הדמיה וידאו ומפות Spatiotemporal לנתח תנועתיות מערכת העיכול של עכברים
3 בפברואר 2016
מאמר זה מתאר טכניקת הדמיית וידאו ומיפוי מרחבי-זמני ברזולוציה גבוהה לזיהוי שינויים בוויסות העצבי של תנועתיות המעי הגס בעכברים בוגרים. ניתן לזהות השפעות עדינות על תפקוד מערכת העיכול באמצעות גישה זו בתכשירי רקמות מבודדים כדי לקדם את ההבנה שלנו לגבי מחלות מערכת העיכול.
המטרה הכללית של טכניקה זו היא לזהות שינויים בוויסות העצבי של מוטיליות המעי הגס בעכברים באמצעות דימוי וידאו. טכניקה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח הקשורות לתחום הנוירו-אנטרי (מערכת העצבים האנטרית), כגון האם מוטציות גנטיות עדינות בגנים נוירונליים משפיעות על מוטיליות המעי הגס. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהרקמה מהווה ציסטה בהיעדרו של קלט ממערכת העצבים המרכזית, וכתוצאה מכך השיטה מאפשרת לחקור את מעורבותה של מערכת העצבים האנטרית בבקרת המוטיליות של מערכת העיכול.
טכניקה זו רלוונטית לטיפול במחלות התפתחותיות-נוירולוגיות כגון אוטיזם, שכן מוטציות גנטיות המשנות את התפקוד הסינפטי במוח עשויות לשנות גם את תנועתיות המעי. התחילו בשימוש בפינצטה ומספרי ניתוח כדי לבצע חתך דרך האפידרמיס המכסה את שכבות שרירי הבטן התחתונה. פתחו את חלל הבטן לאורך קו האמצע עד לעצם הסטרנום.
הרטיבו את הרקמה בתמיסת סליין פיזיולוגית והשתמשו בפינצטה כדי להרים בעדינות את העקום (cecum) ארבעה עד חמישה סנטימטרים מעל הבטן. לאחר מכן, באמצעות מספרי ניתוח עדינים, גזמו את הקרום (mesentery), תוך הקפדה לא לגעת, למתוח או לחתוך את רקמת מערכת העיכול. הסירו את השלפוחית, את האשכים וכל רקמה עודפת אחרת.
לאחר מכן, באמצעות מספרי ניתוח גסים, בצעו שני חתכים אנכיים במרחק של כ-0.5 סנטימטר מקו האמצע אל תוך עצם האגן בכל צד של המעי הגס, והשתמשו במספריים עדינים כדי להפריד את החךם מהרקמת האגן הסמוכה. גזרו את הגריד (mesentery) מהמעי הגס ושטפו את רקמת המעי הגס באורכה המלאה בביקר המכיל תמיסת סלין פיזיולוגית. כדי להסיר את גללי הצואה ותכנים מעיים אחרים, גזרו תחילה כסנטימטר אחד מקצה של פיפטה בנפח 200 microliter וחברו את הפיפטה למזרק בנפח חמישה מיליליטר מלא בתמיסת סלין פיזיולוגית.
לאחר מכן, לאחר הסרת העקום (cecum) והחך (rectum), מקם סיכה לחרקים בקצה הפרוקסימלי ביותר של המעי הגס, היכן שפסורי הרירית נראים, כדי להכווין את הרקמה. כעת, אחז בעדינות ברקמה בקצה הפרוקסימלי, הכנס את קצה הפ pipette לתוך הלומן ושטוף את התמיסה המלחית דרך המעי הגס אל תוך מיכל פסולת. לאחר מכן, באמצעות אותה מזרקה וקצה pipette, שטוף כל שאריות מהצינורית המחוברת לאמבט איברים בעל שני תאים באמצעות תמיסה מלחית פיזיולוגית טרייה.
הגדירו את אמבט האיברים כך שהתאים יסופקו באופן רציף בתמיסת סלין פיזיולוגית המבעבעת עם carbogen, והשתמשו במגש טמפרטורה כדי לוודא באופן קבוע שטמפרטורת הסלין נשארת בין 33 ל-37 מעלות צלזיוס. השתמשו בפקק גומי עם צינור זכוכית בעל קוטר פנימי של 5 מילימטרים המוחדר למרכזו כדי לשמור על הלחץ במכל הכניסה. לאחר מכן, טבלו לחלוטין קטע של 5 עד 7 סנטימטרים של מעי גס לתוך תא אמבט האיברים, והשתמשו בפינצטה ובחוט תפירה סטנדרטי מכותנה כדי לבצע קניולציה של הקצה הפרוקסימלי של המעי הגס לצינור הכניסה ושל הקצה הדיסטלי של המעי הגס לצינור היציאה.
לאחר קביעת מרחק הבסיס בין הקנולציות הפרוקסימליות והדיסטליות של המעי הגס, יש להביא את הרקמה לאיזון בסליין פיזיולוגי למשך 30 דקות. להקלטת תנועות המעי, בעוד המעי הגס מסתגל, מקם מצלמת וידאו בגובה 10 עד 15 סנטימטרים מעל אמבט האיברים על סטנד מעבדה סטנדרטי, והגדר את תוכנת לכידת הווידאו המתאימה. כאשר המצלמה מוכנה, הקלט ארבעה קטעי וידאו של 15 דקות של המעי הגס בתנאי בקרה.
לאחר מכן, בצעו סופרפוזיה (superfuse) של התרופה הנבדקת אל תוך אמבט האיבר למשך 30 עד 60 דקות, תוך הקלטה של ארבעה מקטעי וידאו נוספים בני 15 דקות כל אחד. לבסוף, החליפו את תמיסת הטיפול במי מלח פיזיולוגיים טריים והקליטו ארבעה מקטעי וידאו נוספים בני 15 דקות במהלך תקופת השטיפה (wash out) שנמשכת שעה אחת. לאחר מכן ניתן להפיק מפות מרחביות-זמניות של המעי הגס, כמענה לתקופות הטיפול השונות.
כדי להעריך האם מוטציות סינפטיות משנות קומפלקסים מוטוריים נדדים של המעי הגס, או CMMCs, כאשר מערכת העצבים האנטרית מופרעה באופן פרמקולוגי, בניסוי זה, התוסיפ טרופיסטרון (tropisetron), מעכב של קולטני HT3 ו-HT4, לתא אמבט האיבר של הרכב המעי הגס. בנוכחות טרופיסטרון, עכברי NL3R451C הפגינו ירידה בתדירות ה-CMMC בהשוואה לאחיהם מסוג הבר (wild type). למרות שלא נצפו הבדלים משמעותיים ביכולת הכיווץ של עכברי הבר ועכברי NL3R451C בתנאים מבוקרים, טרופיסטרון הפחית באופן משמעותי את תדירות ה-CMMC הן בעכברי הבר והן בעכברי NL3R451C.
יתרה מכך, טרופיסטרון (tropisetron) גרם להשפעה גדולה יותר על תדירות ה-CMMC בעכברי NL3R451C בהשוואה לבעלי חיים מסוג פרא (wild type). לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להשלימה בארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע טכניקה זו, ודא שמרחץ האיבר מוחזק בטמפרטורה קבועה, שיש לו אספקה רציפה של קרבוגן, וכי גלישת מי מלח פיזיולוגיים נמנעת על ידי ואקום.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע טכניקות אחרות, כגון אימונוציטוכימיה, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון האם קיימים שינויים בפרופורציות הנוירונליות או במספר התאים בעכברים המראים מוטיליות מעويه משובשת? מאחר שפיתוחו בשיטה זו אפשר מגוון של מחקרים על מוטיליות המעי בחזירי גינאה, ארנבים, חולדות ומינים אחרים, ובמיוחד במקרה זה בעכברים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן זיהוי שינויים בוויסות הנוירונלי של מוטיליות המעי באמצעות דימות וידאו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר טכניקת דימות וידאו ומיפוי מרחבי-זמני ברזולוציה גבוהה לזיהוי שינויים בבקרה העצבית של מוטיליות המעי הגס בעכברים בוגרים. גישה זו מאפשרת זיהוי של השפעות עדינות על תפקוד מערכת העיכול בדגימות רקמה מבודדות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצבים
- גסטרואנטרולוגיה
- נוירוวิทยา של מערכת העיכול
רקע
- הטכניקה מתמקדת בניידות המעי הגס בעכברים.
- היא בוחנת את תפקידו של מערכת העצבים האנטרית בניידות של מערכת העיכול.
- מוטציות גנטיות עדינות עשויות להשפיע על ניידות המעי הגס.
- למחקר זה יש השלכות על הבנת מחלות נוירו-התפתחותיות.
מטרת המחקר
- לזיהוי שינויים בוויסות העצבי של מוטיליות המעי הגס.
- לבחינת ההשפעות של מוטציות גנטיות על תפקוד מערכת העיכול.
- לקידום ההבנה של מחלות מערכת העיכול.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טכניקת דימות וידאו למיפוי ברזולוציה גבוהה.
- בידוד של דגימות רקמה לחקר מוטיליות המעי הגס.
- ניתוח של חלל הבטן להגעה לרקמת המעי הגס.
- ניתוח של מעורבות מערכת העצבים האנטרית.
תוצאות עיקריות
- זוהו שינויים עדינים בתנועתיות המעי הגס.
- הטכניקה בידלה בהצלחה את השפעתו של מערכת העצבים האנטרית.
- הממצאים עשויים להיות קשורים להפרעות נוירו-התפתחותיות.
- קיים פוטנציאל למחקר נוסף במנגנוני מחלות של מערכת העיכול.
מסקנות
- טכניקת הדמיית הווידאו יעילה לחקר מוטיליות המעי הגס.
- התובנות שיירכשו עשויות להנחות גישות טיפוליות למחלות של מערכת העיכול.
- נדרש מחקר נוסף כדי לבחון השפעות גנטיות על המוטיליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות וידאו כמותי ומיפוי מרחבי-זמני של מוטיליות מערכת העיכול במעי גס של עכבר ex vivo מאפשרים בחינה מדויקת של תפקודי מערכת העצבים האנטרית, ללא תלות בקלט ממערכת העצבים המרכזית. גישה זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית ובתיקוף מטרות עבור מסלולי מחקר בנוירו-גסטרואנטרולוגיה והפרעות התפתחותיות נוירולוגיות. השיטה מספקת ביטחון חיזוי לשלבי גילוי מוקדמים ולמחקר תרגומי על פנוטיפים של מוטיליות במערכת העיכול הקשורים למוטציות גנטיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות עצביות אנטריות על ידי בידוד דפוסי תנועתיות המונעים על ידי ה-ENS.
- תומך בהסרת סיכונים מנגנונית עבור מודלים גנטיים הרלוונטיים להפרעות נוירו-התפתחותיות ולהפרעות במערכת העיכול.
- מקל על בדיקת השערות בנוגע להשפעת מוטציות בגנים סינפטיים על פיזיולוגיה של המעי.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק קריאות כמותיות וסטנדרטיות של תדירות התכווצות, התפשטות ואמפליטודה.
- מאפשר הערכה הדירה של מודולציה פרמקולוגית על מוטיליות המפוקחת על ידי ה-ENS.
- מכין מערכות ex vivo מתוקפות לסריקת תרכובות ומחקרי השוואה בין גנוטיפים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים פנוטיפים של מוטיליות במודלים של עכברים לתסמינים של מערכת העיכול הרלוונטיים למחלה, לצורך רצף תרגומי.
- תומך בפיתוח סממנים ביולוגיים על ידי כימות שינויים מרחביים-זמניים במוטיליות בתגובה להפרעה גנטית או פרמקולוגית.
- מאפשר קידום מותאם סיכונים של מטרות מועמדות המעורבות בניורוגסטרואנטרולוגיה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטה זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקרים פרה-קליניים, בכך שהיא מספקת פלטפורמה חסונה למחקרי תפקוד של ה-ENS, תיקוף מטרות ואפיון פרמקולוגי במודלים של עכברים מהונדסים גנטית.
- ביולוגיה של התגליות: מכמת ניידות המונעת על ידי ENS כדי להבהיר את מעורבות המסלול ולתקף היפותזות גנטיות.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הדירות להשוואות בין תרכובות וגנוטיפים.
- אנליטיקה: מייצרת מפות מרחביות-זמניות ברזולוציה גבוהה ומדדי התכווצות לצורך ניתוח סטטיסטי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין פנוטיפים של ניידות פרה-קלינית לסימפטומטולוגיה של מערכת העיכול האנושית, כאשר הדבר נתמך על ידי רלוונטיות המודל.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להסתגל לאזורי מערכת עיכול מרובים, שלבי התפתחות ומינים שונים לצורך תועלת רחבה במחקר ופיתוח.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות ב-ENS ובמחקרים מכניסטיים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של בדיקות ניידות (motility assays) לצורך הדירות והשוואה בין מחקרים.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go על ידי הפחתת סיכונים במטרות שלב מוקדם במערכת העיכול (GI) ובפיתוח העצבי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של מטרות מועמדות ומודלים להמשך קידום.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ברקמות ex vivo ובפיזיולוגיה של מערכת העצבים האנטרלית (ENS).
- דורש תשתית של דימות וידאו ותוכנה מותאמת אישית למיפוי מרחבי-זמני.
- מחייב בקרה קפדנית על הטמפרטורה והפרופוזיה להבטחת הדיוק וההדירות של הבדיקה.
- ניתן להתאמה לסוגי גנוטיפים שונים של עכברים, לאזורים שונים במערכת העיכול ולשלבים התפתחותיים שונים באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- תלוי בתהליכי ניתוח נתונים סטנדרטיים לצורך אינטגרציה בין מחקרים שונים.
