Name: רב-יעד Chromogenic כל הר באתר הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב דרוזופילה עוברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: למד את שיטת MC-WISH לזיהוי תבניות ביטוי mRNA בעוברי דרוזופילה. טכניקה זו מאפשרת השוואה של שלושה גנים שונים בצבעים ניגודיים לחקר ביולוגיה התפתחותית ומיפוי גנטי מדויק.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לעמיתינו על פלסמידים cDNA ליצירת תבניות. עבודתם של המחברים נתמכת על ידי הקרן השוודית לסרטן (CAN 2010/553), הקרן השוודית לשיתוף פעולה בינלאומי במחקר והשכלה גבוהה (IG2011-2042) וקרן קנוט ואליס ולנברג (KAW2012.0058).

<ol><li>Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHauptmann%2C+G+%22In+Situ+Hybridization+Methods%22">In Situ Hybridization Methods</a>. , 1, Humana Press, Springer. NY. (2015).</li>
<li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305 (5685), 846(2004).</li>
<li>Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validating+transcripts+with+probes+and+imaging+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Validating transcripts with probes and imaging technology.</a> Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).</li>
<li>Kwon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization%3A+Quantitative+imaging+of+single+RNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Bmb+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules.</a> Bmb Reports. 46 (2), 65-72 (2013).</li>
<li>Speel, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robert+Feulgen+Prize+Lecture+1999.+Detection+and+amplification+systems+for+sensitive%2C+multiple-target+DNA+and+RNA+in+situ+hybridization%3A+looking+inside+cells+with+a+spectrum+of+colors%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Robert Feulgen Prize Lecture 1999. Detection and amplification systems for sensitive, multiple-target DNA and RNA in situ hybridization: looking inside cells with a spectrum of colors.</a> Histochem Cell Biol. 112 (2), 89-113 (1999).</li>
<li>Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+in+situ+hybridization+method+for+the+detection+of+cellular+RNAs+in+Drosophila+tissue+sections+and+its+application+for+localizing+transcripts+of+the+homeotic+Antennapedia+gene+complex%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex.</a> EMBO J. 2 (4), 617-623 (1983).</li>
<li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li>
<li>Hartmann, C., Jäckle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+relationships+between+a+novel+Drosophila+stripe+expressing+gene+and+known+segmentation+genes+by+simultaneous+visualization+of+transcript+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal relationships between a novel Drosophila stripe expressing gene and known segmentation genes by simultaneous visualization of transcript patterns.</a> Chromosoma. 104 (2), 84-91 (1995).</li>
<li>Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+detection+of+mRNA+transcript+localizations+in+fish+and+fly+embryos+using+alkaline+phosphatase+and+beta-galactosidase+conjugated+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Two-color detection of mRNA transcript localizations in fish and fly embryos using alkaline phosphatase and beta-galactosidase conjugated antibodies.</a> Dev Genes Evol. 209 (5), 317-321 (1999).</li>
<li>Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-%2C+two-%2C+and+three-color+whole-mount+in+situ+hybridization+to+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">One-, two-, and three-color whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos.</a> Methods. 23 (4), 359-372 (2001).</li>
<li>Hauptmann, G., Gerster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+whole-mount+in+situ+hybridization+to+vertebrate+and+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Two-color whole-mount in situ hybridization to vertebrate and Drosophila embryos.</a> Trends Genet. 10 (8), 266(1994).</li>
<li>Hauptmann, G., Gerster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolour+whole-mount+in+situ+hybridization+to+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Multicolour whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos.</a> Development Genes and Evolution. 206 (4), 292-295 (1996).</li>
<li>O'Neill, J. W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-label+in+situ+hybridization+using+biotin+and+digoxigenin-tagged+RNA+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Double-label in situ hybridization using biotin and digoxigenin-tagged RNA probes.</a> Biotechniques. 17 (5), 870-875 (1994).</li>
<li>Söll, I., Hauptmann, G. Multicolored visualization of transcript distributions in Drosophila embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aS%C3%B6ll%2C+I+%22Neuromethods%22">Neuromethods</a>. G, H. auptmann 99, In situ hybridization methods, 45-59 (2015).</li>
<li>Bobrow, M. N., Harris, T. D., Shaughnessy, K. J., Litt, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalyzed+reporter+deposition%2C+a+novel+method+of+signal+amplification.+Application+to+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. Application to immunoassays.</a> J Immunol Methods. 125 (1-2), 279-285 (1989).</li>
<li>Hauptmann, G., Gerster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multicolor whole-mount in situ hybridization.</a> Methods Mol Biol. 137, 139-148 (2000).</li>
<li>Söll, I., Hauptmann, G. Manual and automated whole-mount in situ hybridization for systematic gene expression analysis in embryonic zebrafish forebrain. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aS%C3%B6ll%2C+I+%22Neuromethods%22">Neuromethods</a>. Hauptmann, G. 99, In situ hybridization methods, 171-206 (2015).</li>
<li>Bergalet, J., et al. Subcellular transcript localization in Drosophila embryos and tissues visualized by multiplex FISH. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBergalet%2C+J+%22Neuromethods%22">Neuromethods</a>. Hauptmann, G., et al. 99, In situ hybridization methods, 369-391 (2015).</li>
<li>Walldorf, U., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Empty+spiracles%2C+a+gap+gene+containing+a+homeobox+involved+in+Drosophila+head+development%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Empty spiracles, a gap gene containing a homeobox involved in Drosophila head development.</a> Embo J. 11 (6), 2247-2259 (1992).</li>
<li>Hafen, E., Kuroiwa, A., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+distribution+of+transcripts+from+the+segmentation+gene+fushi+tarazu+during+Drosophila+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial distribution of transcripts from the segmentation gene fushi tarazu during Drosophila embryonic development.</a> Cell. 37 (3), 833-841 (1984).</li>
<li>Grossniklaus, U., Pearson, R. K., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+sloppy+paired+locus+encodes+two+proteins+involved+in+segmentation+that+show+homology+to+mammalian+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The Drosophila sloppy paired locus encodes two proteins involved in segmentation that show homology to mammalian transcription factors.</a> Genes Dev. 6 (6), 1030-1051 (1992).</li>
<li>Hauptmann, G., Gerster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+gene+expression+patterns+reveal+transverse+and+longitudinal+subdivisions+of+the+embryonic+zebrafish+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Regulatory gene expression patterns reveal transverse and longitudinal subdivisions of the embryonic zebrafish forebrain.</a> Mech Dev. 91 (1-2), 108-118 (2000).</li>
<li>Long, S., Rebagliati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+two-color+whole-mount+in+situ+hybridizations+using+digoxygenin-+and+dinitrophenol-labeled+RNA+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Sensitive two-color whole-mount in situ hybridizations using digoxygenin- and dinitrophenol-labeled RNA probes.</a> Biotechniques. 32 (3), 494-500 (2002).</li>
<li>Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescent+in+situ+hybridization+to+define+abutting+and+overlapping+gene+expression+in+the+embryonic+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain.</a> Neural Dev. 6 (1), 10(2011).</li>
<li>Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+whole-mount+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+using+enhanced+tyramide+signal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Sensitive whole-mount fluorescent in situ hybridization in zebrafish using enhanced tyramide signal amplification.</a> Methods Mol Biol. 1082, 175-185 (2014).</li>
<li>Chen, J., Laramore, C., Shifman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple-labeling+whole-mount+in+situ+hybridization+method+for+analysis+of+overlapping+gene+expression+in+brain+tissue+with+high+level+of+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cytol+Histol%22%5BJournal%5D)">Triple-labeling whole-mount in situ hybridization method for analysis of overlapping gene expression in brain tissue with high level of autofluorescence.</a> J Cytol Histol. , S3-S011 (2015).</li>
<li>Murdoch, A., Jenkinson, E. J., Johnson, G. D., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+phosphatase-fast+red%2C+a+new+fluorescent+label.+Application+in+double+labelling+for+cell+cycle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Alkaline phosphatase-fast red, a new fluorescent label. Application in double labelling for cell cycle analysis.</a> J Immunol Methods. 132 (1), 45-49 (1990).</li>
<li>Hauptmann, G., Lauter, G., Söll, I. Application of alkaline phosphatase-mediated azo dye staining for dual fluorescent in situ hybridization in zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHauptmann%2C+G+%22Neuromethods%22">Neuromethods</a>. Hauptmann, G. 99, In situ hybridization methods, 393-404 (2015).</li>
<li>Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev Biol. 11, 43(2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הכלאה באתר (איש) עם בדיקות חומצות גרעין שכותרתו רדיואקטיבית משמש לעתים קרובות כדי לזהות את הלוקליזציה של RNA על סעיפי רקמות. שיטת ISH רדיואקטיבי, לעומת זאת, היא לצרוך זמן, פחות רגיש, ואינה מאפשרת הערכה של דפוסי הפצת תמליל מלאים בכל-mounts. לעומת זאת, בשיטת MC-מאחלים המתוארים במסמך זה מאפשרת השוואה הישירה של תחומים ביטוי גנים רבים בצבעים מנוגדים בתוך עוברים ללא פגע. יש MC-מאחל ליתרון שההקשר היסטולוגית ניכר מייד ומדמיין פשוט על ידי מיקרוסקופ brightfield הסטנדרטי. זה מספק את האפשרות להתייחס תחומים ביטוי גנים טופוגרפיים זה לזה ברמת דיוק גבוהה ולהגדיר אתרי ביטוי ייחודיים וחופפים באופן מהיר ואמין. מצד השני, איש מרובב ניאון (דגים) הוא חזק יותר ביחס לרגישות ורזולוציה ומשמש רצוי, אם סלולארי או אפילו מחדש משנה הסלולרפתרון של גילוי mRNA נדרש. הספקטרום הרחב של תמלילים שמופה על ידי MC-מאחלים מצביע על כך שכמעט כל תמליל ניתן לנתח לא רק בעוברי, אלא גם ברקמות זחל ומבוגרים ובמינים אחרים מאשר דרוזופילה. ואכן, ההליך המתואר המפורט כאן לדרוזופילה, פועל באופן דומה יעיל עם עוברי דג הזברה 11,16,22. יתר על כן, שיטת MC-מאחלים ניתן להתאים למגוון רחב של עוברים חסרי חוליות ובעלי חוליות ודגימת רקמה. Hapten-תוויות וריכוזי בדיקה אנו משתמשים באופן שיגרתי והעמסת, digoxigenin, וביוטין כתוויות hapten של בדיקות RNA. יתר על כן, בדיקות שכותרת dinitrophenol ניתן להחיל, שכבר הציג בניסויי מאחלים דג הזברה 23-25. בדיקות שכותרת העמסה להציג רגישות פחותה בהשוואה לhapten-תוויות האחרות, כך ההעמסה המשמשת הטובה ביותר ואו זיהוי של תמלילי שפע. כל בדיקה עיבד חדש נבדקה ראשונה בניסוי משאלה אחת, שבו ביצועיה מוערכים או באמצעות BCIP / NBT או אדום מהיר כמצע. ריכוז בדיקה נחשב כאופטימלי כאשר איתות חזקה ללא פיתוח רקע מושגת בתוך דקות לכמה שעות. כדי לוודא שתחומי הביטוי של עניין זוהו על ידי MC-מאחלים מלוא היקפם, זה חיוני כדי לחזות כל דפוס תמליל על ידי ניסויי משאלה אחת-תווית באמצעות שילוב המצע רגיש ביותר, BCIP / NBT. הדבר מבטיח כי תחומים ביטוי חלשים לא התעלמו בניסוי רב-היעד. כדי לפצות על הרגישות פחותה של שילובי מצע האחרים זה חיוני להשתמש הוכפל (לשולש) ריכוזי בדיקה בהשוואה לBCIP הכתמה / NBT סטנדרטי. איון pH נמוך צעד איון pH הנמוך יכול להוביל להתפוררות חלקית של הכלאיים mRNA בדיקה / תחושת RNA antisense כותרת hapten וכתוצאה מכך גילוי אותות מופחתים בסיבובי הצביעה השניה והשלישי. כדי להקטין את איבוד ברגישות, צעדי איון הם קצרים ככל האפשר. אנחנו חווינו את זה זמן דגירה 10 דקות ב pH הנמוך מספיק עבור חיסול של AP-פעילות. שוטף מהיר לאחר מכן בכמויות גדולות להבטיח דילול מהיר של conjugates הנוגדן-AP מאוגד ולמנוע מחדש מחייב בדיקות haptenized. הליכים חלופיים כוללים קיבוע paraformaldehyde ואיון חום. עם זאת, חלק ממשקעי הצבע לא לחמם יציב וקיבעון paraformaldehyde עלול שלא להספיק לאיון של AP מלא. איון שלם של המצומד הנוגדן-AP הראשון שימושי יכול להוביל מחדש הדמיה של תבנית ה- mRNA בגילוי הבא סיבוב מוביל לחפיפה חיובית כוזבת בביטוי עם מיני mRNA השני כדי להתגלות. לכן, בניסוי שליטת העוברי דואר מחולקים לשני שברים לאחר איון של המצומד הנוגדן-AP הראשון השימושית. המצומד הנוגדן-AP השני מושמט מחלק השליטה ולא צריך לייצר אות בתגובת הצבע השנייה. עם זאת, אם תגובת הצבע השנייה יוצרת דפוס הפצת אות המתאים הראשון, ולאחר מכן את הליך איון לא היה יעיל. במקרה זה, זמן הדגירה בפתרון תחנת pH נמוך צריך להיות ממושך לניסוי הבא. הזמנות של יישום מצע AP מאז רגישות טיפות עם כל סיבוב של גילוי שלאחר מכן, רצוי לזהות mRNAs פחות בשפע לפני תמלילים שופעים יותר. בנוסף, האדום המהיר ושילובי מצע כחולים מהיר באופן משמעותי פחות רגישים מאשר BCIP purpleblue / כתם NBT, כך שצבעים מהיר מיושמים רצוי בסיבוב הראשון צביעה לגילוי של התמליל הביע החזק. גם שעות זהכיתרון שBCIP הכתמה / NBT שלאחר מכן יכולה להיות במעקב ועצרה בזמן לפני אות purpleblue מקבלת כהה מדי ביחס לצבעים הבהירים יותר המהיר. כך בניסוי שני צבעים סטנדרטיים, ראשון mRNA הביע החזק הוא זוהה על ידי אדום מהיר והשני החלש יותר אחד על ידי BCIP / NBT. כחלופה לצבעים המהיר שילובי מצע INT הצהובים עשויים להיות מיושמים, אשר עם זאת לייצר משקעים שהופכים לפזר אחרי כמה זמן. לכן BCIP / INT מיושם באופן בלעדי בסיבוב הצביעה האחרון. כתוצאה מכך בניסוי שלושה צבעים לעתים קרובות אנו משתמשים אדום הראשונים מהיר, BCIP השני / NBT (או כחול מהיר) ושלישית שילוב מצע INT. שים לב שרצוי לצלם עוברים מוכתמים בהקדם האפשרי בעת החלת INT. זיהוי ניאון של צבעי אזו זה יכול להיות קשה לפעמים לזהות דפוסי ביטוי חופפים כאשר משקע צבע כהה הוא הצללה אחד בהיר יותר. Fאו דוגמא, משקע BCIP / NBT מאוד מפותח יכול להסוות אותות צבע מהיר יותר. אחת דרכים לעקוף בעיה זו היא ללכוד תמונות באופן מיידי לאחר כל צביעה ולהסיר את משקע הצבע שימושי לפני הסיבוב הבא לאיתור. במקרה זה, צבע אזו אלכוהול מסיס במשקעים (אדום מהיר) וINT יוסרו על ידי שטיפות אתנול אחרי סיבובי הגילוי הראשונים והשני, בהתאמה, ומכתים BCIP / NBT מיושם כAP-המצע האחרון 26. אפשרות נוספת היא לנצל את תכונות ניאון של אזו צבעים. אדום מהיר ניתן דמיין באמצעות מסנן rhodamine קובע 27, בעוד כחול מהיר ניתן לצפות במסננים מרחיק אדומים 28,29. השוואה או כיסוי של תמונות chromogenic וניאון יכולה לחשוף את האתר של, פיתוח אות גישה זו distribution.Using-שיתוף BCIP / NBT יש ללהיפסק בזמן, כך שזה לא יהפוך לצפוף מדי ולהרוות את אות הניאון של צבע אזו מוצר תגובה.

הכלאה באתר (איש) היא השיטה סטנדרטית לגילוי ולוקליזציה של תעתיקי רנ&quot;א בהקשר מורפולוגיים, בתוך תאים, רקמות ואורגניזמים 1. האותות המיוצרים על ידי הליך ISH הם דמיינו בדרך כלל על ידי מערכות גילוי רדיואקטיבי, ניאון וchromogenic. בשנים האחרונות התקדמות טכנולוגית משמעותית בISH הניאון (דגים) 2 הביאו רגישות ורזולוציה השתפרה באופן דרמטי, המאפשרות איתור וכימות של ביטוי RNA בתא בודד ורמות תת-תאיות והדמיה RNA עד מולקולות בודדות 3,4 .While שיטות FISH מולקולה בודדת מתוחכמות המשמשות ליישומים מיוחדים נוסף, איש chromogenic נפוץ כRNA שגרתי בשיטת זיהוי אתר במחקר ואבחון קליני. לגילוי chromogenic תגובות ממטרים אנזים משמשות, אשר יוצרות מוצרים גלויים בצבעים מנוגדים באתריםשל הכלאה 5. זה היתרון שהדמית RNA יכולה להיות משולבת עם כתמים היסטולוגית שיגרתי והקשר מורפולוגיים ניכר מייד על ידי מיקרוסקופ brightfield הסטנדרטי. יתר על כן, רב של מצעי הצבע מיושמים לייצר משקעים, שהם יציבים בתקשורת הרכבה אורגנית ו / או מימית, כך שניתן להשיג הכנות מדגם קבועות 5. בדרוזופילה, פרוטוקולי ISH ראשוניים להחיל בדיקות שכותרתו רדיו-איזוטופי לגילוי תמליל על חומר מחולק 6. למרות שזה קשה לשחזר מסעיפי רקמות דפוסי תמליל מלאים של עוברים שלמים או מערכות איברים, יישום נהלי ISH chromogenic עם בדיקות שכותרת אינה רדיואקטיבית מאפשר לזהות באופן גלובלי הפצות RNA בכל-mounts 7. למרות וריאציות רבות של איש chromogenic קיימות, באופייני כל הר הכלאה באתר היב פרוטוקולים (רוצה)בדיקות שכותרת hapten ridized מזוהות על ידי נוגדנים נגד hapten מצומדת לאנזים כתב ותעתיקי mRNA הם דמיינו ידי אַב צֶבַע מזרז. לוח של משקעים בצבעים שונים המיוצרים על ידי כתב אנזימי phosphatase אלקליין (AP), peroxidase חזרת (POD), ובטא-galactosidase (GAL) מאפשר זיהוי הייחודי של מטרות מרובות ובעונה אחת המדגם 8-14. עם זאת, פעילות האנזימטית POD נמשכת רק לתקופת זמן מוגבלת ותגובת colorimetric הגל היא קצת פחות רגישה, כך שללא הגברה אות (tyramide) נוספת 15 הגילוי של תמלילים פחות בשפע יכולה להיות מאתגרת עם אנזימים אלה. לעומת זאת, הפעילות המתמשכת של AP מאפשרת למחזור מצע לטווח ארוך ויחס אות לרעש גבוה. ולכן, זיהוי רציף באמצעות אנזים כתב AP עם מצעים בצבע שונה הוכיח את יעילותו בתוקףזיהוי ייחודי של עד שלושה תעתיקים שונים בעוברים בודדים 10-12,16. למשאלה זו רב-יעד chromogenic (MC-תרצה) שיטה (איור 1) 14, בדיקות RNA antisense שכותרתו מופקות על ידי שעתוק במבחנה ומסומנת באחד מhapten-התוויות הזמינות. הם עוברים פורמלדהיד קבוע וpermeabilized על ידי טיפול מתנול ועיכול K proteinase. הכלאה של עוברים מתבצעת בו זמנית עם עד שלוש בדיקות RNA antisense שכותרתו שונה בכל ספציפית לגן אחר. לאחר הסרת הבדיקה מאוגד על ידי שטיפות החמרה כל hapten-תווית דמיין בסיבוב של גילוי נפרד. סיבוב זיהוי יחיד מורכב מדגירה של עוברים עם נוגדן אנטי hapten מצמידים את AP והדמיה RNA על ידי יישום של AP-מצע שמייצר משקע צבע יציב מקומי. לאחר זיהוי נוגדנים וצביעה, conju נוגדן-AP מיושםהשער הוסר על ידי שטיפת pH נמוכה. בניסויים ססגוניות, כל סיבוב של זיהוי מעסיק נוגדנים ממוקדים נגד hapten תווית שונה וכל דפוס תמליל היא דמיינה על ידי מצע שונה צבע (טבלת 1). עוברים הם רכובים בגליצרול וצלמו תחת מיקרוסקופ מתחם ברזולוציה גבוהה באמצעות התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) אופטיקה.

<table><tbody><tr><td>מים מטופלים נטולי יונים, דיאתילפירוקרבונט (DEPC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0603</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA פולימראז&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0111</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA פולימראז&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0101</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA פולימראז&nbsp;</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>EP0131</td><td></td></tr><tr><td>מעכב RNase RiboLock&nbsp;</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>DNase I, ללא RNase&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>NTP סט</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigenin-11-UTP</td><td>Roche</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-12-UTP</td><td>Roche</td><td>11427857910</td><td></td></tr><tr><td>ביוטין-16-UTP</td><td>Roche</td><td>11388908910</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום אצטט</td><td>Applichem</td><td>A2936</td><td></td></tr><tr><td>אתנול, מוחלט&nbsp;</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>di-נתרן מימן פוספט</td><td>Scharlau</td><td>SO0339</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דימימן פוספט</td><td>Scharlau</td><td>SO0331</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאינאז K</td><td>תרמו Scientific</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>סיגמא</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית&nbsp;</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>תלת-נתרן ציטראט</td><td>Scharlau</td><td>SO0200</td><td></td></tr><tr><td>פורממיד נטול יונים</td><td>Applichem</td><td>A2156</td><td></td></tr><tr><td>RNA מסוג VI משמרי טורולה</td><td>Sigma</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>מלח נתרן</td><td>הפרין Applichem</td><td>A3004</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulfate מלח נתרן</td><td>סיגמא</td><td>D6001</td><td></td></tr><tr><td>סרום כבשים</td><td>Sigma</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>שברי כבשים אנטי-ביוטין-AP Fab&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11426303001</td><td></td></tr><tr><td>Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) שברי Fab</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Sheep anti-fluorescein-AP Fab שברי Fab</td><td>Roche</td><td>11426303001</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-dinitrophenyl-AP</td><td>מעבדות וקטור</td><td>MB-3100</td><td></td></tr><tr><td>Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane</td><td>Scharlau</td><td>TR04241000</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>Scharlau</td><td>MA0036</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Scharlau</td><td>SO0227</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Applichem</td><td>A3006</td><td></td></tr><tr><td>סט טבליות אדום מהיר</td><td>Sigma</td><td>F4648</td><td></td></tr><tr><td>מלח BB כחול מהיר</td><td>Sigma</td><td>F3378</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol-AS-MX-phosphate</td><td>Sigma</td><td>N5000</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol-AS-GR-phosphate</td><td>Sigma</td><td>N3625</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol-AS-BI-phosphate</td><td>Sigma</td><td>N2250</td><td></td></tr><tr><td>מג'נטה-פוסט</td><td>Biosynth</td><td>B7550</td><td></td></tr><tr><td>INT</td><td>Sigma</td><td>I8377</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Applichem</td><td>A1243</td><td></td></tr><tr><td>BCIP</td><td>Applichem</td><td>A1117</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת INT/BCIP</td><td>רוש</td><td>11681460001</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול 86-88%</td> <td>Scharlau</td><td>GL0023</td><td></td></tr><tr><td>חממה אוניברסלית</td><td>Memmert</td><td>BE400</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Memmert</td><td>WB14</td><td></td></tr><tr><td>מענק בלוק חום</td><td></td><td>QBT2</td><td></td></tr><tr><td>Netwell&nbsp; מוסיף 15 מ"מ</td><td>קורנינג</td><td>3477</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מנשא Netwell 15 מ"מ</td><td>קורנינג</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים 12 בארות</td><td>קורנינג</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 24 בארות</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל מיקרו צינור</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2.0 מ"ל מיקרו-צינור</td><td>Sarstedt</td><td>72.691</td><td></td></tr></tbody></table>

רב-יעד chromogenic כל הר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

כדי לנתח רשתות רגולציה גן פעילה בפיתוח וorganogenesis זה הכרחי להגדיר במדויק כיצד גנים השונים באים לידי ביטוי ביחס המרחבי לזה באתר עוברי. רב-יעד chromogenic כל הר הכלאה באתר (MC-ירצה) מאוד מקל ההשוואה מיידית של דפוסי ביטוי גנים, שכן היא מאפשרת הדמיה ייחודית של מיני mRNA שונים בצבעים מנוגדים באותו דגימת המדגם. זה מספק את האפשרות להתייחס תחומים ביטוי גנים טופוגרפיים זה לזה ברמת דיוק גבוהה ולהגדיר אתרי ביטוי ייחודיים וחופפים. בפרוטוקול שהוצג, אנו מתארים הליך MC-מאחלים להשוואת דפוסי ביטוי mRNA של גנים שונים בעוברי תסיסנית. עד שלוש בדיקות RNA, כל ספציפיות לגן אחר ושכותרתו על ידי hapten שונה, בו זמנית הם הכלאת דגימות העובר וזוהה לאחר מכן על ידי אלקליאימונוהיסטוכימיה colorimetric ne phosphatase מבוסס. ההליך המתואר מפורט כאן לדרוזופילה, אבל עובד באותה המידה גם עם עוברי דג הזברה.

הפרוטוקול המתואר מאפשר ההדמיה בו זמנית של דפוסי תמליל מרובים בצבעים שונים. MC-מאחלים מספק יתרון להשוות ישירות את דפוסי הביטוי של גנים שונים באותה העובר. כדוגמא, את דפוסי הביטוי של spiracles הריק (EMS) 19, Fushi tarazu (FTZ) 20 ומרושלים לזווג 1 (slp1) 21 בהשוואה ישירות בעוברים בblastoderm תסיסנית melanogaster ומדמיינים במגוון רחב של גווני צבע (איור 4) . שילובי מצע AP שונים זמינים כדי לקבל פנל של מנוגד משקעים צבע (טבלה 1). משקע הצבע האדום המיוצר על ידי אדום מהיר והמשקע הסגול המיוצר על ידי BCIP / NBT ניתן להבחין בקלות ולכן משמשים נפוץ ביותרly בניסויים בשני צבעים (איור 4 א). עם זאת, את כתם BCIP / NBT יכול להפוך במהירות לצבע ולא כהה, כך שהצבע האדום המהיר מוסווה במקרה של שיתוף הפצה החלקית של תמלילים. לכן, היישום של כחול מהיר יכול להיות יתרון, אשר מייצר מוצרים כחולים, ירוקים וסגולים בשילוב עם NAMP, NAGP וNABP, בהתאמה (לוח 1). השילוב של כחול מהיר עם NAMP נותן צבע תכלת שהוא בקלות להבחין מהמוצר האדום המהיר בתחומים ביטוי סמוכים או חופפים, כפי שמוצגים כאן לEMS ואתרי slp1 ביטוי דמיינו באדום וכחול, בהתאמה (איור 4). שילוב NAGP הכחול המהיר מספק ניגוד חזק דומה לכתם האדום המהיר, כך שתחום EMS הירוק הוא בבירור ייחודי מאתר הביטוי slp1 האדום (איור 4C). עם זאת, אם EMS ואתרי ביטוי slp1 הם דהtected ידי כחול NABP המהיר ואדום מהיר, בהתאמה, וכתוצאה מכך סגול ומשקעי צבע אדומים פחות ניכרים (איור 4D). כפי שצוין לעיל, אדום מהיר ומהיר הכחול NAGP קלים להבחין, כפי שמוצג על ידי slp1 וביטוי FTZ באדום וירוק, בהתאמה (איור 4D). MagentaPhos בשילוב עם INT מייצר משקע צהוב, המשמש כדי לחשוף את הביטוי המגזרי של FTZ (איור 4C, E). המשקע בצבע הצהוב יוצר ניגוד טוב למצעים בצבע הכחולים כפי שהודגם על ידי זיהוי של slp1 וFTZ עם כחול NAMP המהיר והפרקליט הצבאי הראשי / INT, בהתאמה (איור 4E). עם זאת, המשקע הצהוב ניכר פחות קל מהמוצר האדום המהיר. תחום הביטוי צבעוני הצהוב של EMS יכול להיות כמעט Disti<html> nguished מהביטוי מקורי של slp1 מוצג באדום (איור 4F). לכן, שילוב של מצעי צבע צריך להיות שנבחר בקפידה עבור כל ניסוי. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig1.jpg" /> איור 1. תרשים זרימה של MC-תרצה. להדמיה צבעונית של שלושה דפוסי תמליל ייחודיים, לבחור בין conjugates שונה נוגדן-AP ושילובי מצע צבע בכל מחזור זיהוי. קיצורים: AP, phosphatase אלקליין; יו, ביוטין; DIG, digoxigenin; Fluo, והעמסת. לקיצורים אחרים לראות אגדות איור 4 וטבלה 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53830/53830fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> s / ftp_upload / 53,830 / 53830fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2. הוספת כנישאי עובר. (א) הוספת מצוידת בתחתית עם ממברנות פוליאסטר של 15 מ&quot;מ קוטר ו -74 מיקרומטר גודל רשת משמשות כנישאי עובר דרוזופילה. (ב) מוסיף הם התאספו בלוחות 12-גם, שמתפקדים כמאגר למגשי הפתרונות השונים. (ג) ספקים וידיות זמינים מאפשרים עיבוד של (D) 12 מוסיף / דגימות עובר בו-זמנית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53830/53830fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig3.jpg" /> הרכבה איור 3. עוברים מוכתמים. עוברים הם רכובים בירידה של גליצרול 70% בין שתי ערימות של coverslips, אשר מתפקד כמפרידים. מרגש עדין של האפליקציהcoverslip הגדול שיקר עוזר לסובב את העוברים הרכובים לכיוון הרצוי לתצפית וצילום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53830/53830fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig4.jpg" /> איור 4. הדמיה ססגוניות של תעתיקי mRNA בעוברי תסיסנית. דוגמאות לניסויי MC-מאחלים בעוברות תסיסנית מוצגות מנופים לרוחב. דפוסי ביטוי mRNA של spiracles הריק (EMS), Fushi tarazu (FTZ) ומרושל לזווג 1 (slp1) הם דמיינו ידי שילובים שונים AP צבע מצע, אשר הצביעו על כל לוח. תמלילים אותרו על ידי () Fluo FTZ וEMS DIG, ( <strong&gt; B) slp1 Fluo, EMS BIO, ולחפור FTZ, (ג) EMS BIO, slp1 Fluo, ולחפור FTZ, (ד) ביו FTZ, slp1 Fluo, וEMS DIG, (E) slp1 Fluo, EMS DIG, ו FTZ BIO, (F) ביו FTZ, slp1 Fluo, וEMS DIG שכותרתו בדיקות. בדיקות שכותרת hapten אותרו immunohistochemically אחד אחרי השני בהזמנות המפורטות. קיצורים: כחול מהיר FB; FR, לוח אדום מהיר. לקיצורים אחרים לראות אגדות איור 1 וטבלה 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53830/53830fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שילוב מצע </td><td> הוסף לחיץ 1 מיליליטר AP </td><td> Concentration [מיקרוגרם / מיליליטר] </td><td> מאגר AP </td><td> צֶבַע </td><td> רגישות אות </td></tr><tr><td> BCIP NBT </td><td> 3.5 μl 4.5 μl </td><td> 175 337.5 </td><td> SB9.5 </td><td> סָגוֹל </td><td> +++ </td></tr><tr><td> INT MAG </td><td> 5 μl 5 μl </td><td> 250 250 </td><td> SB9.5 </td><td> צָהוֹב </td><td> + </td></tr><tr><td> פתרון מניות BCIP / INT </td><td> 7.5 μl </td><td> 250 250 </td><td> SB9.5 </td><td> צָהוֹב </td><td> + </td></tr><tr><td> מהיר הכחול NAMP </td><td> 5 μl 5 μl </td><td> 250 250 </td><td> SB8.2 </td><td> כָּחוֹל </td><td> ++ </td></tr><tr><td> מהיר הכחול NABP </td><td> 20 μl 10 μl </td><td> 1,000 500 </td><td> SB8.2 </td><td> סָגוֹל </td><td> ++ </td></tr><tr><td> מהיר הכחול NAGP </td><td> 10 μl 10 μl </td><td> 500 500 </td><td> TT8.2 </td><td> יָרוֹק </td><td> + </td></tr><tr><td> מהיר האדום NAMP </td><td> לוח 1 </td><td> 1,000 400 </td><td> TT8.2 </td><td> אָדוֹם </td><td> ++ </td></tr></tbody></table> 1. שילובי שולחן מצע קיצורים: +++, חזק;. ++, בינוני; +, NBT החלש, כלוריד הכחול-4 ניטרו-tetrazolium; BCIP, 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl-פוספט; INT, 2 (4 iodophenyl-) -3- (4-nitrophenyl) -5-פניל-tetrazolium כלוריד; MAG, מגנטה-Phos, 5-bromo-6-כלורו-3-indolyl-פוספט, NAMP, Naphthol-AS-MX-פוספט; NABP, Naphthol-AS-BI-פוספט; NAGP, Naphthol-AS-GR-פוספט; SB9.5, חיץ מכתים ב- pH 9.5; SB8.2, חיץ מכתים ב- pH 8.2; TT8.2, חיץ טריס-Tween ב- pH 8.2.

אנו מתארים הליך רב-יעד chromogenic כל הר הכלאה באתר (MC-תרצה) בעוברים שלמים תסיסנית מאפשרים זיהוי סימולטני וספציפי של שלושה דפוסי הפצת mRNA שונים על ידי מנוגד משקעים צבע.

רב-יעד Chromogenic כל הר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

המטרה הכללית של WISH כרומוגני רב-מטרות היא להקל על מיפוי דפוסי התהלוּת של mRNA בתוך עוברים שלב Drosophila שלמים. באמצעות שיטה זו, ניתן להשוות באופן ישיר את המיקומים של mRNA של שלושה גנים שונים בתוך אותו עובר. ניתן להשתמש ב-WISH רב-צבעים כדי לייצר מפות ביטוי גנים באורגניזמים מתפתחים בצורה מהירה ואמינה. דבר זה יכול לספק רמזים חשובים על אינטראקציות של ויסות גנים, התפתחות עוברית ואקטיבית, או אורגנוגנזה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שדפוסי ביטוי mRNA של גנים שונים מוצגים בצבעים מובחנים ומנוגדים. בדרך זו, ניתן להדגיש אתרי ביטוי ייחודיים וחופפים בדיוק גבוה. באמצעות פרוצדורות סטנדרטיות, אספו, בצעו דכוריאציה (dechorionate), קיבוע ודויטליניזציה (devitellinize) לעוברים הדרושים. אחסנו אותם במתנול במקפיא עד למועד השימוש. כעת, התחילו עם העוברים בטמפרטורת החדר. הכניסו אינסרט לבאר הראשונה של פלטת 12 בארות והוסיפו שני מיליליטר של מתנול. העבירו את הכמות הרצויה של עוברים אל האינסרט המשמש לנשיאת העוברים לאורך הפרוצדורה. כעת, בצעו רהידרציה לעוברים באמצעות דגרימות של שלוש דקות בסדרה של ריכוזי מתנול יורדים. התחילו ב-75% מתנול ב-PBS. המשיכו עם 50% מתנול ב-PBS-T. לאחר מכן, השתמשו ב-25% מתנול ב-PBS-T וסיימו בשתי דגרימות ב-PBS-T טהור. לאחר מכן, בצעו קיבוע מקדים (prefix) לעוברים ב-4% פאראפורמאלדהיד ב-PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. הסירו את חומר הקיבוע באמצעות ארבעה שטיפות ב-PBS-T. במהלך שלבי השטיפה, הפשירה והכינו את תמיסות העבודה עבור Proteinase K וגליצין. לאחר השטיפות, בצעו פרמיאביליזציה לעוברים ב-Proteinase K שהוכן טרי למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. עצרו את התגובה באמצעות שתי שטיפות של דקה אחת בגליצין שהוכן טרי. לאחר מכן, בצעו קיבוע נוסף (postfix) לעוברים ב-4% פאראפורמאלדהיד ב-PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את הפאראפורמאלדהיד בארבע שטיפות ב-PBS-T של שלוש דקות כל אחת. לאחר מכן, העבירו את העוברים לתמיפת קדם-היברידיזציה (prehybridization buffer). ניתן לאחסנם במקפיא עד למועד השימוש. התחילו בחלוקת העוברים בתמיפת הקדם-היברידיזציה לתוך מבחנות של שני מיליליטר. העבירו מנה (aliquot) של כ-15 מיקרוליטר של עוברים ששקעו לכל מבחנה. כעת, דגרו את העוברים ב-65

multi-target-chromogenic-whole-mount-situ-hybridization-for-comparing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

סרט הווידאו הזה מדגים 2 צבעים הר שלם הכלאה באתרו, שיטה שבאמצעותה דפוס ביטוי במרחב ובזמן של 2 גנים שונים יכולים להיות דמיינו בעוברים אפרוח צעיר. שיטה זו הוצגה לראשונה על ידי דייוויד וילקינסון, דומינגוס אנריקה, פיל אינגהם ודוד איש-Horowicz.

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

פרוטוקול זה מתאר את השימוש microinjection הדמיה ברזולוציה גבוהה...

Microinjection טכניקות לימוד מיטוזה ב תסיסנית melanogaster סינסיציאלי עובריים

Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

הר שלם<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של E8.5 לעוברי E11.5 עכבר

וריאציה פנוטיפי עבור תכונות יכול לנבוע מוטציות cis-הרגולציה (Cre) רצפים אלמנט השליטה דפוסי ביטוי גנים. שיטות נגזר לשימוש תסיסנית melanogaster יכול כמותית להשוות את רמות דפוסי במרחב ובזמן של ביטוי גנים בתיווך או שונה באופן טבעי וריאנטים cre.

השוואה כמותית של Cis-רגולטוריות (Cre) אלמנט פעילות טראנסגנטי תסיסנית melanogaster</em

כאן אנו מתארים שלם הר...

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה להדמיה של נוירואפיתל עין גולם חי של דרוזופילה. שיטה זו מפצה על תנועת רקמות וטופולוגיה לא אחידה, משפרת את ההדמיה של גבולות התא באמצעות שימוש בחלבוני צומת מרובים המתויגים ב-GFP, ומשתמשת במתקן הדמיה המורכב בקלות.

Live-הדמיה של דרוזופילה גלמי עין

המתואר RNA בחיי עיר הכלאה פרוטוקול מאפשרת הגילוי של RNA כל עוברי דרוזופילה או רקמות גזור. באמצעות לוחות 96-ובכן microtiter tyramide אות הגברה, תעתיקים שניתן לאתר ברזולוציה גבוהה, רגישות, ואת התפוקה, בעלות נמוכה יחסית.

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

עבודה זו מתאר פרוטוקול עבור הדור של רזולוציה גבוהה בחיי עיר ויטמינצ'יק ספריות מ מבוים בחוזקה gastrulation קדם דרוזופילה melanogaster עוברי.

הדור של הגנום כולו כרומטין קונפורמציה לכידת ספריות מעוברים דרוזופילה בחוזקה בשלבים המוקדמים

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מבוססת יריעות אור היא הכלי בעל הערך הרב ביותר בביולוגיה התפתחותית. נושא מרכזי במחקרים השוואתיים הוא שונות הסביבה. הפרוטוקול שלנו מתאר מסגרת ניסיונית להדמיה חיה בו זמנית של דגימות מרובות, ולכן מטפל בנושא זה באופן פעיל.

הדמיה חיה בו זמנית של עוברי חרקים מרובים במיקרוסקופים פלואורסצנטיים מבוססי גיליון אור קאמרית לדוגמה

Expand-Assisted Fluorative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) היא טכניקה חזקה המשלבת מיקרוסקופ הרחבה עם הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) כדי לזהות ביטוי של גנים מרובים ברקמה עבה. פרוטוקול זה מתאר את ההתקדמות האחרונה בשיטה ואת התאמתה לתיוג מערכת העצבים המרכזית של דרוזופילה השלמה.

זיהוי מולטיפלקס של ביטוי גנים במוח הדרוזופילה השלם באמצעות פלואורסצנציה איטרטיבית בסיוע הרחבה בהכלאה באתרה

למד את שיטת MC-WISH לזיהוי תבניות ביטוי mRNA בעוברי דרוזופילה. טכניקה זו מאפשרת השוואה של שלושה גנים שונים בצבעים ניגודיים לחקר ביולוגיה התפתחותית ומיפוי גנטי מדויק.

רב-יעד Chromogenic כל הר

גלה סרטונים נוספים