קביעת תא קולטת אור הרגישות ספקטרלית במודל חרקים מן In vivo
26 בפברואר 2016
הטכניקה של אלקטרו הקלטה תאית מודגמת והשתמשה לקבוע רגישויות ספקטרלי של תאי קולטי אור יחידים העין המורכבת של פרפר.
המטרה הכוללת של שיטה זו של הקלטה תוך-תאית היא לקבוע את הרגישות הספקטרלית של תאים קולטני אור בודדים בעין תרכובת חרקים in vivo. שיטה זו יכולה לומר לנו אם אורכי הגל של האור שהתא רגיש אליהם מושפעים מסינון פיגמנטים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שעל ידי הכרת הרגישויות הספקטרליות של קולטני אור בודדים, אנו יכולים לחזות איזה טווח צבעים בעל חיים יכול לראות.
כדי להתכונן להקלטה, הפעל את מנורת הקסנון לפחות 45 דקות לפני הניסוי, והפעל את חולץ המיקרואלקטרודות לפחות 30 דקות לפני משיכת אלקטרודות הזכוכית. לאחר מכן, הפעל את כל ציוד ההקלטה. ודא שהתריס סגור כברירת מחדל, כך שלא יעבור אור דרך כבל הסיב האופטי.
לאחר מכן, משוך מיקרו-אלקטרודות עדינות מזכוכית בורוסיליקט באמצעות מושך המיקרואלקטרודות. מלאו את האלקטרודות בשלוש אשלגן כלורי מולארי. להכנת הדגימה, מתחת למיקרוסקופ, הדביקו פרפר בודד בתוך צינור פלסטיק קטן עם שעווה חמה, כך שהראש אינו נייד ובולט מקצה אחד של הצינור.
לאחר מכן, הדביקו את החרטום, האנטנות והכנפיים בשעווה. לאחר מכן, החזיקו את הבטן בעזרת חתיכת שעווה יבשה. שמור על הצינור לח על ידי הנחת רקמה רטובה בתוכו, מאחורי הבטן של הדגימה.
ודא שהדגימה אינה ניידת לחלוטין. לאחר מכן, הרכיב את הצינור באמצעות חתיכת שעווה קטנה על פלטפורמה קטנה עם מפרק כדור ושקע המחובר לבסיס מגנטי. תחת מיקרוסקופ מנתח, הכנס חוט כסף לראש דרך חלק הפה, כאלקטרודת הייחוס.
לפני הניסוי, תקן לצמיתות את החוט לפלטפורמה. לאחר מכן, חתכו חור קטן בקרנית השמאלית בעזרת סכין גילוח, ואטמו את החור עם וזלין כדי למנוע התייבשות. לאחר חיתוך הקרנית, הכנס את אלקטרודת ההקלטה לעין במהירות האפשרית, מכיוון שהמולימפה בעין תתקשה במהירות ולא תאפשר להכניס אלקטרודה.
במידת האפשר, בצע את החיתוך במתקן שבו תתבצע ההקלטה. לאחר מכן, חבר את חוט ההארקה של שלב הראש לאלקטרודת הייחוס על פלטפורמת הדגימה, באמצעות תפסי התנין. התקן את האלקטרודה על מחזיק האלקטרודה.
לאחר מכן, הכנס את חוט הכסף לתמיסת האשלגן הכלורי במיקרואלקטרודה. השתמש במקור אור עם חיבורי צוואר אווז כדי להאיר את הדגימה מתחת לסטריאוסקופ תוך הורדת האלקטרודה לעין. כוונן את מחזיק האלקטרודה כך שהמיקרו-אלקטרודה תהיה ישירות מעל החור שנחתך בעבר בקרנית.
לאחר מכן, הורד את המיקרואלקטרודה לתוך העין באמצעות המיקרומניפולטור, עד להשלמת מעגל. ברגע שנכנסים לעין, סובבו את הסטריאוסקופ מחוץ לכלוב פאראדיי. כבה את מקור האור המאיר את הדגימה, והשאיר את החרק בחושך למשך 10 עד 20 דקות להסתגלות לחושך.
בדוק את ההתנגדות של האלקטרודה על ידי הפעלת זרם ננו-אמפר אחד וציון השינוי במתח. ההתנגדות צריכה להיות בדרך כלל בטווח שבין 100 ל-250 מגה-אוהם. לאחר מכן, הפעילו את מחולל הפולסים כדי לספק הבזק אור למשך הניסוי, וכוונו את כבל הסיב האופטי לכיוון העין.
בדוק את האוסילוסקופ עבור כרךtagשינוי עם כל הבזק אור. שינוי שלילי במתח מסמל שהאלקטרודה טרם נכנסה לתא. הזז את כבל הסיב האופטי סביב הדגימה עד שנצפתה תגובת מתח מקסימלית.
כדי ליצור תגובת אור דה-פולריזציה, סובב את המיקרומניפולטור קדימה ואחורה, מה שגורם לתנועות אנכיות קטנות של האלקטרודה, תוך הקשה קלה על בסיס מחזיק האלקטרודה או שימוש בפונקציית הזמזום במגבר המקדים. המשך לבצע התאמות קטנות עד שתופיע תגובת אור דה-פולריזציה באוסילוסקופ. לאחר מכן, כוונן את כבל הסיב האופטי כדי למצוא את אות הדפולריזציה הגדול ביותר.
בצע התאמות קטנות עם מיקרומניפולטור, והשתמש בפונקציית הזמזום במגבר לפי הצורך, כדי לוודא שהאלקטרודה מקליטה את התא ביציבות. להקלטה יציבה אמור להיות שינוי מועט עד ללא שינוי בפוטנציאל המנוחה, רעשי רקע נמוכים ותגובת דה-פולריזציה גדולה באופן עקבי. חיוני שתהיה הקלטה יציבה שבה פוטנציאל הממברנה במנוחה אינו רועש ואינו משתנה עם הזמן.
התגובות צריכות להיות גדולות וחיוביות ללא היפרפולריזציה. לאחר שההתקנה יציבה, פתח את התוכנה וסגור את תיבת הדו-שיח הנקראת גלריית הניסויים "כדי לפתוח חלון קופץ עם ארבעה ערוצים. כוונן את סולם המתח בפינה השמאלית העליונה של חלון התוכנה ל-500 מילי-וולט.
לאחר מכן, לחץ על התחל בפינה השמאלית התחתונה כדי להתחיל בהקלטה. מזער את הערוצים 3 ו-4 והתאם את קנה המידה X ו-Y. לאחר מכן אפשר לתוכנה לפעול למשך הניסוי.
לגירוי אור לבן, הקלט עד 10 תגובות בודדות, כאשר גלגל מסנן ה-ND מוגדר ב-OD הגבוה ביותר שעדיין מעורר תגובה. כאן, השינוי בתגובה מוצג ב-3.0 OD ו-2.0 OD. לאחר מכן, רשום את אותו מספר תגובות מ-3.5 עד 0.0 OD, בכל שילוב, על מנת לספק עקומת עוצמת יומן תגובה. לפני רישום תגובת התא לכל אורכי הגל באמצעות מסנני ההפרעות, תחילה מצא במהירות את אורך הגל השיא.
ללא כל מסנן ND בנתיב האור, הנח שם מסנן משדר UV, והתבונן בקצרה במשרעת התגובה. חזור על ההליך עם מסנן שידור כחול, מסנן שידור ירוק ומסנן שידור אדום, שאמור לתת מושג כלשהו היכן תהיה תגובת השיא. הקלט מתחת לאורך הגל של המסנן שנותן את התגובה המקסימלית לפני המעבר למסנן הפרעות אחר.
בין הקלטה עם מסננים עוקבים, אפשר לתא להגיב להבזק אחד או שניים של אור לבן ללא כל מסנן בנתיב האור, על מנת לעזור לנטר אם תגובת השיא יורדת עם הזמן. לאחר מכן, הקלט עם מסנני הפרעות אחרים, ואפשר עד 10 תגובות לכל מסנן. זוהי דוגמה לשינוי מתח שלילי גדול שנראה רגע לפני הכניסה לתא.
מוצגת כאן הקלטה נקייה, שיש לה מעט רעשי רקע, ותגובת דה-פולריזציה גדולה, בדרך כלל של לפחות 40 מילי-וולט. והנה דוגמה להקלטה גרועה, בגלל השינוי הפוטנציאלי השלילי לאחר השיא הראשי. זו דוגמה נוספת להקלטה גרועה.
פוטנציאל המנוחה עובר תנודות גדולות, והכמות הגדולה של רעשי הרקע יכולה לטשטש את משרעת התגובה. זוהי דוגמה מייצגת לרגישות ספקטרלית הנגזרת מהקלטה בודדת. סוגי התאים מסווגים לפי רגישות שיא באורך גל דומה, וצורה כללית של ספקטרום הרגישות.
לאחר מכן מחושבים אותם סוגי תאים, והרגישות הממוצעת משורטטת עם פסי שגיאה סטנדרטיים בכל אורך גל. הגרף הזה מציג את הרגישויות הספקטרליות של שלושה סוגי תאים טיפוסיים שנמצאים בחרק. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשעתיים.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע ניסויים התנהגותיים על מנת לקבוע אם כל סוגי התאים קולטני האור תורמים להבחנת צבעים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מדגים את הטכניקה האלקטרופיזיולוגית של רישום תוך-תאי להערכת הרגישויות הספקטרליות של תאי פוטורצפטורים בודדים בעין המורכבת של פרפר. באמצעות הבנת רגישויות אלו, חוקרים יכולים להסיק את טווח הצבעים הגלויים לחרק.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- אלקטרופיזיולוגיה
- מדעי המוח
- ראייה בחרקים
רקע
- חרקים בעלי עיניים מורכבות המכילות תאי פוטורצפטורים מרובים.
- הבנת הרגישות הספקטרלית חיונית להשגת תובנות לגבי התנהגות חרקים.
- הקלטה תוך-תאית מאפשרת מדידות in vivo של תגובות פוטורצפטורים.
- פיגמנטים מסננים עשויים להשפיע על אורכי הגל להם רגישים הפוטורצפטורים.
מטרת המחקר
- לקביעת הרגישות הספקטרלית של תאי פוטורספטורים בודדים.
- להערכת השפעתם של פיגמנטים מסננים על הרגישות לאור.
- לניבוי יכולות ראיית הצבע של פרפרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טכניקת הקלטה תוך-תאית המיושמת על תאי פוטורספטורים.
- שימוש במנורת xenon לעגיבור באור.
- הכנת אלקטרודות זכוכית באמצעות מושך מיקרו-אלקטרודות.
- בקרת חשיפה לאור באמצעות כבל סיב אופטי.
תוצאות עיקריות
- זיהוי אורכי גל ספציפיים להם מגיבים פוטורצפטורים בודדים.
- תובנות לגבי האופן שבו פיגמנטים מסננים משפיעים על הרגישות לאור.
- תחזיות שניתנו בנוגע לטווח ראיית הצבעים של פרפרים.
- הדגמה של יעילות ההקלטה התוך-תאית בדגימות חיות.
מסקנות
- הקלטה תוך-תאית היא טכניקה בעלת ערך לחקר הראייה בחרקים.
- הבנת רגישויות ספקטרליות יכולה להעמיק את הידע על התנהגות חרקים.
- מחקרים עתידיים יוכלו להתבסס על ממצאים אלו כדי לחקור עיבוד חזותי בחרקים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
קביעת הרגישות הספקטרלית של תאי פוטורצפטור בודדים מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית בתיקוף מטרות עבור גילוי טיפולים הקשורים לראייה. שיטה זו תומכת בביטחון חיזוי על ידי קישור התגובה התאית לאור לתפיסת צבעים ברמת האורגניזם, ובכך מספקת מידע לבדיקת השערות בשלבים מוקדמים בקווי מחקר של נוירוביולוגיה תחושתית. גישה זו מספקת רצף תרגומי מהמנגנון התאי עד לפלט הפונקציונלי, דבר הרלוונטי להפחתת סיכונים של מטרות במחקר על מודולציה תחושתית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי קישור תגובות של פוטורספטורים בודדים לאורכי גל ספציפיים של אור.
- ערך תפעולי: מספק הפחתת סיכונים ביולוגית באמצעות מדידה ישירה של רגישות ספקטרלית בפוטורספטורים שלמים.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי ניבוי טווח ראיית צבעים בהתבסס על פרופילי רגישות של הפוטורספטורים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מוכנות הבדיקה: הכנה של מערכות ביולוגיות מתוקפות לסריקות המשך באמצעות ביסוס פרופילי תגובה ספקטרלית בסיסיים.
- פלט כמותי: יצירת תגובות מתח דפולריזציה הניתנות לשחזור למגיבים של גירויי אור מבוקרים, המאפשרים סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- ניתנות להרחבה: תמיכה בשימוש חוזר בפלטפורמה על פני מודלים שונים של חרקים הודות למנגנוני ראייה שמורים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- סמן ביולוגי תרגומי: משתמש בעקומות רגישות ספקטרלית כקריאות מערכת רלוונטיות למחלה עבור תפקוד חזותי.
- המשכיות פרה-קלינית: מקשר בין תגובת פטורצפטורים תאיים לתוצאות של הבחנה צבעונית התנהגותית.
- קידום מותאם סיכונים: מספק מידע להחלטות של go/no-go על ידי מתאם בין רגישות תאית לטווח ראייה חזוי.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת בביולוגיה של גילוי בכך שהיא מאפשרת בדיקת השערות לגבי תפקוד פוטורצפטורים באמצעות גירוי אור קצוב וקריאה אלקטרופיזיולוגית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהבהרה של מסלולים על ידי בידוד תגובות פוטורספטורים לאורכי גל ספציפיים באמצעות מסנני התאבכות.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות הקלטות תוך-תאיות יציבות עם רעש נמוך ואותות דפולריזציה עקביים.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה כמותית של אמפליטודות תגובה בין אורכי גל שונים ומסנני צפיפות ניטרלית לבניית עקומות רגישות.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין רגישות ספקטרלית תאית לתוצאות התנהגותיות באמצעות תגובות ממוצעות של סוגי תאים וסטיות תקן.
- שימוש חוזר ארגוני: קובעת זרימת עבודה אלקטרופיזיולוגית סטנדרטית שניתן ליישם במודלים של חרקים למחקר ראייה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי בתיקוף המטרה באמצעות מדידה ישירה של רגישות ספקטרלית בפוטורצפטורים טבעיים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה וחזרתיות באמצעות הסתגלות לחושך, בדיקות התנגדות אלקטרודה (100–250 MΩ), וקריטריונים לתגובת דפולריזציה יציבה (≥40 mV).
- ערך אסטרטגי: הפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים על ידי הערכה מוקדמת של השפעות פיגמנט הסינון על רגישות לאור.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם סיכון, בהתבסס על יכולות ראיית צבע חזויות שנגזרו מנתוני תא בודד.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באלקטרופיזיולוגיה, הכנת מיקרו-אלקטרודות וטיפול ברקמות in vivo.
- תלוי במנורת xenon, שוב מיקרו-אלקטרודות, אוסילוסקופ ומערכות הולכת אור בסיב אופטי.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית להכנת אלקטרודות, קיבוע דגימות ופרוטוקולי הסתגלות לחושך.
- שיקולי הסתגלות כוללים את שלמות קרנית הסוג (species-specific) ותגובתיות ההמולימף המשפיעה על החדרת האלקטרודה.
- מגבלות מעשיות כוללות התקשות מהירה של ההמולימף לאחר חתך בקרנית, דבר המחייב החדרה מיידית של האלקטרודה.
