למה כימות Matters: אפיון פנוטיפים בבית תסיסנית זחל Neuromuscular צומת

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא להראות כיצד לבצע ניתוחים כמותיים של תכונות אנטומיות. מודגם כימות של פנוטיפים המשפיעים על המורפולוגיה, הגודל והמיקום של הגרעינים עם השרירים המפוספסים של זחלי דרוזופילה. הבנת המנגנון המולקולרי השולט במורפולוגיה, בגודל ובהתפלגות של אברונים תוך-תאיים היא אחת השאלות החשובות ביותר של הביולוגיה המודרנית.

בעבר, וריאציות מורפולוגיות בין ובתוך קבוצות ניסוי היו נתונות לניתוח איכותני בלבד. כאן אנו מציעים, בניתוח כמותי המשלב את הגנטיקה של הדרוזופילה עם ניתוח כמותי מורפומטרי לזהות גנים השולטים בגודל, צורה ופיזור של גרעינים בתוך השרירים. תעזור בהדגמת ההליך ליירה לדהבסקי, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי.

לאחר ניתוח וצביעה של הצמתים העצביים-שריריים של הזחל לפי פרוטוקול הטקסט, השתמש במלקחיים כדי להסיר את הדגימות מצינור המיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר, ולהניח אותן על שקופית עיבוד. בעזרת מספריים מיקרו דיסקציה, חותכים את הראש והזנב מהפילים ושומרים על המשטחים הפנימיים שלהם למעלה. כעת, הכינו שקופית הרכבה על ידי עטיפת שלוש רצועות סרט תאית סביב מגלשה נקייה, במרחק של סנטימטר אחד זה מזה.

הנח את החלקת הכיסוי מעל הפער המסופק הזה כדי שלא ישטיח את הדגימות. לאחר מכן, הפקידו כ -20 מיקרוליטר של מדיום ההרכבה בין רצועות סרט התאית ופזרו את המדיום סביב בעזרת מלקחיים נקיים. כעת הסר את הרקמה הנוספת מההכנות.

גרור את הזחלים המנותחים משקופית העיבוד אל מגלשת ההרכבה ואל מדיום ההרכבה, תוך שמירה על המשטח הפנימי למעלה. לאחר מכן, מרחו בעדינות החלקת כיסוי והקפידו להימנע מלכידת אוויר. לאחר מכן אטמו את השקופית בלכה שקופה ותנו לשקופית להתייבש לפחות 10 דקות לפני ההדמיה.

לצורך ניתוח זה, השתמש בתמונות קונפוקליות המציגות את שרירי דופן גוף הזחל המוכתמים בנוגדני DeVAP, נוגדני למין וסמן גרעיני. לאחר מכן גרור ושחרר את תמונות מחסנית Z קונפוקליות לזירה. לחץ פעמיים על התמונות כדי לפתוח אותן באופן אוטומטי בתצוגת העלייה, אליה ניתן לגשת באמצעות סמל סרגל כלים.

לתצוגת ה-Surpass יש שלושה לוחות עיקריים של חלל עבודה. אזור תצוגה, רשימת אובייקטים ואזור מאפייני אובייקט. לאחר מכן, לחץ על סמל התצוגה התלת-ממדית כדי ליצור תמונה תלת ערוצית מעובדת בנפח.

לאחר מכן בחר Add New Measurement Points מסרגל הכלים Objects ובצע את Creation Wizard באזור Object Properties. בחר תחילה בכרטיסייה עריכה ולאחר מכן, מתוך ערוץ ספציפי, בחר את הסמן הגרעיני או את ערוץ הלמין כדי להדגיש את הגרעינים. לאחר מכן, הגדר את המצביע למצב בחירה על ידי לחיצה על הכרטיסייה Escape ולאחר מכן התאם את גודל תיבת הסמן התלת-ממדית עם גלגל העכבר כך שיכיל גרעין נתון בתמונה.

הוסף נקודת מדידה על ידי לחיצה ממושכת על מקש Shift ולחיצה שמאלית על אותו גרעין. לאחר מכן, הוסף את הנקודה השנייה על גרעין סמוך של אותו שריר באותה טכניקה. קו יימתח אוטומטית בין שתי הנקודות והמרחק בין שני הגרעינים יוצג ונרשם כמשתנה סטטיסטי.

חזור על ההליך עבור כל הגרעינים המקיפים גרעין נתון. לאחר מכן, מכל נקודות המדידה שנאספו, שנמצאות תחת נתוני מרחק מפורטים בסטטיסטיקה, בחר את המרחק הקצר ביותר. תחת האזור מאפייני אובייקט, בחר באפשרות ייצוא סטטיסטיקה עם תצוגת כרטיסייה לקובץ זמין.

פעולה זו שומרת את הנתונים בגיליון אלקטרוני. לצורך ניתוח זה, השתמש בתמונות קונפוקליות של שרירי דופן הגוף המוכתמים בלמין וסמן גרעיני כדי לדמיין את הגרעינים. כדי להעריך את צורת השרירים יש למדוד את הכדוריות שלהם, המשווה את שטח הפנים הגרעיני לזה של כדור בעל אותו נפח.

לחלופין, מדוד אליפטיות המבדילה בין פרולאט, אובלט או אליפסואידים וספרואידים. פתח את התמונה כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, לחץ על סמל סרגל הכלים אובייקטים הוסף משטחים חדשים.

באשף היצירה שמופיע באזור Object Properties, בחר את צביעת הסמן הגרעיני כערוץ המקור להצגת הגרעין. הגדר את האפשרות עוצמה מוחלטת כסף. ודא שרוב הגרעינים מציגים עיבוד חלק ולא עמוס יתר על המידה על ידי שינוי הערך בעקומת הסף.

יחד עם זאת, הימנע מנוכחות של חורים או מסכות לא שלמות של גרעינים כלשהם. לאחר מכן, השתמש בכלי Filter כדי להסיר רעש מעיבוד פני השטח. תחת הכרטיסייה עריכה של שכבת פני השטח החדשה שנוצרה, פצל את משטחי הגרעינים שעובדו באופן שגוי.

אפשרות נוספת היא למזג את משטחי הגרעינים המעובדים באופן שגוי. ערכי האליפטיות והכדוריות של הגרעינים המעובדים על פני השטח זמינים תחת הכרטיסייה סטטיסטיקה. ייצא נתונים אלה לניתוח.

עבור פרוטוקול זה, השתמש בתמונות קונפוקליות המדווחות על שרירי דופן הגוף המוכתמים בסמן גרעיני ובנוגדנים ספציפיים ללמין ו-DeVAP. פתח את התמונה המעניינת מפריט התפריט הראשי עריכה ולאחר מכן חיתוך תלת מימד. עקוב אחר אשף יצירת פני השטח באמצעות ערוץ הלמין כמתואר בסעיף הקודם.

לאחר יצירת המשטח, לחץ על ערוך באזור מאפייני אובייקטים, ובחר מסכה הכל כדי לבודד אות בתוך הגרעין. לאחר מכן, בחר את אות DeVAP. מהתפריט הנפתח בחר ערוץ לחץ על האפשרות הגדר Voxels Ouside the Surface והפוך את הערך הזה לאפס.

פעולה זו יוצרת ערוץ חדש עם מסיכה הזמין בחלון התאמת תצוגה. כדי להמחיש את נוכחות האות בתוך הגרעין, צור מישור מתאר על-ידי לחיצה על הסמל Add New Clipping Plane מסרגל הכלים Objects. לאחר מכן, התאם באופן אינטראקטיבי את זווית מישור החיתוך ואת מיקומו כדי לדמיין את התפלגות האות בתוך הגרעין.

מוטציות Missense בחלבון B הקשור ל-VAMP האנושי מעורבות בפתוגנזה של ALS. באמצעות השיטה המתוארת, שרירים מפוספסים המבטאים את הגן האורתולוגי של הזבוב DeVAP המכיל את ה-ALS הגורם למוטציה V2601 הושוו לביקורת, המבטאים רמות דומות של DeVAP מסוג פראי, או רמות גבוהות יותר של DeVAP מסוג פראי. ניתוח השכן הקרוב ביותר שימש להערכת התפלגות הגרעינים לאורך סיבי השריר.

בהשוואה לשרירי הביקורת המבטאים את הטרנסגן DeVAP המוטנטי, או אלה המבטאים יתר על המידה את החלבון מסוג הבר, המוטציה המעניינת גרמה להפחתה דרמטית במרחק הממוצע הקצר ביותר בין הגרעינים. לאחר מכן, נבדקה הכדוריות של הגרעינים. נמצא כי טרנסגנים שהפחיתו את מרווח הגרעינים הגדילו גם את נפח הגרעין.

שחזורים תלת-ממדיים ועיבודי נפח של הגרעינים גילו ששרירים המבטאים את המוטציה המעניינת יוצרים אשכולות שהיו ממוקמים בגרעין. ניתן להרחיב שיטה זו גם לניתוח כמותי של מאפיינים מורפולוגיים הקשורים לאברונים אחרים, כגון מיטוכונדריה. שינויים בארכיטקטורה, במיקום ובגודל הגרעין נקשרו להזדקנות ולמספר הפרעות ניווניות, כגון מחלת פרקינסון ו-ALS.

הבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס דיספרקסיס עשויה להוביל לזיהוי מטרות פרמקולוגיות חדשות להתערבויות טיפוליות יעילות.