Name: בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: למדו לבודד נויטרופילים מדם אנושי באמצעות הפרדת שכבת צפיפות ולחקור את תפקידם ברגישות תאי לימפומה לטיפול בסוכנים אנטי-סרטניים. שיטה זו מאפשרת בידוד מהיר של אוכלוסיות תאים חיסוניים טהורות ללא פגיעה בתפקודם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לסרטן (INCa-DGOS-4664).

1. בידוד נויטרופילים ושיתוף תרבות עם תאים leukemic ראשוניים הערה: פרוצדורות נערכו בכפוף לאישור של ועדת האתיקה ליון החולים עם כל החולים חתימת הסכמה מדעת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של תאים leukemic ראשוניים נויטרופילים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף צינורות דם היקפי על EDTA (1.8 מ&quot;ג EDTA למיליליטר דם) מן החולים שאובחנו עם לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כל 15 מ&quot;ל של דם אל צינור 50 מ&quot;ל סטרילי לדלל עם 15 מ&quot;ל RPMI (דילול 1: 1), אז בזהירות ולאט לאט להוסיף 15 מ&quot;ל של תמיסת שיפוע צפיפות לתחתית הצינור ללא ערבוב בשלבים. ודא כי פתרון שיפוע הצפיפות הוא ב RT לעריכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 300 במשך 35 דקות ב RT וללא בלמים. הדם צריך להפריד לארבעה שלבים ברורים כפי שמוצג באיור 1 א &#39;, מלמעלה למטה: טסיות ופלסמה, תאים mononuclear (wהייט טבעת), פתרון שיפוע צפיפות, גרנולוציטים ו אריתרוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את הטבעת לבן המייצג את התאים leukemic ראשוניים עם טפטפת פלסטיק פסטר והעברת צינור חדש 50 מ&quot;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את הצינור עם PBS (מכיל סידן ומגנזיום) עד 50 מ&quot;ל בסך הכל צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה עם 5 מ&quot;ל PBS ולאחר מכן להוסיף PBS עד 50 מ&quot;ל בסך הכל צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה עם המדיום RPMI שלם (RPMI 1640 בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS), 2 מ&quot;מ גלוטמין, 100 U / פניצילין מ&quot;ל ו 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין) לספירת באמצעות הדלפק כדאיות התא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את השלבים העליונים עוזב את השלב גרנולוציטים ו אריתרוציטים ולהוסיף PBS עד 25 מ&quot;ל ולאחר מכן להוסיף dextran 3% ב 0.9% NaClup 50 מיליליטר בסך הכל. מערבבים את צינורות 10 פעמים ולשמור אותם במשך 30 דקות ב RT ללא ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את שכבת נויטרופילים RBC-עניים העליוןd ולהכניס אותם לתוך צינור נקי סטרילי 50 מ&quot;ל ו צנטריפוגות צינורות ב 300 גרם במשך 10 דקות ב RT. Resuspend כל גלולה עם 5 מ&quot;ל PBS ולאחר מכן להוסיף למאגר תמוגה התא אדום עד 50 מ&quot;ל בסך הכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הצינורות בחושך במשך 15 דקות ב RT אז צנטריפוגות ב 500 גרם במשך 10 דקות ב RT. לשטוף את הכדורים עם PBS (להוסיף PBS עד 50 מיליליטר בסך הכל) ולאחר מכן צנטריפוגות ב 500 גרם במשך 10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדורים עם מדיום RPMI מלא ל לספור באמצעות דלפק כדאי תא. שמור 3 x 10 5 של כל סוג תא ב 50 μl PBS-FBS (4%) צינורות פלסטיק 5 מ&quot;ל כדי לקבוע את טוהר הבידוד שלהם באמצעות cytometry הזרימה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח ההופעות מורפולוגי של אוכלוסיות תאים המבודדות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשם כך, resuspend כל 3 x 10 4 נויטרופילים 3 x 10 4 תאים mononuclear ב 150 μl שלם בינוני RPMI. הרכיבו את שקופיות זכוכית, כרטיסי מסנן, ותאי מדגם בצנטריפוגה cytospin, להבטיח כי לאהוא צנטריפוגות מאוזן היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל סוג תא אל תא מדגם צנטריפוגות ציטומגלווירוס ב 750 XG במשך 10 דקות ב RT הסר את השקופיות, כרטיסי מסנן, ותאי מדגם מתוך צנטריפוגה. לפרק בזהירות, כדי לא לגרום נזק לתאים בשקופית. בטל כרטיסי מסנן ותא מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם התאים באמצעות ערכת מכתים Giemsa ולשמור את השקופיות עבור השעה 1 לייבוש. בדוק את התאים על ידי מיקרוסקופ עם הגדלה 100x. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הטוהר של תאים מבודדים על ידי FACS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התווית תאי leukemic ראשוני המבודדים עם נוגדני CD19 אנטי אנושיים מצומדות כדי APC (5 μl / 10 6 תאים). לייבל נויטרופילים מטוהרים עם תערובת של נוגדנים אנטי אנושי המפורטים בטבלה 1 (5 μl / 10 6 תאים). דגירת התאים בחושך במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם 500 μl PBS-FBS (4%) בצנטריפוגה צינורות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">Resuspend כל גלולה ב 200 μl PBS-FBS (4%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח על cytometer זרימה באמצעות התצורה האופטית הבאה: 488 ננומטר ליזר: FSC-A (488 ננומטר), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PerCP-Cy5.5 (695/40 BP ), PE (575/26 BP); 633 ננומטר לייזר: APC (660/20 BP), APC-Cy7 (780/60 BP). ודא פיצוי הצבע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coculture של תאים leukemic ראשוניים עם נויטרופילים עצמיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Seed 2 x 10 5 תאים / מ&quot;ל של תאים leukemic ראשוניים לבד או עם נויטרופילים עצמיים בשעה 1:10 יחס במדיום RPMI להשלים. לשם כך, להתאים מספרים סלולריים על ידי המתלים תא דילול ולהוסיף 2 x 10 5 תאים / מ&quot;ל של תאים leukemic ראשוניים עד 2 x 10 6 תאים / מ&quot;ל נויטרופילים. מערבבים בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 מיקרומטר של טירוזין קינאז של ברוטון (BTK) מעכב (ibrutinib) אל התאים. דגירה של 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תא ניתוח FACS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> collect התאים צינורות פלסטיק 5 מ&quot;ל לניתוח צנטריפוגות FACS צינורות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. לשטוף את כדורי עם 1 מ&quot;ל PBS-FBS (4%) ולאחר מכן צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדורי Resuspend ב Annexin V ו- PI באמצעות ערכה מסחרית ו דגירת התאים בחושך במשך 10 דקות ב RT. לנתח על cytometer זרימה באמצעות אסטרטגית gating של איור 2 א ו בתצורה האופטית הבאה: ליזר 488 ננומטר: FSC-A (488 ננומטר), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP). ודא פיצוי הצבע. </li></ol></li></ol> בידול 2. של תאים HL60 לאורך נתיב granulocytic ו Coculture שלהם עם תאים RL לימפומה B ב 3D דגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיפרנציאציה של פרומיילוציטית האדם (HL60) תאים לתוך תאים נויטרופילים דמוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם מספר הסלולרי HL60 עד 3 x 10 5 תאים / מ&quot;ל ולאחר מכן להוסיף 1 מיקרומטר החומצה הרטינואית (RA) ו -1.25% DMSO להשרות התמיינות שלהם. כל זרע 3 x 10 5 </sעד&gt; תאי HL60 לכל היטב צלחת 48 היטב ואז דגירה במשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאוחר יותר, לאסוף את התאים צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. Resuspend תאים עם מדיום RPMI מלא ל לספור באמצעות דלפק כדאי תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז לדלל ההשעיה תא בינוני RPMI מלאה, ומשנה את מספר הנייד HL60 עד 3 x 10 5 תאים / מ&quot;ל ולגרום שוב הבידול שלהם על ידי הוספת 1 ​​מיקרומטר החומצה הרטינואית (RA) ו -1.25% DMSO. כל זרע 3 x 10 5 HL60 תאים לכל היטב צלחת 48-היטב דגירה במשך 48 אחר שעה על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח של בידול HL60 (הבדל HL60) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוספים את התאים צנטריפוגות צינורות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. Resuspend גלול עם מדיום RPMI מלא ל לספור באמצעות דלפק כדאי תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את השינויים בביטוי סמנים על פני קרום התא על ידי cytometry הזרימה. מניחים כל 3 x 10 5 </sup&gt; תאים שלא עברו התמיינות HL60 (מ תרבית תאים) ו -3 x 10 5 HL60 תאים diff צינורות פלסטיק 5 מ&quot;ל לניתוח FACS ו צנטריפוגות צינורות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדורים ב 50 μl PBS-FBS (4%). לייבל את התאים עם אנטי אנושי CD11b מצומדות כדי AF700 או CD38 אנטי אנושי מצומדות כדי APC (5 μl / 10 6 תאים). דגירת התאים בחושך במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם 500 μl PBS-FBS (4%) ולאחר מכן צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. Resuspend את הכדורים ב 200 μl PBS-FBS (4%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח על cytometer זרימה באמצעות אסטרטגיה gating של איור 3A ואת התצורה האופטית הבאים: 488 ננומטר לייזר: FSC-A (488 ננומטר), SSC-A (488 / 10BP); לייזר ננומטר 633: APC (660/20 BP), Alexa פלואוריד 700 (730/45 BP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק את השינויים מורפולוגיים diff HL60, לשתק את התאים על גבי שקופיות זכוכית לבדיקה מיקרוסקופית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשם כך, resuspend כל 3 x 10 <sup&gt; 4 תאים שלא עברו התמיינות HL60 (מ תרבית תאים) ו -3 x 10 4 diff HL60 ב 150 μl שלם בינוני RPMI. הרכיבו את שקופיות זכוכית, כרטיסי מסנן, ותאי מדגם בצנטריפוגה cytospin, להבטיח כי צנטריפוגות מאוזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל סוג תא אל תא מדגם צנטריפוגות ציטומגלווירוס ב 1500 סל&quot;ד במשך 10 דקות ב RT. הסר את השקופיות, כרטיסי מסנן, ותאי מדגם מתוך צנטריפוגה. לפרק בזהירות, כדי לא לגרום נזק לתאים בשקופית. בטל כרטיסי מסנן ותא מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם התאים באמצעות ערכת מכתים Giemsa ולשמור את השקופיות עבור השעה 1 לייבוש. בדוק את התאים על ידי מיקרוסקופ עם הגדלה 100x. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3-ממדי (3D) תרבות הערה: ודא כי החומרים המשמשים בניסוי זה הם קרים הניסוי מתקיים על קרח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל 5 x 10 4 תאים RL, לבד או מעורבב עם הבדל HL60 </em&gt; ב יחס RL: diff HL60 1:10, עם 300 μl מטריצה ​​קרום המרתף באמצעות 1 מ&quot;ל קצה פיפטה לחתוך עם מספריים סטרילי כדי להרחיב את הפתח לכ 2 עד 3 מ&quot;מ. הימנע בועות במהלך שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל זרע 300 μl של השעית תא / גם בצלחת 24 גם. הימנע בועות במהלך שלב זה. דגירה את הצלחת למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 ולאחר מכן להוסיף 1 מ&quot;ל להשלים בינוני RPMI לכל היטב דגירה במשך 7 ימים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. שנה את בינונית כל יומיים. הוסף 10 ננומטר vincristine ביום 5. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח FACS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 7 ימים של תרבות, לשאוב את המדיום ולשטוף היטב עם כל 1 מ&quot;ל קר כקרח PBS פעמיים. הוסף 3 מ&quot;ל / היטב קר כקרח PBS-EDTA (5 מ&quot;מ). לנתק את ג&#39;ל מתחתית הבאר על ידי גירוד באמצעות בתחתית 200 קצה פיפטה μl. לנער את הצלחת בעדינות על קרח למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את ההשעיה התא לתוך צינור 15 מ&quot;ל סטרילי ולנער את צינורות בעדינות על icדואר למשך 30 דקות אחרות. בדקו את המראה של השעית תא הומוגנית. (אם זה לא המקרה, אז לנער את התאים במשך זמן ארוך יותר או להוסיף עוד PBS-EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה צינורות ב XG 300 במשך 10 דקות ב RT. לשטוף את הכדורים עם PBS אז צנטריפוגות ב XG 300 במשך 10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend עם PBS-FBS (4%) ו תווית עם נוגדנים CD19 אנטי אנושי מצומדות כדי PE-Cy7 ו נוגדן CD38 אנטי אנושי מצומדות כדי APC (5 μl / 10 6 תאים). דגירה בחושך במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם 500 μl PBS-FBS (4%) ולאחר מכן צינורות צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. Resuspend תאים עם Annexin V ו- PI באמצעות ערכה מסחרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח על cytometer זרימה באמצעות אסטרטגית gating של איור 4 א ו בתצורה האופטית הבאה: 488 ננומטר ליזר: FSC-A (488 ננומטר), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); 633 ננומטר לייזר: APC (660/20 BP). ודא פיצוי הצבע. </li></ol></li&gt; </ol>

<ol><li>Gocheva, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-4+induces+cathepsin+protease+activity+in+tumor-associated+macrophages+to+promote+cancer+growth+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion.</a> Genes Dev. 24, 241-255 (2010).</li>
<li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+Inflammation%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Immunity, Inflammation, and Cancer.</a> Cell. 140, 883-899 (2010).</li>
<li>Mitchem, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumor-infiltrating+macrophages+decreases+tumor-initiating+cells%2C+relieves+immunosuppression%2C+and+improves+chemotherapeutic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses.</a> Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).</li>
<li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+Complexity+Predicts+Breast+Cancer+Survival+and+Functionally+Regulates+Response+to+Chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy.</a> Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).</li>
<li>Di Carlo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intriguing+role+of+polymorphonuclear+neutrophils+in+antitumor+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions.</a> Blood. 97, 339-345 (2001).</li>
<li>Kumar, V., Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+Cinderella+of+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: Cinderella of innate immune system.</a> Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).</li>
<li>Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+the+activation+and+regulation+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).</li>
<li>Kelbaek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile+isolation+of+polymorphonuclear+leukocytes+from+large+blood+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Chem.+Clin.+Biochem.+Z.+F%C3%BCrKlin.+Chem.+Klin.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes.</a> J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. FürKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).</li>
<li>Aynaud, M. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Tribbles+3+protects+nuclear+DNA+from+cytidine+deamination+by+APOBEC3A%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A.</a> J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).</li>
<li>Ziòłkowska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+three-dimensional+cell+culture+and+anticancer+drug+activity+evaluation+in+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip.</a> Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).</li>
<li>Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+for+the+isolation+of+neutrophils+in+high+yield+without+the+use+of+dextran+or+density+gradient+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers.</a> J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).</li>
<li>Behnen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized+immune+complexes+induce+neutrophil+extracellular+trap+release+by+human+neutrophil+granulocytes+via+Fc%CE%B3RIIIB+and+Mac-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Baltim.Md+1950%22%5BJournal%5D)">Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via FcγRIIIB and Mac-1.</a> J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).</li>
<li>Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+are+not+less+sensitive+than+other+blood+leukocytes+to+the+genomic+effects+of+glucocorticoids%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids.</a> PloS One. 7, 44606(2012).</li>
<li>Dorward, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+advance%3A+autofluorescence-based+sorting%3A+rapid+and+nonperturbing+isolation+of+ultrapure+neutrophils+to+determine+cytokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production.</a> J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).</li>
<li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Purification+and+Labeling+of+Mouse+Bone+Marrow+Neutrophils+for+Functional+Studies+and+Adoptive+Transfer+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments.</a> J Vis Exp. , e50586(2013).</li>
<li>Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaplasmaphagocytophilum+reduces+neutrophil+apoptosis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo.</a> Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).</li>
<li>Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22ActaHaematol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis of neutrophils.</a> ActaHaematol. 111, 56-66 (2004).</li>
<li>Dalton, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HL-60+cell+line+was+derived+from+a+patient+with+FAB-M2+and+not+FAB-M3%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3.</a> Blood. 71, 242-247 (1988).</li>
<li>Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+normal+and+transformed+epithelial+cells%3A+Their+contributions+to+tumourigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).</li>
<li>Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+cultures%3A+current+trends+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond.</a> Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).</li>
<li>Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%2C+Neutrophils%2C+and+Cancer%3A+A+Double+Edged+Sword%5BTitle%5D)+AND+%22New+J.+Sci%22%5BJournal%5D)">Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword.</a> New J. Sci. , 271940(2014).</li>
<li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessories+to+the+crime%3A+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).</li>
<li>Shojaei, F., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractoriness+to+antivascular+endothelial+growth+factor+treatment%3A+role+of+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells.</a> Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).</li>
<li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+promote+the+malignant+glioma+phenotype+through+S100A4%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res+Off+J+Am+Assoc+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4.</a> Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).</li>
<li>Teramukai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+neutrophil+count+as+an+independent+prognostic+factor+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer%3A+an+analysis+of+Japan+Multinational+Trial+Organisation+LC00-03%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer+Oxf.Engl+1990%22%5BJournal%5D)">Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03.</a> Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).</li>
<li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IL-6-STAT3+axis+mediates+a+reciprocal+crosstalk+between+cancer-derived+mesenchymal+stem+cells+and+neutrophils+to+synergistically+prompt+gastric+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression.</a> Cell Death Dis. 5, 1295(2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

המתוארת כאן, פרוטוקול יעיל, פשוט, מהיר וזול עבור הבידוד של נויטרופילים מדם אנושי עם טוהר גבוה שימוש בגישת צנטריפוגה שיפוע צפיפות ובתוך אותם תאי mononuclear הצעד מופרדים גם וחלים. אוכלוסיות התאים הבודדות הן ≥90% טהורות. שיטות קיימות מספר לבידוד נויטרופילים מדם אנושי. אלה כוללים שיטות דומות באמצעות 11,12 הדרגתיים רציף, או באמצעות ערכות מסחריות לבידוד נויטרופילים ידי בחירה חיסונית מגנטית חיובית במהלכו נוי...

<html> תאים חיסוניים מולדים מהווים שיעור מהותי של תאים במיקרו-סביבה של הגידול קושרו עם ממאירות הגידול בחולים ומודלים של בעלי חיים של סרטן 1. לאחרונה, זה הפך להיות יותר מוערך נרחב שתגובות חיסוניות כרוניות תפקיד קריטי בקידום התקדמות גידול, גרורות והתנגדות לכימותרפיה 2. המקרופאגים חשובים תאים חיסוניים מולדים אשר הוכחו להסדיר ישירות בתגובה תאים סרטניים לכימותרפיה 3,4. עם זאת, את התפקיד של נויטרופילים, שחקני מפתח במערכת החיסון המולדת, בוויסות תגובת הגידול לטיפול נגד סרטן אינו ידוע. מטרות הפרוטוקולים הללו הן להשתמש בשיטה מהירה ואמינה להפריד נויטרופילים מדגימים הדם של מטופל CLL וכדי להבדיל תאי HL60 לאורך מסלול granulocytic כדי ללמוד את תפקידם בויסות הרגישות של תאי לימפומה לסוכנים נגד לימפומה. = &quot;jove_content&quot;&gt; נויטרופילים הם מרכיב הסלולר הנפוץ ביותר של מערכת החיסון המולדת בדם 5 ולפעול כקו ההגנה הראשון נגד פולשים מיקרואורגניזמים 6. יש נויטרופילים תפקיד חיוני עולה תגובות חיסון מולדות יעילות בנוסף לפונקציות מפעיל משתנות במצבים פתולוגיים מספר 7. לכן, שיטה מהירה ואמינה כדי לבודד נויטרופילים מתאי דם אחרים, כגון שיטת הפרדת שיפוע צפיפות, נדרשה לבדיקות במבחנה. באמצעות שיטה זו לבידוד נויטרופילים יקל על המשך מחקר פונקציות חיסוניות בתיווך נויטרופילים in vivo לשעבר vivo. היכולת להשיג אוכלוסיות טהורות של נויטרופילים היא צעד ראשון חשוב לחקירת חולים עם מחלות אימונולוגיות 8. שיטת צפיפות הפרדת שיפוע היא טכניקה אידיאלית שבו תשואה גבוהה של תאים מתקבלת. methoד יהיה כרוך בתוספת פתרון שיפוע צפיפות בתחתית צינור המכיל דם אדם מדולל ואחריו צנטריפוגה ב 300 גרם במשך 35 דקות ללא הפסקה. הטבעת של תאי mononuclear מופיעה על הממשק ואת נויטרופילים מתגוררים מתחת לשעבר. יש שיטה זו יתרונות משמעותיים ביחס משיטות אחרות כגון ערכות בידוד נויטרופילים שהן הרבה יותר 9 יקרים. בנוסף, בידוד נויטרופילים מדם אנושי על ידי ערכות מסחריות באמצעות נוגדנים המכוונים סמן משטח ספציפי עבור נויטרופילים אדם, להגביר את הסיכון של הפעלה או התמיינות תאים. שיטת ההפרדה צפיפות שיפוע מאפשר בידוד של נויטרופילים בתוך פרק זמן קצר. בתוך אותו שלב, תאים mononuclear גם מופרדים והחלים. זוהי טכניקה בסיסית שבה תשואה גבוהה של תאים טהורים מתקבלת על מנת להשיג שלמות תפקודית. על מנת לחקות את הגידול microenvironment, ניסויי 3D בוצעו. בהינתן זמן מחצית החיים הקצר של נויטרופילים במבחנה, ניסויי 3D עם נויטרופילים אדם טריים אינם חד משמעיים. מסיבה זו, פרומיילוציטית (HL60) תאים מושרים להתמיין לתאי נויטרופילים דמוי באמצעות מעוררי הבידול sulfoxide דימתיל (DMSO) ו חומצה רטינואית (RA). שימוש בתאי HL60 בדיל (הבדל HL60) ימנע שיש תגובות שונות של נויטרופילים בשל בידוד מתורמים שונים. ב 3D במבחנה מודלים תרבות מייצגים שלב ביניים בין מודלים 2D במבחנה במודלים vivo. בתרבות 2D, התאים להתפשט על פני פלסטיק ויוצרים מצורפים התא טבעי לחלבונים שהופקדו כי הם מפוגל על ​​משטח סינתטי זה. לעומת זאת, התאים מצורפים תאים תאים טבעי טופס תרבות 3D מאז התאים ואת תאי מטריקס הם לסנתז הם חומר טבעי אשר הם מחוברים.מסיבה זו, מודלי שיתוף תרבות 3D, במיוחד בין תאים סרטניים סוגי תאים אחרים, היו מאוד שימושיים המציין תרומתם צמיחת גידול, אנגיוגנזה, וגרורות. כתוצאה מכך, תרבויות 3D להפוך את תרבית תאים לחקות את התנאים הפיזיולוגיים הקיימים vivo 10.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640&nbsp;</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS מכיל סידן ומגנזיום)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>14040-091</td><td></td></tr><tr><td>N-אצטיל-L-אלניל-L-גלוטמין (L-גלוטמין)</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין סטרפטומיצין (Pen Strep)</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>מעכב טירוזין קינאז (Btk) של ברוטון (איברוטיניב)&nbsp;</td><td>CliniSciences</td><td>A3001</td><td></td></tr><tr><td>Vincristine&nbsp;</td><td>EG labo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD מטריג'ל מטריצת ממברנת בסיס&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>לשים ב-4 oC למשך הלילה (O/N) לפני יום הניסוי</td></tr><tr><td>מאגר ליזה של תאים אדומים&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>פיקול (פנקול)</td><td>PAN ביוטק</td><td>P04-60500</td><td></td></tr><tr><td>דקסטרן&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>חומצה רטינואית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>אתילנדיאמינטטראצטית חומצה (EDTA)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>Euromedex</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>סיפוח ערכת צביעה V-FLOUS&nbsp;</td><td>רוש</td><td>11&nbsp; 988&nbsp; 549&nbsp; 001</td><td></td></tr><tr><td>ערכת RAL 555 ערכת צביעה שונה Giemsa</td><td>Cosmos Biomedical</td><td>CB361550-0000</td><td></td></tr><tr><td>LSRII זרימה ציטומטריה</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ציטוצנטריפוגה</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMR-XA מיקרוסקופ</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלומטר אוטומטי T4 מונה כדאיות תאים</td><td>Nexcelom&nbsp; מדע ביולוגי</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

נויטרופילים הם הסוג הנפוץ ביותר (40% עד 75%) של תאי דם לבנים ובין התאים הדלקתיים הראשונים שנודדים לעבר אתר הדלקת. הם שחקני מפתח במערכת החיסון המולדת וממלאים תפקידים מרכזיים בביולוגיה של הסרטן. נויטרופילים הוצעו כמתווכים מרכזיים של טרנספורמציה ממאירה, התקדמות הגידול, אנגיוגנזה ובאפנון החסינות האנטי-גידולית; באמצעות שחרורם של גורמים מסיסים או האינטראקציה שלהם עם תאי הגידול. כדי לאפיין את הפונקציות הספציפיות של נויטרופילים, נחשקת שיטה מהירה ואמינה לבידוד חוץ גופי של נויטרופילים מדם אנושי. כאן, מודגמת שיטת הפרדת שיפוע צפיפות לבידוד נויטרופילים כמו גם תאים חד-גרעיניים מהדם. ההליך מורכב משכבות של תמיסת שיפוע הצפיפות כגון פיקול בזהירות מעל הדם המדולל המתקבל מחולים שאובחנו עם לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL), ואחריו צנטריפוגה, בידוד שכבה חד-גרעינית, הפרדת נויטרופילים מ-RBCsby דקסטרן ואז ליזה של אריתרוציטים שיוריים. שיטה זו הוכחה כמבודדת נויטרופילים ≥-90% טהורים. כדי לחקות את המיקרו-סביבה של הגידול, בוצעו ניסויים תלת מימדיים (תלת מימדיים) באמצעות מטריצת ממברנת הבסיס כגון Matrigel. בהתחשב במחצית החיים הקצרה של נויטרופילים במבחנה, לא ניתן לבצע ניסויים תלת-ממדיים עם נויטרופילים אנושיים טריים. מסיבה זו תאי HL60 פרומילוציטיים מובחנים לאורך המסלול הגרנולוציטי באמצעות משפרי ההתמיינות דימתיל סולפוקסיד (DMSO) וחומצה רטינואית (RA). מטרת הניסויים שלנו היא לחקור את תפקידם של נויטרופילים על הרגישות של תאי לימפומה לחומרים אנטי-לימפומה. עם זאת, ניתן להכליל שיטות אלה כדי לחקור את האינטראקציות של נויטרופילים או תאים דמויי נויטרופילים עם מגוון גדול של סוגי תאים במצבים שונים.

שיטת צפיפות ההפרדה שיפוע המתואר כאן מספק תאים leukemic ראשוניים נויטרופילים unstimulated מבודדים מהדם של חולי CLL איור 1A מייצג את שכבות הדם השונות שהתקבלו לאחר צנטריפוגה שיפוע צפיפות (מלמעלה למטה:. טסיות ופלסמה, טבעת לבן מייצג את התאים mononuclear, צפיפות שיפוע פתרון, גרנולוציטים ו אריתרוציטים). איור 1B ו 1C להראות את הבדלי ההופעות מורפולוגיים בין נויטרופילים (תאי גרעינים רבים-אונות) ותאי mononuclear בהתאמה. <...

נויטרופילים הם הסוג הנפוץ ביותר של תאי דם לבנים. בידוד הנויטרופילים מדם אנושי בשיטת הפרדת שיפוע צפיפות והתמיינות של תאים פרומילוציטיים אנושיים (HL60) לאורך המסלול הגרנולוציטי מתוארים כאן; לבחון את תפקידם ברגישות של תאי לימפומה לחומרים אנטי-לימפומה.

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

המטרה הכללית של נהלים אלו היא לבודד במהירות נויטרופילים בדרגת טיהור גבוהה מדגימי דם אנושיים באמצעות סרקיגציה במעבר מדרג צפיפות, וזאת כדי לחקור את תפקידם ברגישות של תאי לימפומה לטיפול בסרטן תוך שימוש במודלים של תרביות תאים דו-ממדיות (2D) ותלת-ממדיות (3D). שיטות אלו עשויות לסייע במתן מענה לשאלות מפתח הנוגעות לאינטראקציות בין מערכת החיסון המולדת לסרטן, כגון התפקיד שתגגח תגובות של תאי גידול המתווכות על ידי נויטרופילים בטיפול בסרטן. היתרון המרכזי של הפרדה במעבר מדרג צפיפות הוא היכולת לבודד אוכלוסיות טהורות של תאי חיסון בפרק זמן קצר, מבלי לחשוף את התאים לגירויים המשנים את תפקודיהם.כדי לבודד את תאי הלוקמיה הראשוניים ואת הנויטרופילים, התחילו בהוספת 15 milliliters של דם מטופל ב-EDTA מדגימות של מטופלים עם לוקמיה לימפוציטית כרונית אל תוך מבחנות סטריליות בנפח 50 milliliter.לאחר הפרדת התאים על ידי סרכוז, יהיו גלויות ארבעה שלבים נפרדים. הפלטלטים והפלזמה בחלק העליון, טבעת לבנה של תאים חד-גרעיניים, תמיסת מדרג הצפיפות, והגרנולוציטים והאריתרוציטים בחלק התחתון. באמצעות פיפט פלסטיק מסוג פסטור, העבירו תחילה את הטבעת הלבנה של תאי לוקמיה ראשוניים למבחנה חדשה של 50 milliliter.יש לשטוף את התאים בעד 50 milliliters של PBS עם סידן ומגנזיום. לאחר מכן, יש לתלה את המשקע בחמישה milliliters של PBS טרי. לאחר מכן, יש להוסיף 45 milliliters נוספים של PBS לתאים, ולסובב את התאים שוב לצנטריפוגה.לאחר השטיפה השנייה, השהה מחדש את החנק כך שיהיה תלוי בתווך RPMI מלא. ספור את מספר התאים הלוקמיים הראשוניים החיוניים. לאחר מכן, הסר את פלזמת הפלטלטים ואת שכבות מדרג הצפיפות, והוסף 25 milliliter של PBS ו-25 milliliters של Dextrin בנתרן כלוריד לשלב הגרנולוציטים והכריתיציטים.ערבבו את המבחנות עשר פעמים על ידי הפיכה. לאחר מכן, הניחו לתאים לשקוע למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בסיום השיווי, העבירו את השכבה העליונה של הנויטרופילים, הדלה בתאי דם אדומים, למבחנה סטרילית של 50 milliliters וסובבו את התאים לספינטדאון.שסחקו מחדש את הפלטה ב-5 milliliters של PBS והמיסו את תאי הדם האדומים בעזרת 45 milliliters של תמיסת ליזיס לתאי דם אדומים. לאחר 15 דקות בחושך בטמפרטורת החדר, צנטריפגו שוב את התאים ושטפו את הפלטה ב-50 milliliters של PBS. בסיום השטיפה, שסחקו מחדש את התאים במצע RPMI מלא וספרו את מספר הנויטרופילים החיים.דללו את שתי קבוצות התאים לריכוז של 300,000 תאים ל-50 µL של RPMI וחלקו את הדגימות למספר המתאים של מבחנות fax בנפח של 5 mL. לאחר צנטריפוגציה, השעיקו מחדש את המשקעים ב-50 µL של PBS בתוספת FBS. כדי לקבוע את רמת הטוהר של תתי-אוכלוסיות התאים המבודדות, סמנו את המנה של תאי הלוקמיה הראשוניים עם נוגדן anti-human CD19 המשורשר ל-APC, ואת המנה של הנויטרופילים המטוהרים עם תערובת של נוגדנים anti-human כפי שפורט בטבלה, למשך 30 דקות בחושך בטמפרטורה של 4 °C.בסוף הדגירה, שטפו את התאים ב-500 microliters של PBS מועשר ב-FBS והשעיקו מחדש את המשקעים ב-200 microliters של FBS PBS טרי. לאחר מכן, נתחו את טוהר אוכלוסיות התאים באמצעות ציטומטריה של זרימה, תוך הקפדה על פיצוי צבעים (color compensation) של הדגימות. לצורך תרבית משותפת (co-culture) של תאי הלוקמיה הראשוניים עם נויטרופילים אוטולוגיים, זרעו 200,000 תאים למיליליטר של תאי לוקמיה לבד או עם נויטרופילים אוטולוגיים בלוח 24 בארות במדיום RPMI מלא.ערבבו את התאים בזהירות. לאחר מכן, טפלו בתאים באמצעות Brutton's Tyrosine Kinase Inhibitor למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2. למחרת, אספו אליקוט של התאים לשפופרת פלסטיק של 5 mL.לאחר מכן, סובב את התאים במערבל צנטריפוגי ושטוף את המשקעים במיליליטר אחד של FBS PBS. לאחר הצנטריפוגה השנייה, סמן את התאים ב-annexin five וב-propidium iodide לפי הוראות היצרן במשך עשר דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן, נתח את הנויטרופילים ואת תאי הלוקמיה הראשוניים באמצעות ציטומטריית זרימה (flow cytometry), בהתאם לאסטרטגיית ה-gating המוצגת.כדי להקים תרבית משותפת תלת-ממדית, הוסיפו 50,000 תאי RL lymphoma b לבד או ערבבו אותם עם תאי HL60 מובחנים במבחנות סטריליות של 15 מיליליטר. סבבו את הדגימות בצנטריפוגה ותלו את המשקעים ב-300 מיקרוליטר של basement membrane matrix, תוך שימוש בטיפ פיפט של מילימטר אחד שפתח נחתך לשניים עד שלושה מילימטרים. לאחר מכן, דגרו 300 מיקרוליטר של התאים בכל באער של פלטה בעלת 24 באערים למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזי CO2.בסיום הדגירה, הוסיפו מיליליטר אחד של מצע RPMI מלא לכל באר והחזירו את התרביות התלת-ממדיות למדגירה למשך שבעה ימים נוספים, עם החלפת מצע מדי יומיים. ביום החמישי, הוסיפו 10 nM של incristine לתרביות. לאחר שבוע של תרבית, שאבו את המצע ושטפו כל באר פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS קר בקרח.לאחר מכן, הוסיפו שלושה milliliters של PBS עם EDTA קר במיוחד לכל באר וגרדו את תחתית הבארות באמצעות טיפ של פיפט של 200 microliter כדי לנתק את הג'לים. נערה את הפלטה בעדינות על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן, העבירו את תרחיפי התאים למבחנות סטריליות נפרדות של 15 milliliter לניעור עדין על קרח למשך 30 דקות נוספות.וודאו שהתגבשה תרחיף תאים הומוגני. לאחר מכן, סבבו את התאים בצנטריפוגה, בצעו שטיפה ב-PBS והשביו את המשקעים בתרחיף של PBS טרי עם FBS. לבסוף, סמנו את התאים עם הנוגדנים וצבעי הבדיקה לחיוניות המתאימים כפי שהודגם זה עתה, ובצעו אנליזה של תאי RL ותאי HL60 מובחנים באמצעות ציטומטריית זרימה, תוך שימוש באסטרטגיית ה-gating שהומחשו.ניתוח של כל האירועים באוכלוסיות התאים המבודדות באמצעות ציטומטריה של זרימה מדגים כי שיטת הפרדה זו מביאה לאוכלוסיית תאי לוקמיה ראשוניים המבטאים CD19, המהווה שיא בודד בעל טוהר גבוה. כמו כן, מתקבלת אוכלוסיית נויטרופילים בטוהר של למעלה מ-90 אחוזים, החיוביים לאנטיגנים הש wspנים של לוקוציטים CD45, ולאנטיגנים CD15 ו-CD16 המובעים על ידי נויטרופילים בשלים. ביצוע Gaiting לתאי הלוקמיה הראשוניים מתרביות של נויטרופילים במקביל מדגים כי הנויטרופילים מפעילים אפקט מגן על הישרדות התאים כנגד מעכב הטירוזין ibrutinib, עם מספר גבוה משמעותית של תאי לוקמיה ראשוניים חיוניים בהשוואה לתרבית של תאי לוקמיה ראשוניים לבדם.תאי HL60 מובחנים יציבים יותר בתרביות תלת-ממדיות מאשר נויטרופילים. לאחר השראת התפתחותם הגרנולוציטית, תאים אלו קטנים יותר מתאי HL60 בלתי מובחנים ומבטאים רמות גבוהות יותר של CD11B ו-CD38. תאי HL60 מובחנים מראים גם גרעינים רב-סגמנטיים.תאים אלו מפגינים אפקט מגן על תאי ה-RL, עם מספר גבוה משמעותית של תאי RL חיוניים בתרביות co-culture תלת-ממדיות לאחר טיפול ב-vincrostin בהשוואה לתאי לימפומה שטופלו ב-vincrostin וגודלו לבדם. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים את שיטת הסרכזגגיה במדרג צפיפות תוך 90 דקות. לאחר פיתוחן, סללו טכניקות אלו את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה של הסרטן לבחון את השפעתם של תאי דם לבנים שונים על ממאירות הגידול במודלים פרה-קליניים ובדגימות מחולים.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבודד במהירות ובאמינות תאי מונונוקלאריים ונויטרופילים, לנתח את השפעת הנויטרופילים על תיווך תגובות של תאי גידול לסוכני אנטי-סרטן, ולהקים תרבית קו-קלטורה תלת-ממדית.

neutrophil-isolation-analysis-to-determine-their-role-lymphoma-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

בסרטון זה אנו מדגימים את הבידוד של נויטרופילים ציטוטוקסיים בצפיפות גבוהה ונויטרופילים בצפיפות נמוכה מדמו של עכבר נושא גידול על ידי צנטריפוגה הדרגתית לא רציפה של סוכרוז.

בידוד נויטרופילים ציטוטוקסיים מדם עכבר נושא גידול

סרטון זה מדגים בדיקה החוקרת את תפקידם של תאים דמויי נויטרופילים בהגנה על תאי לימפומה מפני ציטוטוקסיות של חומרים כימותרפיים. תרבית משותפת תלת-ממדית, המורכבת מלימפומה ותאים דמויי נויטרופילים, מוקמת ונחשפת לווינקריסטין – תרופה כימותרפית. מגע ישיר עם תאים דמויי נויטרופילים גורם upregulation של חלבונים אנטי אפופטוטיים בתאי לימפומה, ובכך לקדם את הישרדותם בנוכחות vincristine.

קביעת תפקידם של תאים דמויי נויטרופילים ברגישות תאי לימפומה לתרופה ניסיונית

כאן אנו מתארים פרוטוקול כי זוגות שתי טכניקות proteomic, כלומר 2 ממדים אלקטרופורזה (2DE) וספקטרומטריית מסה (MS), לזהות הביעו באופן דיפרנציאלי / חלבונים שונה שלאחר translational בין שתיים או יותר קבוצות של דגימות ראשוניות. גישה זו, יחד עם ניסויים פונקציונליים, מאפשרת זיהוי ואפיון של סמנים / מטרות טיפוליות פרוגנוסטיים.

מספוט 2DE-ג&#39;ל לתפקוד חלבון: לקח מHS1 בכרוני לימפוציטית לוקמיה

נויטרופילים ממלאים תפקיד חשוב לא רק בהגנה על המארח מפני מיקרואורגניזמים פולשים, אלא גם מעורבים במעקב חיסוני אחר תאי גידול. כאן, אנו מתארים טכניקות הקשורות לבידוד נויטרופילים בעלי תכונות אנטי-גידוליות ושיטות לניטור תפקוד נויטרופילים נגד גידול במבחנה וב-vivo.

בידוד ואפיון של נויטרופילים עם תכונות אנטי-סרטניים

הפרוטוקול המתואר כאן מייצג שיטה קלה וניתנת לשחזור המשתמשת בכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בשלב הפוך (RP-HPLC) כדי למדוד את חילוף החומרים של פורין על תאי לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) שגודלו בתנאים שונים.

HPLC מבוססי Assay לפקח תאיים נוקלאוטיד / מטבוליזם nucleoside בתאי לוקמיה לימפוציטית כרונית

כאן, אנו מציגים שיטה שבה נויטרופילים אנושיים בצפיפות נמוכה (-כעבור שנה-), התאוששה נוזל שטיפת הצפק לאחר הניתוח, לייצר מסיבית מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות), השמנה ביעילות תאים סרטניים חינם לאחר מכן לגדול.

נויטרופילים מלכודות חוץ-תאי שנוצר על ידי נויטרופילים בצפיפות נמוכה המתקבל נוזל שטיפת הצפק התחלקות התא הגידול וקובץ מצורף

לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) הוא הלוקמיה הנפוץ ביותר בעולם המערבי. גורמי שעתוק NFAT הן הרגולטורים חשוב של פיתוח והפעלה סוגי תאים רבים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לשימוש של כרומטין immunoprecipitation (ChIP) בתאי CLL אדם לזיהוי גנים היעד הרומן של NFAT2.

כרומטין Immunoprecipitation Assay לזיהוי NFAT2 הרומן גנים היעד בלוקמיה לימפוציטית כרונית

פרוטוקול זה מפרט שיטה לבידוד של נויטרופילים מדם שלם, מעילי באפי או ממברנות לויקפרזיס, השגת תשואה טובה, טוהר גבוה, והפעלת תאים מינימלית. אנו משתמשים טיהור הדרגתי, משקעים בתאי דם אדומים (RBC), ותסיסת RBC כדי לקבל הכנה נויטרופיל באיכות גבוהה / טוהר.

בידוד של נויטרופילים אנושיים מדמם שלם ומעילי באפי

פרוטוקול זה כולל סדרה של בדיקות פונקציונליות נויטרופילים שישמשו כשיטת סינון לכיסוי פונקציות ממסלולי איתות שונים. הפרוטוקול כולל הערכה ראשונית ופשוטה של כדאיות התא, טוהר, ייצור מיני חמצן תגובתי, נדידה בזמן אמת, פגוציטוזה, והצעה ראשונית של מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים.

סדרה של טכניקות סינון לסקירה מהירה של פונקציית נויטרופיל

כאן, אנו מספקים גישה אמינה לבידוד נויטרופילים בצפיפות נמוכה ונורמלית מדם מלא באמצעות בידוד מגנטי (ברירה שלילית) ומדיום שיפוע צפיפות לא רציף. הוא מבטיח בידוד ללא נגיעה של תאים בעלי טוהר גבוה (≥93%), מה שמקל על ניתוח מדויק במורד הזרם של תת-אוכלוסיות נויטרופילים, חיוני להבנת תפקידיהם בבריאות ובמחלות.

בידוד ואפיון של נויטרופילים בצפיפות נמוכה ונורמלית מדם מלא

נויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDN) גדלים באופן משמעותי במספר מחלות. LDN מבודדים בדרך כלל באמצעות מיון תאים. אנו מציגים שיטה מעשית להשגת LDN טהור ובר קיימא. לאחר צנטריפוגה של שיפוע צפיפות של דם היקפי, התאים מודגרים עם מיקרו-חרוזים מגנטיים, ולאחר מכן LDN מופרדים באמצעות עמודות מגנטיות.

שיטת מיקרו-חרוזים מגנטיים מהירה לטיהור יעיל של נויטרופילים בצפיפות נמוכה

למדו לבודד נויטרופילים מדם אנושי באמצעות הפרדת שכבת צפיפות ולחקור את תפקידם ברגישות תאי לימפומה לטיפול בסוכנים אנטי-סרטניים. שיטה זו מאפשרת בידוד מהיר של אוכלוסיות תאים חיסוניים טהורות ללא פגיעה בתפקודם.

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

גלה סרטונים נוספים