Name: קביעת תא קולטת אור הרגישות ספקטרלית במודל חרקים מן In vivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: למדו לקבוע את הרגישות הספקטרלית של תאי קולטני אור בודדים בעין המורכבת של פרפרים באמצעות טכניקת הרשמה תוך-תאית. שיטה זו מאפשרת לחזות את טווח ראיית הצבעים של החרק.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים המנוח רודי לימבורג בודת היקף זרוע קרדן, קימברלי ג&#39;יימיסון, מתיו מקהנרי, ו ראג&#39;ו Metherate עבור השאלה לנו ציוד, Almut קלבר ו קנטר Arikawa, על עידוד. עבודה זו נתמכה על ידי מלגת מחקר לתארים מתקדמים הקרן הלאומית למדע (NSF) כדי KJM ומענק NSF IOS-1,257,627 ל ADB

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הקלטה תאית יכולה להיות טכניקה קשה לשלוט בשל הצעדים טכניים הרבים המעורבים. עבור ניסויים מוצלחים כמה נקודות חשובות יש לקחת בחשבון. ראשית, חשוב שיהיה שולחן מבחינת רטט-מבודד כראוי שבו הניסוי מבוצע. חוקרים רבים משתמשים בלוחות אוויר, אשר לחלוטין להפריד את השולחן מהבסיס, מתן בידוד רעידות מעולה. ההגדרה שלנו כרוכה שולחן שיש עבה עם ארגז חול על גבי, שלתוכו הוא הניח את בעל micromanipulator / אלקטרודה / דגימת מנגנון במה. זוהי אלטרנטיבה יעילה יותר סבירה כדי שולחן אוויר, במיוחד אם גישה לגז בתוך ...

התכונות החשמליות של תאים כגון נוירונים הם נצפו על ידי מדידת זרימת יונים על פני קרום התא כשינוי מתח או זרם. מגוון של טכניקות אלקטרו פותח כדי למדוד אירועים ביואלקטריים בתאים. נוירונים נמצאים בעיני חיות נגישים המעגלים שלהם הם בדרך כלל פחות מורכבים ממה במוח, מה שהופכים תאים אלה מועמדים טובים במחקר אלקטרו. יישומים נפוצים של אלקטרופיזיולוגיה בעיניים כוללים electroretinography (ERG) 1,2 ו הקלטה תאית microelectrode. ERG כוללת הצבת אלקטרודה או על העין של חיה, החלת גירוי אור, ומדידת השינוי במתח כסכום של התגובות של כל התאים הסמוכים 3-6. אם מישהו מעוניין במיוחד באפיון רגישויות ספקטרלי של תאי קולטי אור בודדים, לעתים קרובות סוגי תאים מרובים להגיב בו זמנית בעוצמות שונות לגירוי נתון; וכך זהיכול להיות קשה לקבוע את הרגישויות של סוגי תאים ספציפיים מנתוני ERG במיוחד אם ישנם מספר סוגים שונים של תאי קולטי אור ספקטרלית-דומים לעין. פתרון אפשרי אחד הוא ליצור תסיסנית מהונדס עם קולטי האור (opsin) הגן של עניין הביע בתאים רוב R1-6 בעיניים ולאחר מכן לבצע 7 ארג. חסרונות פוטנציאליים של שיטה זו לא נכללו כל לביטוי הנמוך של קולטי אור החלבון 8, ואת מסגרת זמן הרבה עבור הדור והקרנת חיות טרנסגניות. לעיניים עם סוגים פחות של קולטני אור ברור ספקטרלית, הסתגלות של העין עם מסננים צבעוניים יכולה לעזור עם הפחתת התרומה של סוגי תאים מסוימים על ERG, ובכך לאפשר הערכה של מקסימום הרגיש ספקטרלית 9. הקלטה תאית היא טכניקה אחרת שבה אלקטרודה בסדר impales תא לבין גירוי מוחל. indiv הרשומה אלקטרודה שרקתגובת תא idual כך הקלטה וניתוח תאים בודדים מרובים יכולה להניב רגישויות ספציפיות של תאים מסוגים שונים פיסיולוגי 10-14. למרות בפרוטוקול שלנו מתמקד ניתוח רגישות ספקטרלית, את העקרונות הבסיסיים של תאיים הקלטה עם אלקטרודות חדה הם לשינוי עבור יישומים אחרים. באמצעות הכנה שונה של טיפוס, למשל, באמצעות אלקטרודות קוורץ חדה, אפשר להקליט עמוק באונה האופטית או אזורים אחרים במוח, תלוי השאלה נשאלת. לדוגמא, זמני תגובה של תאי קולטי אור פרט 15, פעילות התא האופטי אונות 16 (lamina, לשד או lobula 17), מוח 18 או גרעינים אחרים 19 יכולים גם להיות מוקלטות עם בטכניקות דומות, או גירויי צבע יכולים להיות מוחלפים עם קיטוב 20 -22 או תנועה לגירויים 23,24. Phototransduction, התהליך שבו אורהאנרגיה נספגת מומר אות אלקטרוכימיים, היא תכונה עתיקה ועד עממית, כמעט כל ימינו חית טווח מערכת 25. הפיגמנט החזותית שנמצאה בתאי קולטי אור ואת אחראית ליזום phototransduction החזותי הוא לרודופסין. Rhodopsins בכל חיים מורכבים של חלבון opsin, חבר של משפחת קולטן המצומד לחלבון G 7 הטרנסממברני, וכן כרומופור הקשורים הנגזר רשתית או מולקולה דומה 26,27. Opsin רצף החומצות האמיניות ומבנה כרומופור להשפיע על ספיגת של rhodopsin אורכי גל שונים של אור. כאשר פוטון נספג על ידי כרומופור rhodopsin הופך מופעל, ייזום מפל G- חלבון בתא שבסופו של דבר מביא לפתיחת תעלות יונים קרום הנכנס 28. בניגוד לרוב נוירונים, תאי קולטי אור לעבור שינויים פוטנציאל מדורגים שניתן למדוד כשינוי יחסי משרעת תגובה עם שינוי גירוי אור. בדרך כלל נתוןסוג קולטי האור מבטא רק גן opsin אחד (אם כי קיימים חריגים 8,10,29-31). ראיית צבעים מתוחכם, מן הסוג שמוצאים בהרבה חוליות ופרוקי רגליים, מושגת עם עיניים מורכבות של מאות או אלפי התאים קולטי האור בכל להביע אחת או מדי פעם יותר סוגים לרודופסין. מידע חזותי הוא נתפס על ידי השוואת תגובות על פני פסיפס קולטי האור באמצעות איתות עצבית במורד מורכבות העין והמוח, וכתוצאה מכך תפיסת דימוי להשלים עם צבע ותנועה. אחרי מדידת תגובות גלם של תא קולט אור לאורכי גל שונה של אור באמצעות הקלטה תאית, אפשר לחשב רגישות ספקטרלית שלה. חישוב זה מתבסס על עיקרון Univariance, הקובע כי תגובתו של קולטי אור תא תלויה במספר הפוטונים הוא סופגים, אך לא על התכונות המיוחדות של הפוטונים הם סופג 32. כל פוטון כי הוא absorbed ידי rhodopsin יניעו אותו סוג של תגובה. בפועל, זה אומר כי משרעת תגובת הגלם של תא תגדל בשל הן גדלה בעוצמת אור (פוטונים יותר לספוג), או שינוי אורך גל לכיוון רגישות לשיאו (הסתברות גבוהה יותר של rhodopsin קליטה גל כי). אנו עושים שימוש בעיקרון זה בהתייחסות תגובות הסלולר בעצימות ידועות אותו הגל לתגובות באורכי גל שונה, ואותה קיצוניות אבל רגישות ביחס ידועה. סוגי תאים מזוהים בדרך כלל על ידי אורך הגל שבו פסגות רגישותם. הנה אנחנו מראים שיטה אחת עבור הקלטה תאית וניתוח הרגישות ספקטרלית של קולטני אור בעיניים של פרפר, עם דגש על ביצוע שיטה זו נגישה יותר לקהילת המחקר הרחבה יותר. למרות הקלטה תאית נותרת נפוצה בספרות, במיוחד ביחס ראיית צבע חרקים, שמצאנו thaתיאורי t של חומרים ושיטות הם בדרך כלל קצרים מכדי לאפשר רבייה של הטכניקה. אנו מציגים שיטה זו בפורמט וידאו במטרה מתיר שהכפול הקל שלה. כמו כן, אנו מתארים את הטכניקה באמצעות ציוד השגה ובמחיר סביר בקלות. אנו מנסים לפתור אזהרות נפוצות, שלעתים קרובות אינם מדווחות, אשר להאט מחקר כאשר אופטימיזציה טכניקה חדשה ולא מוכרת.

<table><tbody><tr><td>גלמי</td><td></td><td></td> פרפרים <td>מספר מינים מקומיים זמינים, זקוקים לאישורי USDA למשלוח. ל-Carolina Bio Supply יש מספר מיני חרקים שניתן להזמין בתוך ארה"ב ללא צורך באישורים נוספים</td></tr><tr><td>גליל</td><td></td><td></td> פלסטיק גדול <td>כל תא שנשאר לח יעבוד</td></tr><tr><td>סיכות חרקים, גודל 2</td><td>BioQuip</td><td>1208B2</td><td></td></tr><tr><td>100% Desert Mesquite</td><td>Honey Trader Joe's</td><td></td><td>כל תמיסת דבש או סוכרוז תעבוד</td></tr><tr><td>מנורת קשת קסנון</td><td>Oriel מכשירים</td><td>66003</td><td>אוריאל הוא כעת חלק מאספקת</td></tr><tr><td>החשמל האוניברסלית</td> של תאגיד ניופורט <td>Oriel Instruments</td><td>68805</td><td>אוריאל הוא כעת חלק מ-Newport</td></tr><tr><td>Corporation Optical Track</td><td>Oriel Instruments</td><td>11190</td><td>Oriel הוא כעת חלק מ-Newport Corporation</td></tr><tr><td>Rail Carrier, Large (2x)</td><td>Oriel Instruments</td><td>11641</td><td>Oriel הוא כעת חלק מתאגיד</td></tr> <tr><td>ניופורטמנשא מסילה, קטן (4x)</td> <td>Oriel Instruments</td><td>11647</td><td>Oriel הוא כעת חלק ממתאם חוט של Newport Corporation</td></tr><tr><td>, 8-32 זכר עד 1/4-20 זכר, חבילה של 10</td> עמוד הרכבה אופטי <td>של Newport Corporation</td><td>TA-8Q20-10</td><td></td></tr><tr><td>, 1.0 אינץ', 0.5 אינץ'. נירוסטה, 8-32 & 1/4-20 (5x)</td> <td>Newport Corporation</td><td>SP-1</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק עמוד אופטי ללא החלקה, 2 אינץ', 0.5 אינץ'. עמודים בקוטר, 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>VPH-2</td><td></td></tr><tr><td>תושבת עדשה קבועה, 50.8 מ"מ</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-2</td><td></td></tr><tr><td>תושבת עדשה קבועה, 25.4 מ"מ</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-1</td><td></td></tr><tr><td>מכלול עדשת מעבה</td><td>Newport Corporation</td><td>60006</td><td></td></tr><tr><td>עדשת סיליקה קמורה, 50.8 מ"מ</td><td>Newport Corporation</td><td>SPX055</td><td></td></tr><tr><td>גלגל מסנן בעל שישה מצבים, x2</td><td>Newport Corporation</td><td>FW1X6</td><td></td></tr><tr><td>רכזת תושבת גלגל מסנן</td><td>Newport Corporation</td><td>FWM</td><td></td></tr><tr><td>עדשת סיליקה קעורה, 25.4 מ"מ</td> מחזיק קולימטור <td>Newport Corporation</td><td>SPC034</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Newport Corporation</td><td>77612</td><td></td></tr><tr><td>בדיקת קרן קולימציה</td><td>Newport Corporation</td><td>77644</td><td></td></tr><tr><td>ממיר פרול, סיומת SMA ל-11 מ"מ תקן Ferrule</td><td>Newport Corporation</td><td>77670</td><td>מתאם זה מאפשר לסיב האופטי להתאים למחזיק הקולימטור&nbsp;</td></tr><tr><td>600 &mu; כבל סיבים אובטיים בקוטר UV-vis</td><td>Oriel Instruments</td><td>78367</td><td>Oriel הוא כעת חלק מתריס תאגיד ניופורט</td></tr><tr><td>עם יחידת הנעה</td><td>Uniblitz</td><td>100-2B</td><td></td></tr><tr><td>UV מסנן ND מתכתי התמזגות, 0.1 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND01</td><td></td></tr><tr><td>UV מסנן ND מתכתי סיליקה התמזגות, 0.3 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND03</td><td></td></tr><tr><td>UV מסנן ND מתכתי סיליקה התמזגות, 0.5 OD</td><td>מסנן</td> ND מתכתי מתכתי ניופורט <td>FRQ-ND05</td><td></td></tr><tr><td>UV, מסנן ND</td> מתכתי מתכתי <td>ניופורט</td><td>FRQ-ND10 OD ניופורט FRQ-ND10</td><td></td></tr>, <tr><td>מסנן ND</td> מתכתי מתכתי <td>ניופורט</td><td>FRQ-ND30</td><td></td></tr><tr><td>UV התמזגות, מנורת 3.0 OD</td><td>ניופורט</td><td>FRQ-ND50</td><td></td></tr><tr><td>LS-1-Cal</td><td>אופטיקה אוקיינוס</td><td>LS-1-Cal</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרומטר</td><td>אופטיקה אוקיינוס</td><td>USB-2000</td><td></td></tr><tr><td>SpectraSuite Software</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מסנן הפרעות פס, 300 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67749</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 310 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67752</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 320 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67754</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 330 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67756</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 340 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65614</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 350 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67757</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 360 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67760</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 370 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67761</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 380 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67762</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 390 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67763</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 400 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65732</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 410 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65619</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 420 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65621</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 430 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65622</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 440 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67764</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 450 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65625</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 460 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67765</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 470 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65629</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 480 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65630</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 492 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65633</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 500 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65634</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 510 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65637</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 520 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65639</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 532 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65640</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 540 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65642</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 550 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65644</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 560 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67766</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 570 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67767</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 580 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65646</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 589 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65647</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 600 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65648</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 610 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65649</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 620 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65650</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 632 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65651</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 640 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65653</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 650 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65655</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 660 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67769</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 671 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65657</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 680 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67770</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 690 ננומטר&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65659</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס פס הפרעות, 700 ננומטר&nbsp;</td><td>אופטיקה אדמונד</td><td>67771</td><td></td></tr><tr><td>כלוב</td><td></td><td></td> פאראדיי <td>כל מבנה מתכת יעבוד שניתן לקרקע ומתאים למערך הניסיוני.</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ, 6X, 12X, 25X, הגדלה פי 50</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>Wild M5</td><td>כל סטריאומיקרוסקופ יעשה</td></tr><tr><td>מעמד מיקרוסקופ עם זרוע מתנדנדת ובסיס כבד</td><td>מכשירי</td><td></td> McBain <td>כל בסיס כבד עם זרוע</td></tr> יעשה <tr><td>זרוע</td><td></td><td></td> קרדן <td>נבנה בהתאמה אישית, ראה <חזק>איור 4</חזק></td></tr><tr><td>Fiber-lite תאורה בעוצמה גבוהה</td><td>דולן-ג'נר</td><td>MI-150</td><td>לדגימת תאורה</td></tr><tr><td>מדריך אור צוואר אווז פיבר-לייט</td><td>דולן-ג'נר</td><td>EEG 2823</td><td>כל מדריך אור צוואר אווז יעשה</td></tr><tr><td>שולחן</td><td></td><td></td><td></td></tr> שיש <tr><td>שולחן</td><td></td><td></td> עץ מוגבה <td>יש לחתוך חור דרך שולחן זה כך שארגז החול יוכל לנוח על שולחן השיש שמתחתיו</td></tr><tr><td>קופסת עץ מלאה בחול</td><td></td><td></td><td>שנבנתה בהתאמה אישית, כל קופסה עם חול</td></tr><tr><td>מניפולטור</td><td>קארל זייס -</td> מחזיק אלקטרודות ג'נה <td></td><td></td></tr><tr><td>שלב</td><td></td><td></td><td></td>דגימה</tr><tr><td>חוטי קליפ תנין להארקה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חוט</td><td></td><td></td><td></td>נחושת מבודד</tr><tr><td>חוט כסף, קוטר 0.125 מ"מ</td><td>World Precision Instruments</td><td>AGW0510</td><td></td></tr><tr><td></td> כבלי BNC <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מגבר מקדים עם ראש</td><td>תאגיד דגן</td><td>IX2-700</td><td></td></tr><tr><td>מפחית רעש Humbug</td> אוסילוסקופ <td>Quest Scientific</td><td>Humbug</td><td></td></tr>, <tr><td>30 מגה-הרץ, 2 CH, עקבות כפולות, Alt-triggering, ללא בדיקה</td><td>EZ Digital</td><td>os-5030</td><td></td></tr><tr><td>BNC T-adapter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומרת Powerlab 2/20</td><td>מכשירי ADI</td><td>ML820</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת Labchart</td><td>מכשירי ADI</td><td>תרשים 5</td><td></td></tr><tr><td>מחולל דופק 10 מגה-הרץ</td><td>BK דיוק</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>חולץ פיפטות זכוכית</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית Borosillicate עם נימה</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי, 3 מ</td><td></td><td></td><td></td></tr> '<tr>צינור <td></td><td></td><td></td><td>פלסטיק מחורץ</td></tr><tr><td>שעווה</td><td></td><td></td><td></td>בטמפרטורת התכה נמוכה</tr> ברזל <tr><td>הלחמה</td><td>פלטפורמת וולר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עם בסיס מגנטי של כדור ושקע</td><td>חמה צילום ווידאו</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלדת פחמן בקצה כפול, סכין גילוח שביר</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>72004</td><td></td></tr><tr><td>וזלין</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסופט אקסל</td><td>מיקרוסופט</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

קביעת תא קולטת אור הרגישות ספקטרלית במודל חרקים מן<em&gt; in vivo</em&lt;הקלטות תאיות

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

הקלטה תאית היא טכניקה רבה עצמה להשתמש כדי לקבוע כיצד תא בודד יכול להגיב לגירוי נתון. במחקר חזון, הקלטה תאית כבר היסטורי טכניקה נפוצה בשימוש ללמוד רגישויות של תאי קולטי אור פרט לגירויים באור שונים כי הוא עדיין בשימוש כיום. עם זאת, יש עדיין מחסור של המתודולוגיה מפורט בספרות לחוקרים המעוניינים לשכפל ניסויי הקלטה תאיים בעיניים. כאן אנו מציגים את מקק מודל לבחינת פיזיולוגית עין באופן כללי יותר. תאי קולטי אור חרקים נמצאים קרוב לפני השטח של העין ולכן קלים להגיע, ורבי המנגנונים המעורבים חזון שמורים פני טווח מערכת חיה. אנו מתארים את ההליך הבסיסי הקלטת in vivo התאית של תאי קולטי אור בעיניים של פרפר, עם המטרה של עשיית טכניקה זו לנגישה יותר חוקר עם ניסיון קודם קצת בדוארlectrophysiology. אנחנו מציגים את הציוד הבסיסי הדרוש, איך להכין פרפר חי להקלטה, כיצד להוסיף microelectrode זכוכית לתוך תא בודד, ולבסוף הליך ההקלטה עצם. אנו גם להסביר את הניתוח הבסיסי של נתונים בתגובת גלם לקביעת רגישות ספקטרלית של סוגי תאים בודדים. למרות בפרוטוקול שלנו מתמקד בקביעת רגישות ספקטרלית, גירויים אחרים (למשל, אור מקוטב) וריאציות של השיטה הם החלימו על התקנה זו.

עבור אלמנטים רבים של הגדרת ההקלטה, תיאור בכתב אינו מספק פירוט מספיק. איור 1 הוא סכימטי של הרכיבים מעורבים הגדרת ההקלטה המלאה. באיור 2, ספקטרה הם זממו עבור אור לבן כל מסנן התערבות כדי לתת תחושה של למה בגורם תיקון נחוץ ומה נדרש כדי לחשב את התיקון הזה. איור 3 מציג תמונות ותרשים של הזרוע קרדן המשמש אלה ניסויים. איור 4 היא תמונה מורכבת מראה להקליט את הבמה ואת micromanipulator. איור 5 מראה כמה ...

הטכניקה של אלקטרו הקלטה תאית מודגמת והשתמשה לקבוע רגישויות ספקטרלי של תאי קולטי אור יחידים העין המורכבת של פרפר.

קביעת תא קולטת אור הרגישות ספקטרלית במודל חרקים מן<em&gt; In vivo</em&lt;הקלטות תאיות

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

המטרה הכללית של שיטה זו להקלטה תוך-תאית היא לקבוע את הרגישות הספקטרלית של תאי פוטורספטורים בודדים בעין מורכבת של חרק in vivo. שיטה זו יכולה להסבייר לנו האם אורכי הגל שבהם התא רגיש מושפעים מפגימנטים מסננים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שבאמצעות ידיעת הרגישויות הספקטרליות של פוטורספטורים בודדים, אנו יכולים לחזות איזה טווח של צבעים בעל החיים יכול לראות.כדי להיערך להקלטה, הדליקו את מנורת הקסנון לפחות 45 דקות לפני הניסוי, והפעילו את מושך המיקרו-אלקטרודות לפחות 30 דקות לפני משיכת אלקטרודות הזכוכית. לאחר מכן, הדליקו את כל ציוד ההקלטה. ודאו שהתריס סגור כברירת מחדל, כך ששום אור לא יעבור דרך כבל הסיב האופטי.לאחר מכן, משוך מיקרו-אלקטרודות מזכוכית בורוסיליקט עדינה באמצעות שובץ מיקרו-אלקטרודות. מלא מחדש את האלקטרודות ב-potassium chloride בריכוז three molar. להכנת הדגימה, תחת המיקרוסקופ, הצמד פרפר בודד בתוך צינור פלסטיק קטן באמצעות שעווה חמה, כך שהראש יהיה מקובע ובולט מקצה אחד של הצינור.לאחר מכן, קבעו את החרטום, המחושים והכנפיים באמצעות שעווה. לאחר מכן, קיבעו את הבטן בעזרת חתיכת שעווה יבשה. שמרו על לחות בתוך השפופרת על ידי הנחת טישו רטוב בתוכה, מאחורי בטנו של הדגימה.וודאו שהדגימה אינה נעה כלל. לאחר מכן, קבעו את המבחנה באמצעות פיסת שעווה קטנה על פלטפורמה קטנה עם מפרק כדורי המחוברת לבסיס מגנטי. תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, הכניסו חוט כסף לתוך הראש דרך הפה, שישמש כאלקטרודת ייחוס.לפני הניסוי, קבע את התיל לפלטפורמה באופן קבוע. לאחר מכן, חתוך חור קטן בקרנית השמאלית באמצעות להב תער, ואטום את החור בוזלין כדי למנוע התייבשות. לאחר חיתוך הקרנית, הכנס את אלקטרודת ההקלטה אל תוך העין במהירות המרבית, מכיוון שההמולימפה בעין תקשח במהירות ותהפוך את הכנסת האלקטרודה לבלתי אפשרית.במידת האפשר, בצעו את הניתוח במערך שבו יתבצע ההקלטה. לאחר מכן, חברו את חוט ההארקה של ראש ההקלטה (head stage) לאלקטרודת הייחוס שעל פלטפורמת הדגימה, באמצעות תפסני תנין. התקינו את האלקטרודה על תומך האלקטרודות.לאחר מכן, הכניסו את תיל הכסף לתוך תמיסת הפוטסיום כלוריד במיקרו-אלקטרודה. השתמשו במקור אור עם זרועות גמישות להארת הדגימה תחת סטראאומיקרוסקופ בעת הורדת האלקטרודה אל תוך העין. כווןו את מחזיק האלקטרודה כך שהמיקרו-אלקטרודה תהיה ישירות מעל החור שגולף קודם לכן בקרנית.לאחר מכן, הרד את המיקרו-אלקטרודה אל תוך העין באמצעות המיקרו-מניפולטור, עד להשלמת המעגל. לאחר הכניסה לעין, העבר את הסטראוסקופ אל מחוץ לכלוב פאראדיי. כבה את מקור האור המאיר את הדגימה, והשאר את החרק בחושך למשך 10 עד 20 דקות לצורך הסתגלות לחושך.בדוק את התנגדות האלקטרודה על ידי הפעלת זרם של 1 nanoamp ובדיקת השינוי במתח. ההתנגדות צריכה להיות בדרך כלל בטווח שבין 100 ל-250 megaohms. לאחר מכן, הפעל את מחולל הפולסים כדי להפיק הבזק אור למשך תקופת הניסוי, והפנה את כבל הסיב האופטי לעבר העין.בדוק באוסילוסקופ אם חל שינוי במתח בכל הבזק של אור. שינוי שלילי במתח מעיד על כך שהאלקטרודה עדיין לא נכנסה לתא. הזז את כבל הסיב האופטי מסביב לדגימה עד להשגת תגובת מתח מקסימלית.כדי להפיק תגובה אורית דפולריזצית (depolarizing), סובבו את המיקרו-מניפולטור הלוך ושוב, באופן שיגרום לתנועות אנכיות קטנות של האלקטרודה, תוךما הנקשה קלה על בסיס מחזיק האלקטרודה או שימוש בפונקציית הזזז (buzz) במגבר המקדים. המשיכו לבצע התאמות קטנות עד שתופיע תגובה אורית דפולריזצית באוסצילוסקופ. לאחר מכן, כוונו את כבל הסיב האופטי כדי למצוא את האות הדפולריזצית החזק ביותר.בצעו התאמות קטנות באמצעות מיקרו-מניפולטור, והשתמשו בפונקציית הזמזום (buzz) במגבר לפי הצורך, כדי להבטיח שהאלקטרודה מקליטה את התא באופן יציב. הקלטה יציבה צריכה להראות שינוי קטן או אפסי בפוטנציאל המנוחה, רעש רקע נמוך, ותגובת דפולריזציה גדולה ועקבית. חיוני להשיג הקלטה יציבה שבה פוטנציאל מנוחת הממברנה אינו רועש ואינו משתנה לאורך זמן.התגובות צריכות להיות גדולות וחיוביות ללא היפר-פולריזציה. ברגע שהמערכת יציבה, פתח את התוכנה וסגור את תיבת הדיאלוג הנקראת "Experiments Gallery" כדי לפתוח חלון קופץ עם ארבעה ערוצים. כוון את קנה מידה של המתח בפינה הימנית העליונה של חלון התוכנה ל-500 millivolts.לאחר מכן, לחצו על Start בפינה הימנית התחתונה כדי להתחיל בהקלטה. צמצמו את ערוצים שלוש וארבע, והתאימו את קנה המידה של ציר X וציר Y. לאחר מכן, אפשרו לתוכנה לרוץ למשך משך הניסוי.עבור גרייה באור לבן, רשמו עד 10 תגובות בודדות, כאשר גלגל מסנני ה-ND מוגדר ב-OD הגבוה ביותר שעדיין מעורר תגובה. כאן, השינוי בתגובה מוצג ב-3.0 OD וב-2.0 OD. לאחר מכן, רשמו את אותו מספר תגובות מ-3.5 ועד 0.0 OD, בכל שילוב, כדי לספק עקום עוצמה של רישום התגובה. לפני רישום תגובת התא לכל אורכי הגל באמצעות מסנני ההפרעה, מצאו תחילה במהירות את אורך הגל בשיא.ללא מסנן ND בנתיב האור, הציבו שם מסנן המעביר UV, ותצפתו בקצרה באמפליטודת התגובה. חזרו על הפרוצדורה עם מסנן המעביר אור כחול, מסנן המעביר אור ירוק ומסנן המעביר אור אדום, דבר שאמור לתת מושג היכן יהיה שיא התגובה. רשמו את אורך הגל של המסנן שנתן את התגובה המקסימלית לפני המעבר למסנן הֶסְבֵּר (interference filter) אחר.בין הקלטות עם מסננים עוקבים, אפשרו לתא להגיב לאחד עד שניים מהבזקי אור לבן ללא כל מסנן בנתיב האור, כדי לסייע בניטור אם התגובה בשיא נחלשת עם הזמן. לאחר מכן, הקליטו עם מסנני הפרעה אחרים, ואפשרו עד 10 תגובות לכל מסנן. זוהי דוגמה לשינוי מתח שלילי גדול הנראה רגע לפני הכניסה לתא.כאן מוצגת הקלטה נקייה, הכוללת רעש רקע מועט ותגובה דפולריזציונית גדולה, בדרך כלל של לפחות 40 millivolts. וכאן דוגמה להקלטה גרועה, בשל השינוי בפוטנציאל השלילי לאחר השיא המרכזי. זוהי דוגמה נוספת להקלטה גרועה.פוטנציאל המנוחה עובר תנודות גדולות, וכמות רבה של רעש רקע עלולה להסתיר את אמפליטודת התגובה. זוהי דוגמה מייצגת של רגישות ספקטרלית שהופקה מהקלטה בודדת. סוגי התאים מסווגים לפי שיא הרגישות באורך גל דומה, ולפי הצורה הכללית של ספקטרום הרגישות.לאחר מכן מחשבים ממוצע עבור אותם סוגי תאים, והרגישות הממוצעת מוצגת בגרף עם פסי שגיאה (standard error) עבור כל אורך גל. גרף זה מציג את הרגישויות הספקטרליות של שלושה סוגי תאים טיפוסיים הנמצאים בחרק. לאחר שליטה בטכניקה, ניתן לבצעה תוך כשעתיים.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע ניסויי התנהגות כדי לקבוע אם כל סוגי תאי הפטורקטור תורמים להבחנה בצבעים או לא.

determination-photoreceptor-cell-spectral-sensitivity-an-insect-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול לרישום אלקטרופיזיולוגי של פעילות קולטני אור בעין של דרוזופילה משותקת, המאפשר מדידה מדויקת של שינויי מתח בתגובה לגירויי אור.

רישום אלקטרופיזיולוגי של תגובות מתח של פוטורצפטורים ברשתית דרוזופילה לגירויי אור

הסרטון מדגים רישום פעילות חשמלית בנוירונים קולטי האור של אומטידיום של דרוזופילה על ידי קביעת תצורה של תא שלם. הוא מדגיש את ההפעלה של ערוצים פוטנציאליים של קולטן חולף על ידי פולסי אור, וכתוצאה מכך בליטות קוונטיות מדידות.

הקלטות מהדק מתח של תא שלם מפוטורצפטורים של דרוזופילה

סרטון זה מדגים את ההליך להקלטה תוך-תאית in vivo של תאים קולטי אור בעין של פרפר וקביעת הרגישות הספקטרלית של סוגי תאים בודדים. טכניקה זו מאפשרת לחקור רגישויות של תאים קולטי אור בודדים לגירויי אור שונים.

ב-Vivo הקלטה תוך-תאית של רגישות ספקטרלית של תאים קולטי אור בפרפר

מקור: Wagner, K. et al., חקר סחר בחלבוני ממברנה בתאי קולטני אור של דרוזופילה באמצעות חלבונים מתויגים eGFP. J. Vis. Exp. (2022). סרטון זה מדגים את ההדמיה של סחר בחלבון ממברנה בתאי קולטני אור של דרוזופילה באמצעות חלבוני TRPL מתויגים eGFP. הוא מפרט את הכנת הזבובים הטרנסגניים להדמיה, לכידת תמונות פלואורסצנטיות של תאים קולטני אור וכימות סחר TRPL על ידי מדידת פלואורסצנטיות eGFP יחסית ברבדומרים.

חקר סחר בחלבוני ממברנה בתאי קולטני אור של דרוזופילה

מיקרואלקטרודות חדות מאפשרות אפיון אלקטרופיזיולוגי מדויק של תפוקת קולטני האור והאינטרנוירונים החזותיים בדרוזופילה חיה. כאן אנו מראים כיצד להשתמש בשיטה זו כדי להקליט תגובות מתח באיכות גבוהה של תאים בודדים לגירוי אור מבוקר. שיטה זו אידיאלית לחקר עיבוד מידע עצבי בעיניים של תרכובות חרקים.

שיטת אלקטרו עבור תגובות מתח תאיים הקלטה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור ו interneurons יאירו גירויים<em&gt; In vivo</em

כאן אנו מראים כיצד לכמת את מספר הפריסה המרחבית של אזורי הפעילות הסינפטית קולטני האור תסיסנית, הדגיש עם סמן מולקולרי מקודדים גנטית, אפנון שלהם לאחר חשיפה ממושכת לאור.

ניתוח Synaptic אפנון של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור לאחר חשיפה לאור ממושך

כל תא הקלטות של תסיסנית melanogaster photoreceptors לאפשר מדידה של ספונטני בליטות כהה, בליטות קוונטיות, תגובות מאקרוסקופיות לאור, ואת המתח הנוכחי היחסים בתנאים שונים. בשילוב עם ד melanogaster כלים מניפולציה גנטית, שיטה זו מאפשרת את המחקר של inositol- השומן ליפיד המסלול נתיב היעד שלה, ערוץ TRP.

שיטה אלקטרו-קולית לקולקציית מתח מלא<em&gt; תסיסנית</em&gt; פוטורספטורים

פרוטוקול לחקר הפחתת הרגישות וההתאוששות הרגישות של מנועי סרטן הסרטנים כפונקציה של הזמן האחראי מוצג.

הפחתת רגישות והתאוששות של סרטן הנהרות בעת העברת גירוי באור

אנו מציגים פרוטוקול לאפיון אלקטרופיזיולוגי של פוטופיגמנטים דו-יציבים: (1) ניצול תזוזות המטען בתוך מולקולות הפוטוגמנט בעקבות בליעת הפוטונים וכמותם העצומה בפוטורצפטורים, ו-(2) ניצול הבדלי הספיגה-ספקטרום של מצבי הפוטוגמנט של רודופסין ומטרהודופסין. פרוטוקולים אלה שימושיים לסינון מוטציות המשפיעות על מערכות פוטופיגמנט דו-יציבותיות.

שיטות אלקטרופיזיולוגיות למדידת רמות פוטופיגמנט בדרוזופילה פוטורצפטורים

סרט הווידאו הזה מדגים שיטה לנתח ותרבות נוירונים commissural מחוט השדרה הגבי E13 חולדה. נוירונים commissural ניתק מועילים כדי ללמוד את המנגנונים תאית ומולקולרית של צמיחה האקסון והדרכה.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

למדו לקבוע את הרגישות הספקטרלית של תאי קולטני אור בודדים בעין המורכבת של פרפרים באמצעות טכניקת הרשמה תוך-תאית. שיטה זו מאפשרת לחזות את טווח ראיית הצבעים של החרק.

קביעת תא קולטת אור הרגישות ספקטרלית במודל חרקים מן

גלה סרטונים נוספים