-מיקרוביאלי לא ידוע המטוהר מתרבית של חיידק אדמה מבודד לא מאופיין. פעילויות שנצפו כנגד מצעי תאים חיידקיים בתוך הבדיקות מאפשרות השוואה של פעילויות תגובה בין חלבון אנטי-מיקרוביאלי שלא אופיין בעבר לבין α-כימוטריפסין, אנזימי פרוטאוליט בקרה. פרוטוקולים אלה מספקים בסיס ליישום שתי הטכניקות הניתנות להרחבה ושינוי כדי להתאים ליישומים מגוונים.

<table><tbody><tr><td>מיקרופלייט עם תחתית שטוחה 48 בארות עם מכסה אידוי נמוך</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>3078</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופלייט עם תחתית שטוחה 96 בארות (Costar 3595)</td><td>קורנינג, בע"מ.</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP162-100</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-chymotrypsin</td><td>MP Biomedicals</td><td>215227205</td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis 168</td><td>American Type Culture Collection</td><td>23857</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cork Borer</td><td>Humboldt</td><td>H-9661</td><td></td></tr><tr><td>lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-1G</td><td></td></tr><tr><td>תקן שקילות מקפרלנד (2.0)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>R20412</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-שקופיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-38-103</td><td></td></tr><tr><td>מרק תזונתי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S25959B</td><td></td></tr><tr><td>פפטידוגליקן של Bacillus subtilis 168</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>69554-10MG-F</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (1x)</td><td>Teknova</td><td>P0200</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA ערכת בדיקת חלבון</td><td>Life Technologies</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Synergy HT ספקטרופוטומטר מיקרופלייט</td><td>BioTek Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Remazol צבע R כחול מבריק (RBB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8001</td><td></td></tr><tr><td>סלמונלה אנטריקה, subsp. enterica</td><td>, אוסף תרבות סוג אמריקאי</td><td>10708</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S227-100</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד (NaOH)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>טיטר צמרות סרט פוליאתילן דבק חתוך מראש</td><td>ביוטכנולוגיה מגוונת</td><td>T-TOPS-50</td><td></td></tr><tr><td>מים מזוקקים UltraPure</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אגרוזה 50 מ"ל PBS 0.25 גרם אגרוז</td><td></td><td></td><td>הוסף 10% נתרן אזיד לתמיסת PBS מותכת</td></tr><tr><td>מרק מזין בינוני 4 גרם מרק מזין 500 מ"ל מים</td><td></td><td></td><td></td>מסוג I</tr><tr><td>250 מ"מ תמיסת נתרן הידרוקסיד (NaOH) 1 גרם NaOH 99 מ"ל מים</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>מסוג I200 מ"מ צבע R כחול מבריק רמזול (RBB) 1.25 גרם RBB 98.75 מ"ל 250 מ"מ תמיסת</td><td></td><td></td><td></td> NaOH</tr></tbody></table>

מבחנים איכותיים וכמוני עבור זיהוי ואפיון של antimicrobials החלבון

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

הערכות ראשוניות של ספריות מיקרוביאליות גדולות עבור יצרנים פוטנציאליים של חלבונים אנטי-מיקרוביאליים חדשים דורשות שיטות איכותיות וכמותיות לסינון אנזימי מטרה לפני השקעת מאמץ ומשאבים מחקריים גדולים יותר. מטרת פרוטוקול זה היא להדגים שתי בדיקות משלימות לביצוע הערכות ראשוניות אלה. בדיקת דיפוזיה של מיקרו-שקופיות מספקת מסך זיהוי ראשוני או פשוט כדי לאפשר הערכה איכותית ומהירה של פעילות פרוטאוליטית כנגד מערך של מצעי מטרה חיידקיים וחיידקיים שנהרגו בחום. כמקבילה, הרגישות והשחזור המוגברים של בדיקת שחרור הצבע מספקים פלטפורמה כמותית להערכה והשוואה של השפעות סביבתיות המשפיעות על הפעילות ההידרוליטית של חלבונים אנטי-מיקרוביאלים. היכולת לתייג מצעי תרבית תאים ספציפיים שנהרגו בחום עם צבע R כחול מבריק של Remazol מרחיבה את היכולת הזו להתאים את מבחן שחרור הצבע כדי לאפיין את הפעילות האנזימטית המעניינת.

<html> את assay דיפוזיה microslide ואת assay צבען שחרור כמותית הם שיטות יעילות לסינון ומדידת תחקיר ראשוני של antimicrobials החלבון החדש. יש assay כל יתרונות ומגבלות; עם זאת, כאשר היא מבוצעת בשיתוף, הם מאפשרים סינון ראשוני מהיר ואפיון בסיסי של מיקרוביאלית. את assay דיפוזיה microslide מאפשר ביעילות להקרנה מהירה של ספריות מיקרוביאלי, ייצור antimicrobials חלבון. כאשר רמות ריכוז האנזים הן בעלי העניין, רגישות של אילוצי זיהוי עלולה להגביל את assay, הדורשת כמות גדולה יותר של אנזים שיתווסף התגובה היטב מאשר assay צבען השחרור. כמו באיור 1, המאפיינים האיכותיים של assay לאפשר לצופה להשוות כמויות אנזים ביחס נוכחיות בתוך כל טוב. together.within-page = &quot;1&quot;&gt; ב אזור הפיתוח של התפרקות באיור 1A (25 מיקרוגרם של אנזים), את הקצה המוביל של האזור מציג תמוגה עכורה או לא שלמה של המצע, בזמן שהאזור קרוב הבאר מציג תמוגה מצע שלם יותר. תופעה זו, תוצר של הריכוז הפוחת של האנזים לשדר בחוד החנית, מסבכת את המדידה המדויקת של קוטר האזור. ככל B בארות (15 מיקרוגרם), C (10 מיקרוגרם), ד &#39;(5 מיקרוגרם), E (1.0 מיקרוגרם), ו- F (0.1 מיקרוגרם) הם נצפו באיור 1, בקוטר של אזור לתמס המלא מתפוגג להכחדה התאמת לסכום של אנזים המופחת. למצב F (0.1 מיקרוגרם), ריכוז האנזים בתוך agarose נמוכה מהגבול שיאפשר האנזים לשדר להיות דמיינו כפי שהוא נע דרך agarose, hydrolyzing המצע. את assay דיפוזיה microslide היה גם להפעיל באמצעות pepti subtilis Bacillus מטוהריםdoglycan כמו מצע (איור 2). בזמן שהאזור פחות מוגדר מאלה שנצפו עם enterica כל תא סלמונלה בשל הרתיעה של פפטידוגליקן להשעות באופן שווה ב agarose, הידרוליזה של פפטידוגליקן ידי האנזים מיקרוביאלית הידוע ניכרת. את assay צבען שחרורו הוא assay רגיש יותר תכליתי מאשר assay דיפוזיה microslide, המאפשר להגביל את גילוי נמוך וריאציה של גורמים סביבתיים המשפיעים על תגובת האנזים. ב מבחני נציג, הטמפרטורה היתה מגוונת כדי לקבוע את הטמפרטורה האופטימלית עבור האנזים מיקרוביאלית, נחושה בדעתה להיות 35 מעלות צלזיוס PBS (איור 3). אופטימלי זה נראה בבירור את supernatants התגובה כפי כמויות מוגברות של צבע הכחול (איור 3) וכן ייצג ביחידות פעילות הנגזר ממדידות ספיגות ב 595 ננומטר (איור 3 א). הצדדי של assay צבען השחרור מאפשר לחוקר להשתנות לא רק טמפרטורות אלא גם למאגר התגובה ורכיבי חיץ כדי לקבוע תנאי דגירה אופטימליים במהירות עבור אנזים נתון. רמת הפעילות של האנזים מיקרוביאלית הידוע (איור 4) ואת אנזים שליטת chymotrypsin α (איור 5) נמדדה בטמפרטורת הדגירה אופטימלית נקבעה 35 מעלות צלזיוס PBS נגד subtilis Bacillus שכותרתו RBB מצע חום-הרג. השוואת תוצאות איור 4 ואיור 5 עולה כי האנזים מיקרוביאלית הידוע יש כמעט פי שתיים הזיקה B. מצע subtilis. בנוסף, השליטה α-chymotrypsin לא לגמרי לעכל את B.-נהרג חום subtilis מצע בתוך הבאר (מידע לא מוצג). הפעילות של שליטת chymotrypsin α מתחילה צלחתau סביב 0.3 מיקרוגרם לעומת המשך עליית יחידות פעילות בכל כמויות האנזים עבור האנזים מיקרוביאלית הידוע (איור 4 ואיור 5). הדבר עשוי להעיד כי האנזים הידוע יש פעילות מתמשכת יותר או שיש מספר גדול יותר של אתרים מחשוף לרשות האנזים בתוך B. מצע subtilis. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig1.jpg" /> איור 1:. פעילות האנזים נגד התשתית שלמות התא enterica סלמונלה את assay דיפוזיה microslide שימש איכותית כדי להעריך את פעילותו של חלבון ידוע מיקרוביאלית נגד subsp enterica סלמונלה-נהרג חום enterica (ATCC 10708).. המוני החלבון של מיקרוביאלית הידועה המרחפים פוספט שנאגר מלוח (PBS) כי נוספו בארות בהתאמה שלהשקופיות כלל 25 מיקרוגרם (באר), 15 מיקרוגרם (טוב B), 10 מיקרוגרם (גם C), 5 מיקרוגרם (טוב D), 1 מיקרוגרם (גם E), ו -0.1 מיקרוגרם (טוב F). PBS לבד שמש הבקרות השליליות של המבחנים. האזורים לתמס הם צלמו לאחר דגירת hr 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig2.jpg" /> איור 2:. פעילות האנזים נגד subtilis Bacillus פפטידוגליקן Cell החומה assay דיפוזיה microslide שימש איכותית להעריך את פעילותו של חלבון ידוע מיקרוביאלית נגד פפטידוגליקן של Bacillus subtilis 168. נתלה ב 20 μl של PBS, 10 מיקרוגרם של מיקרוביאלית הידועה התווסף גם א &#39;של microslides. PBS לבד שמש שלילימלא עבור assay (טוב B). אזור לתמס היה צלם לאחר דגירת 6 שעות על 37 מעלות צלזיוס. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig3.jpg" /> איור 3:. טמפרטורת תגובה אופטימלית של חלבון אנטימיקרוביים הרבגוניות של assay-השחרור לצבוע מאפשרת הווריאציה של פרמטרים פיסיקליים וכימיים, כגון טמפרטורות דגירה או מאגר, כדי לקבוע ההשפעות שלהם על פעילות אנזים עניין 6. כפי שמודגם באיור זה, על פעילות מיקרוביאלית החלבון הידועה (1 מיקרוגרם) הוערכה ב PBS נגד RBB שכותרתו שחוט חום subtilis Bacillus תחת מגוון של טמפרטורות דגירה. מוצג כיחידות פעילות (AU) ב (א), ספיגת-b RBBound מוצרים מתפזרים supernatant לאחר הידרוליזה נמדדה ב 595 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר microplate. בכל מצב טמפרטורה, תגובות ללא אנזים הוסיף שמשו להפחית את ההשפעות של כל צבע שוחרר נובעות דגירה בטמפרטורה השונה. את supernatants התגובה מתאים לכל אחד טמפרטורת דגירה הם צלמו לפני המדידה ספיגה (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig3large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig4.jpg" /> איור 4:. טווח פעילות של חלבון אנטימיקרוביים טווח הפעילות עבור מיקרוביאלית החלבון הידועה נמדד כיחידות פעילות לאחר incubations הלילה עבור 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, ו -1,000 ng , כפי שהיא נמדדת על ידי prot BCAassay עין (א). לתגובות אלו, RBB שכותרתו B. subtilis מצע הרמה הוגדלה לתת צפיפות אופטית של 5.0 ב 595 ננומטר על מנת להבטיח כי התגובה עם הסכום הגבוה ביותר של אנזים (1,000 נ&quot;ג) לא לגמרי hydrolyze כל המצע הזמין בתוך תקופת דגירת תגובה. תגובות שליטות ללא אנזים הוסיף שמשו להפחית את ההשפעות של כל צבע שוחרר הנגרם על ידי הדגירה לבד. את supernatants התגובה מתאים לכל אחד מסכומי אנזים הם צלמו לפני מדידות ספיגות (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig4large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig5.jpg" /> איור 5:. טווח פעילות עבור α-chymotrypsin טווח הפעילות-chymotrypsin α נמדד כמו Activיחידות ity לאחר incubations לילה עבור 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, ו -1,000 ng של האנזים (א). לתגובות אלו, RBB שכותרתו B. subtilis מצע הרמה הוגדלה לתת צפיפות אופטית של 5.0 ב 595 ננומטר על מנת להבטיח כי התגובה עם הסכום הגבוה ביותר של אנזים (1,000 נ&quot;ג) לא לגמרי hydrolyze כל המצע הזמין בתוך תקופת דגירת תגובה. תגובות שליטות ללא אנזים הוסיף שמשו להפחית את ההשפעות של כל צבע שוחרר הנגרם על ידי הדגירה לבד. את supernatants התגובה מתאים לכל אחד מסכומי אנזים הם צלמו לפני מדידות ספיגות (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig5large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לסינון ואפיון מהיר של אנזימים לפעילות אנטי-מיקרוביאלית. בדיקת דיפוזיה של מיקרו-שקופיות ובדיקת שחרור הצבע משתמשות במצעי חיידקי מטרה להערכת פעילות אנזימטית איכותית וכמותית.

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

המטרה הכוללת של ניסויים אלה היא לסרוק ולאפיין במהירות אנזימים בעלי פעילות אנטימיקרוביאלית. לבדיקת הדיפוזיה על מיקרוסלייד (microslide diffusion) ובדיקת שחרור הצבע (dye-release assay) יש תועלת בגילוי תפקודי של חומרים אנטימיקרוביאליים חדשים בעלי פעילות ליטית נגד מטרות ספציפיות, כגון חיידק פתוגני רלוונטי. היתרונות המרכזיים של טכניקות אלו הם פשטות הביצוע, גמישות בשינוי פרמטרים ניסויים והיכולת לבצען באמצעות ציוד מעבדה הנמצא ברוב מעבדות המיקרוביולוגיה.לפני תחילת בדיקת הדיפוזיה במיקרו-שקופית (microslide diffusion assay), יש לקבוע את ריכוזו של האנזים האנטי-מיקרוביאלי שייבדק באמצעות ערכת BCA protein assay, בהתאם לפרוטוקול היצרן. בצעו דילול סדרתי של האנזים האנטי-מיקרוביאלי, תוך שימוש ב-PBS כבופר לתגובה. העבירו את החלבון למבחנות מיקרו-צנטריפוגה נפרדות והביאו את הנפחים ל-20 milliliters באמצעות PBS.בשלב הבא, הכינו תמיסת agarose בריכוז 0.5% על ידי המסה של 0.25 גרם agarose ב-50 מיליליטר של PBS. חממו את התמיסה עד לרתיחה, עד להמסה מלאה של ה-agarose. קבעו את כמות המים שאבדו במהלך תהליך ההמסה לפי משקל, והוסיפו אותם בחזרה לתמיסה.כדי למנוע צמיחה של חיידקים מזוהמים במהלך הדגירה של הבדיקה, יש להוסיף 15 µL של 10% sodium azide במים לתמיסת האגרוז, ולהביא את טמפרטורת התמיסה ל-50 °C באמבט מים. אם נעשה שימוש בתאים חיים כסובסטרט, יש להשמיט את ה-sodium azide מתמיסת האגרוז. יש להפשיר את הסובסטרט החיידקי שהורג בחום על קרח.שחזור את תסביב החיידקים ב-12 milliliters של תמיסת האגרוז עד להשגת עכירות התואמת בקירוב לסטנדרט עכירות של 2.0 McFarland. השווה את העכירות של התמיסות על ידי התבוננות בקו שחור על רקע לבן דרך התמיסות, והוסף תסביב חיידקים לאגרוז עד להשגת העכירות המקורבת. באופן מיידי אך זהיר, העבר בפיפט 3 milliliters של תמיסת תסביב האגרוז לכל מיקרו-שקופית, תוך הקפדה שהתמיסה לא תגלוש מהמיקרו-שקופית.לאחר שהשקופיות התגבשו, השתמשו במנקב שעם בקוטר 4.8 מילימטר כדי להכין שלוש בארות בשכבת תשת האגרוז של כל מיקרו-שקופית. הוסיפו 20 µL מכל דילול סדרתי של חלבון שעבר התאמה לבאות המתאימות. השתמשו ב-bovine serum albumin בבאר של ביקורת שלילית.כביקורת חיובית, השתמש באנזימים בקטרליטיים ידועים המתאימים לסובסטרט, כגון ליזוזים. דגור את השקופיות בתא לחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, או בטמפרטורת הפעילות האופטימלית של האנזים. משך הדגירה תלוי בריכוז ובפעילות הסגולית של האנזים האנטימיקרוביאלי.זמן תגובה טיפוסי הוא כ-16 שעות. עם השלמת הדגירה, בחנו את השקופיות תחת תאורה עקיפה וצלמו את הבדיקה המתפתחת. השתמשו במצלמת DSLR עם עדשה בעלת אורך מוקד של 60 מילימטר במרחק מיקוד של כ-30 סנטימטרים.בבדיקת שחרור הצבע שתוצג בסגמנט הבא, התסבסוב מקושר קוולנטית לצבע Remazol Brilliant Blue R או RBB. התחילו את הפרוטוקול זה בהכנת תמיסת RBB בריכוז 200 milliMolar. המיסו 1.25 גרם של RBB בתמיסת נתרן הידרוקסיד שהוכנה זה עתה.בשלב הבא, השביה מחדש תאי חיידקים שהורגו בחום בריכוז של 0.5 גרמים משקל רטוב ב-30 מיליליטר של תמיסת RBB. עבור פפטידוגליקן מבודד, השביה מחדש את הפפטידוגליקן בריכוז של 0.3 גרמים משקל רטוב ב-30 מיליליטר של תמיסת RBB. מכיוון שהשלבים הבאים זהים ללא קשר לסובסטרט שבו נעשה שימוש, הסימון יודגם עבור תאי החיידקים בלבד.דגרו את תערובת התגובה על פלטפורמה מסתובבת למשך שש שעות בטמפרטורה של 37 °C עם ערבוב עדין. לאחר שש שעות, העבירו את תערובת התגובה למדגרה בטמפרטורה של 4 °C ודגרו למשך 12 שעות נוספות עם ערבוב עדין. עם סיום הדגירה, אספו את התססית הצבועה באמצעות סבוב במערך צנטריפוגה ב-3000 x g למשך 30 דקות.שפכו את תמיסת הצבע מהמשקע של התשתית. השעיקו את המשקע באופן יסודי במים מסוג Type I ולאחר מכן בצעו צנטריפוגה. שטפו את התאים המסומנים בצבע בשלוש עד חמש פעמים באופן זה כדי להסיר צבע מסיס שאינו קשור באופן קוולנטי מהתשתיות.עבור השטיפות הסופיות, העבירו את חלק המשקע שישמש בבדיקת שחרור הצבע למבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 milliliters. הנוזל העליון של השטיפה האחרונה צריך להיות צלול בעוד שהסובסטרט נשאר כחול. אחסנו את הסובסטרט הצבוע כשהוא תלוי בכמות מינימלית של מים בטמפרטורה של 20 °C עד למועד השימוש.כדי להתכונן לבדיקת שחרור הצבע, יש להמתין שהמצע הצבוע הקפוא יגיע לטמפרטורת החדר, ולשטוף אותו פעמיים עם באפר הבדיקה שנקבע באופן אמפירי עבור האנזים. במקרה זה נעשה שימוש ב-PBS. חשבו את נפח תמיחת המצע הדרוש על ידי הכפלת נפח התגובה של 200 microliter במספר בדיקות שחרור הצבע שיבוצעו.להכנת תרחיף הסובסטרט, הוסיפו תחילה את הסובסטרט הצבוע לנפח המתאים של PBS. בצעו דילול ביחס של אחד לאחד, ומדדו מדידה ראשונית של הצפיפות האופטית ב-595 nanometers, כאשר PBS משמש כבנק (blank). הוסיפו כמויות הדרגתיות של הסובסטרט הצבוע לתרחיף עד להשגת צפיפות אופטית של 2.0 ב-595 nanometers.בהדגמה זו, ייעשה שימוש בבדיקת שחרור צבע כדי לקבוע את תנאי הדגירה האופטימליים עבור חלבון אנטימיקרוביאלי. ראשית, הכין תמיסת אם של חלבון אנטימיקרוביאלי על ידי התאמת הריכוז ל-1 mg/mL באמצעות PBS כפי שמתואר בטקסט של הפרוטוקול. לאחר מכן, דלל את תמיסת האם של החלבון האנטימיקרוביאלי לריכוז של 100 ng/µL.ריכוז זה נותן מסה סופית של מיקרוגרם אחד של חלבון לנפח שנוסף לתגובת הבדיקה. בצע את בדיקות התגובה בפרוטוקול בתוך מבחנות מיקרו-צנטריפוגה בנפח של 0.5 מיליליטר עבור טווח הטמפרטורות שייבדק. עבור כל תנאי תרמי, הוסף 10 מיקרוליטר של חלבון המלאי ל-200 מיקרוליטר של תרחיף סובסטרט שהוכן.הדגירה תתבצע בטרמיקלר למשך שמונה שעות, עם ערבוב על ידי היפוך פעם בשעה. לאחר ההדגירה, יש לעצור את התגובות על ידי הוספת 25 microliters של אתנול לכל מבחנה למיקרוצנטריפוגה. להסרת סובסטרט בלתי ממיס שלא עוכר, יש לצנטריפוג ב-3000 x g למשך שתי דקות.לאחר מכן, תוך הקפדה שלא להפריע למשקע של התסס המצע שלא התעכל, העבירו 150 microliters מהנוזל העליון של התגובה עבור כל תערובת תגובה לפלטת מיקרו עם 96 בארות בעלות תחתית שטוחה. כדי לכמת את הפעילות האנזימטית, השתמשו בספקטרופוטומטר של פלטת מיקרו למדידת הבליעה של הנוזל העליון באורך גל של 595 nanometers. עלייה בבליעה כתוצאה מהצבע המסיס ששוחרר אל הנוזל העליון מהמצע המסומן מהווה מדידה כמותית של הפעילות האנזימטית.בדיקת דיפוזיה על גבי שקופית מיקרוסקופית שימשה להערכה איכותנית של הפעילות של חלבון אנטימיקרוביאלי לא ידוע כנגד תמיסות תאי שלמות של Salmonella enterica שהורגו בחום. החומר האנטימיקרוביאלי הוסף בכמויות עולות בבארות A עד F, ו-PBS שימש כביקורת שלילית. לאחר שש שעות, נבחן גודל אזור ההידרוליזה השקוף שהיווצר סביב כל בארה.פעילות אנזימטית גבוהה קשורה באופן איכותי לאזור גדול יותר, בעוד שפעילות אנזימטית נמוכה קשורה באופן איכותי לאזור קטן יותר. בדיקת שחרור הצבע הכמותית שימשה לקביעת טמפרטורת התגובה האופטימלית עבור חלבון אנטימיקרוביאלי. כפי שעולה מכמויות הצבע הכחול בעילי התגובה, וממיחידות הפעילות שנגזרו ממדידות הבליעה ב-595 ננומטר, 35 degrees Celsius היא הטמפרטורה האופטימלית.בדיקת שחרור הצבע שימשה גם לקביעת טווח הפעילות של חלבון אנטימיקרוביאלי לא ידוע כנגד תשתית של *Bacillus subtilis* שהורגה בחום. השוואה לטווח הפעילות של alpha-chymotrypsin גילתה כי לאנזים האנטימיקרוביאלי הלא ידוע יש זיקה גבוהה כמעט פי שניים לתשתית. בנוסף, בעוד שפעילות ה-alpha-chymotrypsin מתחילה להגיע לרמה קבועה סביב 0.3 micrograms, פעילות האנזים הלא ידוע המשיכה לעלות בכל כמויות האנזים.לאחר שהשיטה נלמדה, ניתן להשלים את בדיקת הדיפוזיה במיקרו-שקופיות (microslide diffusion assay) תוך 30 דקות. את בדיקת שחרור הצבע ניתן להשלים תוך שעה אחת. זמני הדגירה עבור כל בדיקה יהיו תלויים בפעילות האנזימטית ובריכוזיהם.כהמשך לנהלים אלו, ניתן להתאים את שיטת שחרור הצבע כדי לקבוע את ההשפעות הכימיות המשפיעות על הפעילות האנזימטית של האנזים האנטי-מיקרוביאלי, על ידי מניפולציה של היבטי התגובה כגון ה-pH של התמיסות המגבירות (buffer) והמליחות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן הסריקה והאפיון המהירים של אנזימים לפעילות אנטי-מיקרוביאלית באמצעות בדיקות דיפוזיה במיקרו-סלייד ושחרור צבע.

qualitative-quantitative-assays-for-detection-characterization

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים את בדיקת שחרור הצבע לכימות הפעילות האנזימטית של חלבונים אנטי-מיקרוביאליים. החלבון האנטי-מיקרוביאלי מפרק את דופן התא המסומנת בצבע של החיידק ומשחרר את מולקולות הצבע והופך את התמיסה לכחולה. ספיגת התמיסה מתואמת עם הפעילות האנזימטית של החלבון האנטי-מיקרוביאלי.

בדיקת שחרור צבע לכימות הפעילות האנזימטית של חלבונים אנטי-מיקרוביאליים

רכשה עמידות לאנטיביוטיקה היא בעיה בריאות ציבורית גדולה והיא מדורגת כיום על ידי ארגון הבריאות העולמי כאחת הסכנות הגדולות ביותר לחיי אדם. כאן אנו מתארים את השימוש בטכנולוגית שלוחה לכמת התנגדות אנטיבקטריאלי, קריטית לגילוי של סוכני רומן ורבי עוצמה נגד multidrug חיידקים עמידים.

Nanomechanics של אינטראקציות סמים היעד ואיתור התנגדות אנטיבקטריאלי

בדיקה בתפוקה גבוהה בזמן אמת פותחה כדי לזהות בו זמנית (1) אנטי-מיקרוביאלים חודרי תאים אוקריוטיים המכוונים לפתוגן חיידקי תוך תאי, ו-(2) להעריך ציטוטוקסיות של תאים אוקריוטיים. וריאציה על אותה טכנולוגיה שולבה לאחר מכן עם טכנולוגיית חלוקה דיגיטלית כדי לאפשר מחקרי סינרגיה קלים, ברזולוציה גבוהה, מינון-תגובה וסינרגיה דו-ממדית ותלת-ממדית.

תפוקה גבוהה, בזמן אמת, בדיקת Dual-readout של פעילות מיקרוביאלית תאיים Cytotoxicity Cell איקריוטיים

אנו מתארים שיטה פשוטה לסינון תרביות חיידקים לייצור תרכובות מעכבות כלפי חיידקים אחרים.

השימוש בטכניקת הכיסוי הרך-אגר למסך תרכובות מעכבות הופקו bacterially

כאן, אנו מתארים assay כרומטוגרפי בשילוב עם ההפרדה ניידות יון של פפטיד מבשרי ואחריו ברזולוציה גבוהה (~ 30,000) MS-הזיהוי של פפטיד קטעים על כימות של פפטיד מחודדים הסטנדרטים של נוגדן חד שבטי תקציר.

וזמינותו HS-MRM עבור כימות של התא המארח חלבונים בחלבון ביופרמצבטיקה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית יון ניידות QTOF ספקטרומטר מסה

מאמר זה מתאר שיטה microarray חלבון עבור פרופיל החיסונית ההורמונאלית, התגובות פאנל 7-ה-plex של מאוד מטוהרים Clostridium difficile אנטיגנים של sera אנושי. ניתן להאריך את הפרוטוקול מצפני תגובות נוגדנים ספציפיים בהכנות של ורידי polyclonal.

שיטת Microarray לקביעת סרולוגית לזיהום Clostridium difficile נוגדן התגובות הבאות אנטיגן ספציפי

הפרוטוקול מציג את Escherichia coli-המבוסס על הלחץ הסלקטיבי השתלבות של חומצות אמינו קאנונית (ncAAs) nisin פפטיד מיקרוביאלית lactococcal. ניתן לשנות את מאפייניו במהלך רקומביננטי ביטוי באמצעות החלפת עם ncAAs הרצוי בתקשורת צמיחה מוגדרים. השינויים הנובעים מכך באתריים ממופים על ידי הצמיחה עיכוב מבחני פלורסצנטיות מיקרוסקופ.

פפטידים מיקרוביאלית המיוצר על ידי ההתאגדות הלחץ הסלקטיבי של חומצות אמינו קאנונית

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד וזיהוי של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה ממים ולאפיון המולקולרי של גני העמידות לאנטיביוטיקה שלהם (ARGs). השימוש בטכניקות מבוססות תרבית ולא מבוססות תרבית (ניתוח מטגנומי) מספק מידע מלא על מגוון החיידקים הכולל ועל המאגר הכולל של ARGs שונים הנמצאים במים מתוקים ממומבאי, הודו.

בידוד וזיהוי חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה במים ואפיון מולקולרי של גני העמידות לאנטיביוטיקה שלהם

מחקר זה פיתח בדיקה לסינון בתפוקה גבוהה נגד Mycobacterium abscessus עם זן כפול של כתב שנוצר לאחרונה, תוך שימוש בפלואורסצנטיות ולומינסנציה כדי להעריך את כדאיות החיידקים במהירות. פרוטוקול זה יהיה רלוונטי לחוקרים השואפים לסנן תרופות חדשות נגד חיידק עמיד לתרופות.

פיתוח Assay לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה נגד מיקובקטריה

פרוטוקול זה מתאר גישה פשוטה דבק, סרט המבוסס על מדגם של עגבניות ושאר משטחים תוצרת טרייה, ואחריו איתור מהיר של כל...

שילוב של הדגימה דבק קלטת מבוססי פלואורסצנטי באתרו הכלאה עבור איתור מהיר של סלמונלה על תוצרת טרייה

למדו פרוטוקולים לסינון מהיר ואפיון אנזימים לפעילות אנטי-מיקרוביאלית באמצעות מבחני דיפוזיה ושחרור צבע. שיטות אלו מאפשרות הערכה איכותית וכמותית של פעילות אנזימטית נגד חיידקים פתוגניים.

מבחנים איכותיים וכמוני עבור זיהוי ואפיון של antimicrobials החלבון

גלה סרטונים נוספים