Name: גלאוקומה וישכנע נוהל בבית In vivo מודל עכברוש ואת כל הר רשתית הכנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: למדו לגרום לאובדן תאי גנגליון רטינליים בעכברוש באמצעות הזרקת מלח היפרטונית לווריד האפיסקלרלי. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני גלאוקומה ואסטרטגיות הגנה עצבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C. Linn נתמך על ידי מענק NIH (NIH NEI EY022795).

כל הנהלים באמצעות בנושאים בעלי חיים היו בהתאם לסטנדרטים של לשכת טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש (IACUC) באוניברסיטת מערב מישיגן. 1. בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש חולדות זכרים ונקבה גיל 3 חודשים במחקר זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור חיות באור 12 hr / חושך מחזור עם גישה חופשית למזון ומים. </li></ol> 2. הכנת קוקטייל KAX עבור הרדמת בעלי החיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 50 מ&quot;ג xylazine (20 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ב 5 מ&quot;ל קטמין (100 מ&quot;ג / מ&quot;ל) עם 1 מ&quot;ל acepromazine (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ו 3 מ&quot;ל של מים מזוקקים. מערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר עם מסנן מזרק לאחסן את הפתרון הזה לתוך בקבוק סרום 10 מ&quot;ל. </li></ol> 3. הזרקת KAX <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול בעלי חיים (ז) ולהחזיר לכלוב עד מוכן להזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 0.1 מ&quot;ל KAX / 100 גרם משקל גוף החיה intraperitoneally, באמצעות מזרק אינסולין 1 מ&quot;ל עם מחט 28 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתירעבור החיה איבד את הכרתו. בדוק רפלקסים ידי צובט את הרגליים והזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את כל החיות בשלום במעבדה למשך הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הניתוח, להחליף חיות לתוך הכלובים שלהם ולשמור נוח RT עד התודעה הוא חזר. רק לחזור חיות למתקן חיה כאשר החיות להתעורר ולחדש התנהגות נורמלית. </li></ol> 4. הכנה לכירורגיה ו microneedle אסיפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון 2 M NaCl סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש חולץ microelectrode (תרשים 1C) כדי למשוך קוטר פנימי אחד 0.86 מ&quot;מ סטנדרטי כבד מלוטשים צינור בורוסיליקט חומה דקה לשתי microneedles זכוכית קוני דק (איור 1D, איור 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למילוי microneedle אחד מהשלב הקודם עם 2 M מלוחים באמצעות מחט ומילוי מזרק מזרק 1 מ&quot;ל (איור 1B). הקש החוצה בועות אוויר מהקצה של האלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים מזרק השני 1 מ&quot;ל עם 2 MNaCl. חבר מחט 18 G ולאחר מכן לצרף אורך (כ 10 אינץ &#39;) של (איור 1 א) צינורות פוליאתילן. השתמש בוכנת המזרק כדי למלא את צינורות פוליאתילן עם מי מלח דרך המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הן microneedle הצינורות מלאים מלוח, בזהירות לחבר את השני. הוצא כל אוויר הקשר ביניהם (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דק שפוע קצה microneedle על ידי גירוד זה מאוד קל נגד הזרם של מגבת נייר כמובן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את ההתנגדות של microneedle ידי דחיפת הבוכנה בעדינות על המזרק עד זרם של נוזל בסדר ניתן לראות על מגבת נייר. זרם הנוזל צריך להיות לא יותר מ -0.5 מ&quot;מ. </li></ol> 5. הכנת בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 1 - 2 טיפות הרדמה מקומית כדי קרני (פתרון העיניים Hydrochloride Proparacaine, USP, 0.5%). מתן עד לא רפלקס עינית מתרחש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך שפם עם מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Saturate מוליך עצת כותנה עם פתרון בבטאדין ואזור ספוגי סביב העין הניסיונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ, לצרף hemostat כדי לצבוט את העפעף התחתון לתפוח העין, לחשוף את וריד episcleral ולהגביל תנועת העין. (איור 3, ראש חץ) </li></ol> 6. הזרקת גלאוקומה ותשכנע מלוחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הרכבת microneedle והחיה ערוכות, להתחיל זריקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר החיה אישר שלא להגיב על רגליו / זנב קמצוץ, לנקב את הווריד episcleral בזהירות עם microneedle ידי בא בזווית נמוכה בין 10 ל -20 מעלות אל הווריד (איור 3, חץ לבן). נקב מוצלח לווריד לעין בעת דם נכנס קצה microneedle (איור 3, חץ שחור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט באופן ידני להזריק כ 50 מלוחים μl לווריד. זה אמור לקחת בערך 10 שניות. הוורידים יהיה לבן מחוויר כמו מלח מפיצה throאיכס כלי הדם (איור 4, ראש החץ). אזורים מסוימים עשויים לשמור על חזות אדומה דם (איור 4, חץ). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע זריקה שנייה לווריד, מול לאתר של הראשון, כדי להבטיח פגיעה ברשתית יסודית כדי שכבת תא גנגליון ברשתית השלמה. הערה: בתוך דקות, אחד צריך לראות עכירות ברורות דרך קשתית העין כמו המלח מפיץ באמצעות מערכת כלי הדם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את העין מול מטופל לצורך הקמת בקרה פנימית. </li></ol> 7. שחזור בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את hemostat. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מוליך כותנה ליישם משחה אנטיביוטית משולשת (אבץ Bacitracin, סולפט neomycin, סולפט B polymysin) לאתר הדק ידי hemostat וכדי מוזרקים. נזק לרקמות סביב העין אינה מתרחשת באמצעות hemostat. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &gt; חיות הרדימו מקום בכלובים שלהם על שמיכת מים חמה במחזור כדי קודמותהיפותרמיה אף אוזן גרון. לשמור על חיות תחת השגחה עד תודעת התנהגות נורמלית הם שהעלו. הובלת בעלי חיים ערים בחזרה למושבה החיה. בעלי החיים להישאר במושבה עד הזמן של קרבה. </li></ol> 8. קרבנות והסרה רשתית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חודש לאחר ההליך לגרום גלאוקומה, בעלי חיים מומתים בחנק CO 2 ו לנקב החזי משנית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה בחדר ולשים את המכסה על מאובטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את שסתומי CO 2 ו רגולטור גז כדי לאפשר נפח 20% / min CO 2 עקירה של חמצן בתא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר ארבעה עד 5 דקות עבור החיה לפוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את השסתומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חיה מהאולם לבצע ניקור בית החזה משני עם אזמל סטרילי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המתת חסד, ובעזרת אזמל לחתוך את רקמת החיבור בתוך חלל מסלולית סביב העין, being להיזהר לא לחתוך לתוך גלגל העין עצמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להשתמש במספרי קצה מעוקלים לחתוך את עצב הראייה וכל רקמה הנותרים כדי לחלץ את גלגל העין השלמה. מניח גלגל עין חילוץ בצלחת פטרי הפנויה 60 מ&quot;מ x 15 מ&quot;מ סטרילי המכילה PBS הטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן עיינית של גלגל העין. לשם כך, לעשות חתך קטן עם האזמל רק אחורי לגבול בין הקשתית בלובן העין. בצע חתך זה סביב ההיקף של העין עם מספריים באביב קטנים להסיר את האונה הקרנית של גלגל העין. ההמיספרה מחובר עצב הראייה נשאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא רשתית ורודה / הבז &#39;דקה מאוד בתוך עיינית מן החיה המורדמת. החזק את שכבת פיגמנט של הרשתית עם מלקחיים קהים לייצב עיינית. השתמש עוד זוג מלקחיים סגורים מאוד להקניט הרשתית השלמה השלמה בעדינות מעל החלק האחורי של העין. הימנע צובט, מושך, או מושך הרשתית ישירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספרי מעיין קטנים כדי לחתוך אתהאזור שבו עצב הראייה עדיין מחוברת הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפידו לחתוך משם כל אפיתל הפיגמנט שיורית או רקמות scleral מהרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה העברה, בעדינות מאוד להעביר את הרשתית המבודדת על sylgard נקי מצופה 35 מ&quot;מ x 10 מ&quot;מ צלחת פטרי המכילה PBS הטרי. </li></ol> 9. הכנת רשתית כל ההר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בצלחת sylgard, להשתמש במלקחיים ומחט קקטוס אחד להצמיד את הרשתית במקום. שמור את שכבת התאים הגנגליון ברשתית פונה כלפי מעלה עצב הראייה למטה. צורת חצי כדור של הרשתית בולטת אפילו לאחר קיבוע. העקמומיות של הרשתית תהיה להתכרבל לכיוון התקרה כאשר שכבת תא גנגליון ברשתית היא בכיוון הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים קטנים לחתוך את הרשתית לארבעה רבעים, מה שהופך את הצורה של תלתן בעל ארבעה עלים קורן ראש עצב הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את הרביעים של הרשתית עם מחטי קקטוס נוספות כדי להפוך את הרשתית שטוחה ככל האפשר without מתיחה (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הרשתיות הצמיד בצלחת Sylgard עם 3 מ&quot;ל של 4% paraformaldehyde O / N ב RT. </li></ol> 10. נוגדן מכתים של הרשתית הערה: רשתיות קבועות כתם עם נוגדנים ראשוניים ומשניים לצפייה נוירונים ברשתית (איור 6). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קבועים, רשתיות שטוחות רכוב שלוש פעמים במשך 2 דקות כל אחד ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize את הרשתיות עם 1% טריטון X-100 עם בסרום שור עוברי 1% ב PBS במשך 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף רשתיות שלוש פעמים, 2 דקות כל אחד, ב- PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף פעמיים עם 0.1% Triton X-100 ב- PBS, 5 דקות לכל לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף פעמים עם PBS, 5 דקות לכל לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם 1% טריטון X-100 ו בסרום שור עוברי 1% PBS ב RT במשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף פעמיים עם 0.1% Triton X-100 ב- PBS, 5 דקות לכל לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף פעמים עם PBS, 5 דקות לכל לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל רשתית בסרום שור 3 מיליליטר 1% עוברי ב- PBSעם CD90 אנטי עכברוש עכבר מטוהר / העכבר CD90.1 (1: 300 דילול) O / N ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף רשתיות פעם עם 0.1% Triton X-100 ב PBS במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף פעמים עם PBS, 5 דקות לכל לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל הרשתית ב 3 מ&quot;ל PBS (לא FBS) עם IgG עז משנית אלקסה פלואוריד 594 אנטי עכבר (1: 300) O / N ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף רשתיות עם PBS בנדיבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח, להסיר בזהירות מחטי קקטוס מהרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להעביר רשתיות על גבי שקופיות מיקרוסקופ עם טפטפת העברה. הקפד לשמור על האוריינטציה עם שכבת תא גנגליון ברשתית מופנה כלפי התקרה. צורת חצי כדור של הרשתית בולטת אפילו לאחר קיבוע. העקמומיות של הרשתית תהיה להתכרבל לכיוון התקרה כאשר שכבת תא גנגליון ברשתית היא בכיוון הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוג כל PBS עודף עם KimWipe או חומר סופג כגון אחרים. היזהר שלא לספוג את הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 טיפות של ½ גליצרול ½ PBS לפי משקל כמו בבוקרתקשורת ounting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסי רשתית עם coverslip, הימנעות בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslip מאובטח באמצעות לק ברור, דבק, או דבק אחר. </li></ol>

למחברים אין אינטרסים סותרים או מתחרים לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר שיטה של גרימת תנאים כמו-גלאוקומה במודל חולדה vivo. הליך זה משתמש זריקה של תמיסת מלח היפרטוני לגרום הצטלקות של meshwork trabecular 29, 32. פיתוח רקמה צלקתית עלולות לחסום את יצוא הומור מימי אשר מגביר את הלחץ בלשכה הקדמית. עם יצוא ולחץ ירד להצטבר, העדשה מושעה על ידי רצועות אלסטי דוחפת חזרה לתוך תא זגוגי. הומור זגוגי אז המפעיל לחץ על הרשתית נזק נוירונים ברשתית שברירי. התוצאות שלנו באמצעות הליך זה להראות כי מספרי תא גנגליון ברשתית מתחילים להתדלדל ב ...

גלאוקומה היא קבוצה של מחלות עיניים המשפיעות נוירונים ברשתית, במיוחד, התאים הגנגליון ברשתית 1-2. אקסונים של תאים אלה להתכנס על מנת להפוך את עצב הראייה נושא מידע חזותי אל המוח, שם לחזון נתפס. פגיעת RGCs ו האקסונים שלהם ולכן גורם פגמים חזותיים. מאפייניו העיקריים הקשורים להפרעות גלאוקומה הם RGC ניוון ומוות, לחץ תוך עיני מוגבר (IOP), וכוסות רוח דיסק אופטי וניוון. תכונות אלה להוביל לאובדן שדה ראייה או מלא, לעיוורון בלתי הפיך. נכון לעכשיו, גלאוקומה גרמה עיוורון ב -70 מיליון אנשים ברחבי העולם 3. ככזה, הוא הוא הגורם השלישי בגודלה בעולם של עיוורון 4. המנגנון המדויק של מות RGC בגלאוקומה נותר עלום. מחקר רב נעשה כדי לפתוח את התעלומה. זה ידוע, עם זאת, כי גורם הסיכון העיקרי של גלאוקומה היא תגדילn לחץ תוך עיני עקב זרימה סדירה הומור מימי (AH) בחדר הקדמי של העין. AH פועל כתחליף שקוף וחסר צבע לדם בתא avascular הקדמי של העין. היא מזינה את התאים הסובבים אותו, מסיר פסולת המופרשים תהליכים מטבוליים, משלוחים נוירוטרנסמיטורים, ומתירה את זרימת סמי תאים דלקתיים בתוך העין במהלך מצבי פתולוגיים 1. התחזוקה של זרימת הומור מימית כרוכה הגוף ריסי ואת meshwork trabecular. הומור מימי מיוצר על ידי הגוף ריסי. לאחר מכן הוא זורם לתוך החדר הקדמי כדי לשמור על הבריאות הכללית של רקמות העין. 75 - 80% יצוא הומור מימי מופרשים באופן פעיל באמצעות אפיתל ריסי הלא פיגמנט כאשר הנוזל מסונן דרך שלוש שכבות של מרקם ספוגי בשריר הריסים. יציאות הנוזל דרך meshwork trabecular ודרך התעלה של Schlemm אשר ולרומםies לתוך מערכת הדם 5 .the הנותרים 20 - 25% של יצוא עוקף את meshwork trabecular ומופרש באופן פסיבי על ידי אולטרה סינון ודיפוזיה דרך מסלול uveo-scleral. מסלול זה מופיע להיות עצמאי יחסי של לחץ תוך עיני 1. כאשר ייצור הומור מימי ו יצוא נמצא מחוץ איזון, לחץ בונה בתוך העין. כאמור, זו עלייה בלחץ התוך עיני הוא גורם הסיכון העיקרי להתפתחות גלאוקומה. לחץ כזו גורמת נזק שכבות סבוכה של נוירונים ברשתית בחלק האחורי של העין. פגיעת אקסונים תא גנגליון ברשתית של עצב הראייה גורמת למוח כבר לא מקבל מידע חזותי מדויק. כתוצאה מכך, תפיסת החזון אבדה עיוורון מוחלט יכול להתרחש. נכון להיום, אין תרופה לגלאוקומה. שיטות טיפול שונות קיימות בעיקר שמטרתם להפחית לחץ תוך עיניים. אלה כוללים אקטואלייםכיתות תרופות כגון חוסמי הקולטן-אדרנרגיים beta1, או אנלוגים פרוסטגלנדין אקטואליים. חוסמי ביתא להפחית את הלחץ התוך עיני על ידי הפחתת הייצור של הומור מימית 7. פרוסטגלנדינים לתפקד להפחית IOP ידי הגדלת היצוא של הומור מימי 8-14. אגוניסטים אלפא אדרנרגיים ומעכבי anhydrase פחמתית משמשים גם כאמצעי משני של הטיפול. אגוניסטים אדרנרגיים אלפא להגדיל יצוא דרך מסלול uveoscleral 15-17. מעכבי anhydrase פחמן להפחית את ייצור AH ידי עיכוב אנזימטי 18. הרבה יותר פרוצדורות פולשניות גם נמצאות בשימוש לטיפול בגלאוקומה. Trabeculoplasty לייזר משמש כדי להגדיל את תזרים הומור מימית 19. עוד טיפול כירורגים, שנקרא trabeculectomy, יוצר אתר ניקוז אלטרנטיבה לסנן AH כאשר מסלול trabecular המסורתי חסום 20-21. אפשרויות טיפול אלה היו ידועים EFFectively להפחית IOP. עם זאת, עד 40% של מחלת גלאוקומה להראות לרמות נורמליות IOP מה שמעידים על צורך בשיטות טיפוליות שלמות יותר. 22,23 בנוסף, מוות של תאי הגנגליון ברשתית לראות גלאוקומה הוא בלתי הפיך פעם זה מתחיל וטיפולים נוכחיים לא לעצור את התקדמות המחלה 24-28. זה הדגיש את הצורך טיפולים נוירו יעילים הממקדים ההישרדות של הנוירונים עצמם. פיתוח דגמי גלאוקומה הוא קריטי להתפתחות זו. במחקר זה אנחנו מפגינים שיטה של גרימת תופעות כמו-גלאוקומת חולדות מבוגרות לונג אוונס באמצעות הליך שונה המפורטים במקור על ידי מוריסון 29. בהליך זה, זריקות של 2 M מלוחים היפרטוני לתוך מקלעת ורידית episcleral גורם תנאים כמו-גלאוקומה על ידי הצטלקות רקמת להפחית יצוא הומור מימית של meshwork trabecular מה שמוביל לעלייה בלחץ התוך עיני ואת אובדן משמעותי של RGCs within חודש של ההליך 30-31. גלאוקומה וישכנע נהלים, כגון זה המתואר כאן, עשויים להיות המפתח לפיצוח פיתוחים חדשים טיפולי גלאוקומה.

<table><tbody><tr><td>קסילזין הידרוכלוריד, מינימום 99%</td> <td>סיגמא,</td> הזרקת קטמין הידרוכלוריד <td>X1251-1G</td><td></td>של מדעי החיים</tr><tr><td>, USP, 100 מ"ג/מ"ל&nbsp;</td><td>Putney, Inc</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>בקבוק 10 מ"ל</td></tr><tr><td>Acepromazine Maleate, 10 מ"ג/מ"ל</td><td>Phoenix Pharmaceutical, Inc</td><td>NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408</td> בקבוק סרום <td>50 מ"ל</td></tr>, <tr><td>10 מ"ל</td><td>VWR</td><td>16171319</td><td>זכוכית בורוסיליקט</td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק אינסולין&nbsp;</td><td>מחט VWR</td><td></td><td>BD329410 28 גרם&nbsp;</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>S7653</td><td>פתרון 2 מ'&nbsp;</td></tr><tr><td>חולץ מיקרואלקטרודות&nbsp;</td><td>Narishige Group</td><td>PP-830</td><td></td></tr><tr><td>צינורות בורוסיליקט סטנדרטיים מלוטשים כבדים וקירות דקים&nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-86-10HP</td><td>ללא נימה, מחט מזרק מיקרופיל 0.86 מ"מ</td></tr><tr><td>למילוי מיקרופיפטות</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>MF28G</td><td></td></tr><tr><td>18 מד מחט Luer-Lock</td> מחט <td>מזרק</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>1130421</td></tr> צינורות <tr><td>פוליאתילן גמישים</td><td>Fisher Scientific</td><td>22046941</td><td>קוטר 0.034 אינץ', כ-10 אינץ'&nbsp;</td></tr><tr><td>Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%</td> <td>Akorn, Inc</td><td>NDC 17478-263-12</td><td>15 מ"ל&nbsp; בקבוק סטרילי&nbsp;</td></tr><tr><td>מספריים מעוקלים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Leica&nbsp;</td><td>StereoZoom 4</td><td></td></tr><tr><td>מהדק המוסטט&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>1310912</td> משחה אנטיביוטית <td>משולשת עם קצה מעוגל</td></tr><tr><td>&nbsp;</td>ידית אזמל <td>NC0664481</td><td></td> <td>פישר סיינטיפיק</td></tr><tr><td></td><td>כלים מדעיים משובחים&nbsp;</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>להב אזמל #11</td><td>כלים מדעיים עדינים &nbsp;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>60 מ"מ x 15 מ"מ צלחת פטרי חד פעמית</td><td>VWR</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח 10x תרכיז</td><td>סיגמא, מדעי החיים&nbsp;</td><td>P7059-1L</td><td>דילול 1x&nbsp;</td></tr><tr><td>מספריים קפיצים</td><td>כלי מדע עדין&nbsp;</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים (2), Dumont # 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>3 מ"ל צנרת העברה, פוליאתילן, BD</td><td>Biosciences</td> לא סטרילי <td>357524 או 52947-948 1 ו-2</td><td>מ"ל סימונים</td></tr><tr><td>35 מ"מ x 10 מ"מ צלחת פטרי אחיזה קלה&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td></td></tr><tr><td>מחטי</td><td></td><td></td><td></td>קקטוס</tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td>PX0055-3 או 818715.0100</td><td>מיוצר לפתרון של 4%&nbsp;</td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>T9284-100 מ"ל</td><td>מיוצר לתמיסה של 1% ו-0.1%&nbsp;</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי&nbsp;</td><td>אטלנטה ביולוגי</td><td>S11150</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>עכבר מטוהר נגד חולדות CD90/עכבר CD90.1</td><td>BD Pharmingen</td><td>Cat 554892</td><td>דילול 1:300&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 נגד עכברים&nbsp;</td><td>טכנולוגיות חיים&nbsp;</td><td>A11005</td><td>דילול 1:300&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שקופיות</td><td>קורנינג&nbsp;</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול&nbsp;</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>G5516-100 מ"ל&nbsp;</td><td>50% גליצרול עד 50% PBS, לפי משקל&nbsp;</td></tr><tr><td>כיסוי&nbsp;</td><td>קורנינג&nbsp;</td><td>2975-225</td><td>עובי 1 22 x 50 מ"מ&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>ניקון&nbsp;</td><td>C2 ליקוי חמה Ti</td><td></td></tr></tbody></table>

גלאוקומה וישכנע נוהל בבית<em&gt; in vivo</em&gt; מודל עכברוש ואת כל הר רשתית הכנה

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

גלאוקומה היא מחלה של מערכת העצבים המרכזית הפוגעת בתאי הגנגליון ברשתית (RGCs). אקסונים RGC המרכיבים את עצב הראייה לשאת קלט חזותי למוח עבור תפיסה חזותית. פגיעת RGCs ו האקסונים שלהם מובילה לאובדן ראייה ו / או עיוורון. למרות הגורם הספציפי של גלאוקומה אינו ידוע, גורם הסיכון העיקרי למחלה הוא לחץ תוך עיני מוגבר. גלאוקומה וישכנע נהלים במודלים של בעלי חיים הם כלים רבי ערך לחוקרים לחקור את מנגנון מות RGC. מידע כזה יכול להוביל לפיתוח טיפולים נוירו יעילים שיכולים לסייע במניעת אובדן ראייה. פרוטוקול במאמר זה מתאר שיטה של גרימת גלאוקומה - כמו תנאים במודל חולדה vivo ב שם 50 μl של 2 מלוחים היפרטוני M מוזרק לתוך מקלעת ורידית episcleral. לבנה של הכלי מציינת זריקה מוצלחת. הליך זה גורם לאובדן של RGCs לדמות גלאוקומה. החודש הבאזריקה, חיות מוקרבות ועיניים יוסרו. לאחר מכן, הקרנית, העדשה, זגוגי מוסרים לעשות עיינית. הרשתית היא מקולפת ואז מהחלק האחורי של העין והצמידה על מנות Sylgard באמצעות מחטי קקטוס. בשלב זה, נוירונים ברשתית יכול להיות מוכתם לניתוח. תוצאות מהמעבדה זה מראים כי כ -25% RGCs הולכים לאיבוד בתוך חודש אחד של ההליך כאשר בהשוואה לקבוצת הביקורת הפנימית. הליך זה מאפשר ניתוח כמותי של מוות תאי הגנגליון ברשתית במודל גלאוקומה עכברוש in vivo.

סעיף זה ממחיש את מרכיבי מנגנון הליך המשמשים כדי לעודד תנאים דמויי גלאוקומה במודל גלאוקומה in vivo חולדה. אנחנו מראים את הכלים הפרט וציוד המשמשים לבצע הזרקת סליין היפרטוני הגורמת לעלייה בלחץ התוך עיני. אנו מציגים את ההזרקה לתוך המקלעת ורידית episcleral עם האפקט הלבן המאפיין שלה ואת העכירות של הלשכה הקדמית שנוצרו כתוצאה מכך. כמו כן, אנו מתארים את התהליך של הסרת רשתית שטוחת הרכבת ניתוח הרכב אבד RGCs. לבסוף, אנו מראים את ההשפעות של ההזרקה על ה...

גלאוקומה מאופיינת בפגיעה בתאי גנגליון ברשתית. גרימת גלאוקומה במודלים של בעלי חיים יכולה לספק תובנה לגבי חקר מחלה זו. כאן, אנו מתארים הליך הגורם לאובדן RGCs במודל חולדה in vivo ומדגים את הכנת הרשתית השלמה לניתוח.

גלאוקומה וישכנע נוהל בבית<em&gt; In vivo</em&gt; מודל עכברוש ואת כל הר רשתית הכנה

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ליצור אובדן משמעותי של תאי גנגליון ברשתית של חולדה על ידי השראת תנאים דמויי גלאוקומה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי הגלאוקומה וההגנה העצבית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא גורמת לאובדן הדרגתי של תאי גנגליון ברשתית, באופן דומה לזה הנראה בגלאוקומה אצל בני אדם.כדי להתחיל בנוהל זה, משוך שתי מיקרו-מחטים מזכוכית בעלות קצה מחודד מתוך צינור בורוסיליקט סטנדרטי בעל דפנות דקות ומלוטש באמצעות שובך מיקרו-אלקטרודות. לאחר מכן, מלא את אחת המיקרו-מחטים במלח פיזיולוגי בריכוז 2 molar, באמצעות מזרק של 1 milliliter. הקש על האלקטרודה כדי להוציא בועות אוויר מהקצה.לאחר מכן, מלאו מזרק שני של 1 ml ב-2 M NaCl. חברו אותו למחט במידה 18, ולאחר מכן חברו את המחט לצינור פוליאתילן באורך 10 אינץ'. השתמשו בבוכנת המזרק כדי למלא את צינור הפוליאתילן בתמיסת מלח דרך המחט.כאשר both המיקרו-מחט והצינור מלאים בתמיסת סלין, חברו ביניהם בזהירות. הסירו אוויר מהחיבור על ידי הקשה להוצאת בועות האוויר. לאחר מכן, גרדו קלות את קצה המיקרו-מחט כנגד נייר סופג כדי ליצור לו שיפוע עדין.בדוק את התנגדות המחט המיקרוסקופית על ידי לחיצה עדינה על בוכנת המזרק עד שזרם דק של נוזל ייראה על נייר הספיגה. זרם הנוזל לא יעלה על 0.5 millimeters ברוחבו כדי להבטיח את שלמותה התקינה של קצה המחט. בהליך זה, לאחר הרדמת בעל החיים באמצעות תמיסת KAX, בדוק את הרפלקסים על ידי צביטה של רגליו או זנבו כדי לוודא שבעל החיים אינו בהכרה.לאחר מכן, גזרו את השפם בעזרת מספריים. בהמשך, הספיגו מקל צמרגב בתמיסת betadine ונגבו את האזור שסביב העין המחקרית. תחת המיקרוסקופ, השתמשו בפינצטת המסטט (hemostat) כדי לתפוס את העפעף התחתון, במטרה להבליט את העין, לחשוף את הווריד האפיסקלראלי (episcleral vein) ולהגביל את תנועת העין.בשלב הבא, דקרו בזהירות את הווריד האפיסקלראלי (episcleral vein) בעזרת המחט המיקרוסקופית, בזווית של בין 10 ל-20 מעלות לווריד. דקירה מוצלחת לווריד מזוהה כאשר נשףף דם נכנס לקצה המחט המיקרוסקופית. הזריקו לאט 50 µL של תמיסת מלח לווריד.הורידים הופכים לבן חיוור בעוד התמיס המלוח זורם במערכת כלי הדם, אך חלק מהאזורים עשויים לשמור על מראה אדום-דם. השלב הקריטי ביותר בהליך זה מתרחש במהלך ההזרקה של תמיסת המלח הדו-מולרית. חיוורון של כלי הדם הוא תנאי הכרחי להבטחת תוצאה מוצלחת.שמירה על מחט יציבה וזווית של 20 מעלות הן קריטיות להליך זה. לאחר מכן, בצע הזרקה שנייה אל הווריד כדי להבטיח פגיעה יסודית בשכבת תאי העצב של הרשתית. תוך דקות ספורות, ניתן יהיה להבחין במראה עכור ומובחן דרך קשתית העין, בעוד המלח זורם במערכת כלי הדם.כעת, השתמש בסקלפל כדי לחתוך את רקמת החיבור בחלל העין הסובב את גלגל העין, תוך הקפדה שלא לחתוך את גלגל העין עצמו. לאחר מכן, חתוך בזהירות את העצב האופטי ואת כל הרקמות שנותרו כדי להוציא את גלגל העין השלם באמצעות מספריים בעלי קצה מעוקל. העבר את גלגל העין שהוצא לכלי פטרי סטרילי המכיל PBS טרי.בשלב הבא, צרו גביע עינית מהגלגל העין על ידי ביצוע חתך קטן עם הסקאלפל, מיד מאחור לגבול שבין הקשתית ללובנה. המשיכו בחתך מסביב להיקף העין כדי להסיר את חציוני הקרנית מהגלגל העין. החזיקו את השכבה הפיגמנטית של הרשתית בעזרת פינצטה כדי לייצב את גביע העין, והשתמשו בזוג פינצטות נוסף כדי להפריד בעדינות את הרשתית השלמה והשלמה, בעלת גוון ורוד-בז', מהחלק האחורי של העין.לאחר מכן, גזרו או צבטו את האזור שבו עצב הראייה מחובר לרשתית. ודאו שאתם מסירים מהרשתית כל שארית של אפיתל פיגמנטי או רקמת סקלרה. לאחר מכן, העבירו בעדינות את הרשתית המבודדת לצלחית פטרי עם ציפוי Sylgard המכילה PBS טרי.לאחר ההנחה בצלחת ה-Sylgard, מקבעו את הרשתית במקומה בעזרת סיכות. שמרו על שכבת תאי העצב של הרשתית הפונה כלפי מעלה, ועל העצב האופטי הפונה כלפי מטה. לאחר מכן, חתכו את הרשתית לארבעה רבעים, כך שייווצרת צורה של תלתן בעל ארבעה עלים, הקורנת מראש העצב האופטי.לאחר מכן, מקבעו את רבעי הרשתית באמצעות מחטי קקטוס נוספות כדי להפוך את הרשתית לשטוחה ככל האפשר ללא מתיחה. לאחר מכן, קבעו את הרשתית המקובעת בצלוחית Sylgard עם שלושה מיליליטר של 4%paraformaldehyde למשך לילה בטמפרטורת החדר לפני ביצוע הליכי הצביעה הסטנדרטיים. להלן השוואה בין העין הבקרה שלא טופלה לבין העין הניסויית, חודש אחד לאחר קבלת הזרקת תמיסת מלח להשראת גלאוקומה.תאי הגנגליון ברשתית מסומנים באמצעות נוגדן נגד Thy 1.1. הפרוצדורה מובילה להפחתה במספר ה-RGCs, לדפסיקולציה (defasciculation) של האקסונים מאגד האקסונים הראשי, ולעיוות של העגוליות של ה-RGCs שנותרו. אלו הם האקסונים הדפסיקולטיביים האופייניים הנובעים מהזרקת סליין.כלי דם מוצג בתוך הרשתית, ואלו הם צרורות האקסונים. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך 30 דקות, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשתמש תמיד במיקרו-מחט חדשה, חדה ובעלת חוד נטוי (beveled).בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון אימונוציטוכימיה, Western Blots, היברידיזציה in situ, ריצוף mRNA או ניתוח התנהגותי, במטרה לענות על שאלות נוספות הקשורות לגלאוקומה, כגון השפעת אובדן תאי הגנגליון ברשתית על חדות הראייה של בעלי החיים. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הגלאוקומה לבחון אסטרטגיות להגנה עצבית בחולדות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשרות אובדן משמעותי של תאי גנגליון ברשתית בחולדה, באמצעות הזרקת תמיסת מלח היפרטונית לווריד האפיסקלרה.

glaucoma-inducing-procedure-an-vivo-rat-model-whole-mount-retina

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מקור: בוסקו, א., .  In vivo דינמיקה של הפעלת מיקרוגליה ברשתית במהלך ניוון עצבי: הדמיה אופטלמוסקופית קונפוקלית ומורפומטריית תאים בגלאוקומה של עכברים. J. Vis. Exp. (2015)} סרטון זה מדגים הדמיה in vivo של מיקרוגליה ברשתית במודל עכבר של גלאוקומה. עכבר טרנסגני עם מיקרוגליה ברשתית המבטאת חלבון פלואורסצנטי ממוקם מתחת לאופטלמוסקופ. תאורת אינפרא אדום משמשת לאיתור ראש עצב הראייה (ONH), ומישור המוקד נוצר באמצעות כלי דם ברשתית כציוני דרך. לאחר מכן משתמשים בהדמיה פלואורסצנטית כדי להמחיש את המיקרוגליה...

הדמיה in vivo של מיקרוגליה ברשתית במודל עכבר של גלאוקומה

הפרוטוקול המתואר כאן מיועד להערכה מבנית של תכשיר רשתית שלם. זה כולל תיאורים של דיסקציה של רקמות, הרכבה על תוספת ממברנה פוליטטרפלואורואתילן הידרופילית (PTFE), העמסת בולוס עם סמנים פלואורסצנטיים, והשוואה של קיבוע עם קרבודימיד ופרפורמלדהיד לניתוח אימונוהיסטוכימי של רכיבים תאיים וסינפטיים.

פרוטוקול אופטימלי עבור רשתית Wholemount הכנה להדמיה ואימונוהיסטוכימיה

פרוטוקולי אימונוהיסטוכימיה משמשים ללמוד את הלוקליזציה של חלבון מסוים ברשתית. טכניקות הדמיה סידן מועסקות ללמוד דינמיקת סידן בתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים שלהם.

שיטות הדמיה אימונוהיסטוכימיים וסידן בWholemount עכברוש הרשתית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לגרום ליתר לחץ דם עינית בעין murine שתוצאתו אובדן תאי הגנגליון ברשתית כפי שנצפה גלאוקומה. microbeads המגנטי מוזרק לתוך החדר הקדמי ומשך לזווית iridocorneal שימוש במגנט כדי לחסום את היצוא של הומור מימי.

לחסימה Microbead מגנטי דגם כדי לגרום Ocular Hypertension-Dependent גלאוקומה עכברים

הדו"ח הבא מתאר כיצד לשכפל את מודל המכרסמים של נוירופתיה אופטית איסכמית קדמית לא-עורקית (rNAION), תוך שימוש בפרמטרים המתאימים של צבע, עדשות מגע ולייזר. אנו גם חושפים את השלבים המתאימים להערכת נגע rNAION in vivo.

המודל המכרסם של Nonarteritic Anterior Ischemic Optic נוירופתיה (rNAION)

פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור חוקרים צורת בגירוי הכימית של wholemount חולדה הרשתיות במבחנה עם גלוטמט עצבי. בגירוי כימי הוא אלטרנטיבה מבטיחה בגירוי חשמלי המקובלת של הנוירונים ברשתית לטיפול עיוורון בלתי הפיך הנגרם על ידי מחלות ניווניות קולט אור.

מתודולוגיה Neuromodulation ביונים כימית של עכברוש הרשתיות עם ה עצבי גלוטמט במבחנה

נדגים שלוש טכניקות להכנת רקמות שונות להמחשת immunohistochemical של pericytes microvascular ברשתית עכברוש, קרי, הקפאה-סעיפים, שלם-טעינות בידוד היפוטוניק של רשת כלי הדם.

הקפאה-מקטעי רשתית, שלם-טעינות, וההכנות להערכת מבודד היפוטוניק להמחשת Immunohistochemical של Microvascular Pericytes

יתר לחץ דם כרוני עינית הנגרמת על-ידי החלת בתפר circumlimbal אצל חולדות ועכברים, שמוביל התדרדרות תפקודית ומבניים של תאי גנגליון עקבית עם גלאוקומה.

דגם של גלאוקומה המושרה על ידי תפרים Circumlimbal אצל חולדות ועכברים

רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן (OIR) יכולה לשמש למודל מחלות רשתית איסכמיות כגון רטינופתיה של פגות ורטינופתיה סוכרתית מתפשטת ולשמש כמודל למחקרים הוכחת הרעיון בהערכת תרופות אנטי אנגיוגניות למחלות ניאו-שריריות. OIR גורם neovascularization חזק לשחזור ברשתית שניתן לכמת.

מודל רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן למחלות רשתית איסכמיות במכרסמים

רטינופתיה סוכרתית היא אחד הגורמים המובילים לעיוורון. היסטולוגיה, בדיקת פירוק מחסום רשתית דם, ואנגיוגרפיה פלואורסצנטית הן טכניקות בעלות ערך להבנת הפתופיזיולוגיה של הרשתית, אשר יכול לשפר עוד יותר את ההקרנה היעילה של סמים נגד רטינופתיה סוכרתית.

הערכה פתופיפיזיולוגית של רשתית במודל חולדה

מטרת פרוטוקול זה היא לאפיין מודל חדשני של ניוון עצבי גלאוקומטי המבוסס על צריבה תרמית של 360° של מקלעת כלי הדם הלימבלית, הגורמת ליתר לחץ דם עיני תת-חריף.

צריבה במעגל מלא של מקלעת כלי הדם הלימבלית לגלאוקומה הנגרמת בניתוח במכרסמים

למדו לגרום לאובדן תאי גנגליון רטינליים בעכברוש באמצעות הזרקת מלח היפרטונית לווריד האפיסקלרלי. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני גלאוקומה ואסטרטגיות הגנה עצבית.

גלאוקומה וישכנע נוהל בבית

גלה סרטונים נוספים