בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

המטרה הכוללת של הליכים אלה היא לבודד במהירות נויטרופילים מטוהרים מאוד מדגימות דם אנושיות על ידי צנטריפוגה בשיפוע צפיפות כדי לחקור את תפקידם ברגישות תאי לימפומה לטיפול בסרטן באמצעות מודלים של תרביות תאי D ושלושה D. שיטות אלו יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי האינטראקציות בין מערכת החיסון המולדת לסרטן, כגון איזה תפקיד ממלאות תגובות תאי גידול בתיווך נויטרופילים בטיפול בסרטן. היתרון העיקרי של הפרדת שיפוע צפיפות הוא היכולת לבודד אוכלוסיות תאי חיסון טהורים בפרק זמן קצר מבלי לחשוף את התאים לגירויים משני תפקוד.

כדי לבודד את התאים הלוקמיים והנויטרופילים הראשוניים, התחל בהוספת 15 מיליליטר של דם שטופל ב-EDTA מדגימות חולי לוקמיה לימפוציטית כרונית לצינורות בודדים וסטריליים של 50 מיליליטר. מדללים את הדם ב -15 מיליליטר RPMI. ואז להוסיף בזהירות ולאט לאט 15 מיליליטר תמיסת שיפוע צפיפות בטמפרטורת החדר מתחת לדם, תוך הקפדה לא לערבב את השכבות.

לאחר הפרדת התאים על ידי צנטריפוגה, ייראו ארבעה שלבים נפרדים. הטסיות והפלזמה בחלק העליון, טבעת לבנה של תאים חד-גרעיניים, תמיסת שיפוע הצפיפות, והגרנולוציטים והאריתרוציטים בתחתית. בעזרת פיפטת מרעה מפלסטיק, העבירו תחילה את הטבעת הלבנה של תאי לוקמיה ראשוניים בצינור חדש של 50 מיליליטר.

שוטפים את התאים עם עד 50 מיליליטר PBS עם סידן ומגנזיום. ותלו מחדש את החך בחמישה מיליליטר PBS טרי. לאחר מכן, הוסיפו עוד 45 מיליליטר של PBS לתאים, וסובבו שוב את התאים.

לאחר הכביסה השנייה, השעו מחדש את החך במדיום RPMI מלא. וספרו את מספר התאים הלוקמיים הראשוניים הקיימאים. לאחר מכן, הסר את שכבות פלזמת הטסיות ושיפוע הצפיפות, והוסף 25 מיליליטר PBS ו-25 מיליליטר דקסטרין בנתרן כלורי לשלב אריתרוציטים גרנולוציטים.

מערבבים את הצינורות עשר פעמים בהיפוך. לאחר מכן, תנו לתאים להתיישב במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף שיווי המשקל, העבירו את שכבת הנויטרופילים העליונה של כדוריות הדם האדומות לצינור סטרילי של 50 מיליליטר וסובבו את התאים.

השעו מחדש את החך בחמישה מיליליטר PBS וליזו את כדוריות הדם האדומות עם 45 מיליליטר של מאגר ליזה של כדוריות אדומות. לאחר 15 דקות בחושך בטמפרטורת החדר, סובבו שוב את התאים ושטפו את החך ב -50 מיליליטר PBS. בתום הכביסה, השעו מחדש את התאים במדיום ה-RPMI השלם וספרו את מספר הנויטרופילים הקיימא.

לדלל את שתי קבוצות התאים ל-300,000 תאים לכל 50 מיקרוליטר של ריכוז RPMI ולחלק את הדגימות בין המספר המתאים של צינורות פקס של חמישה מיליליטר. לאחר צנטריפוגה, השעו מחדש את הכדורים ב -50 מיקרוליטר PBS בתוספת FBS. כדי לקבוע את הטוהר של תת-קבוצות התאים המבודדים, סמן את האליקוונטי של תאים לוקמיים ראשוניים עם נוגדן אנטי אנושיCD19 מצומד ל-APC ואת האליקוונטי של הנויטרופילים המטוהרים בתערובת של נוגדנים אנטי-אנושיים כמפורט בטבלה למשך 30 דקות בחושך בארבע מעלות צלזיוס.

בתום הדגירה יש לשטוף את התאים ב -500 מיקרוליטר של FBS בתוספת PBS ולהשעות מחדש את החיך ב -200 מיקרוליטר של FBS PBS טרי. לאחר מכן, נתח את טוהר אוכלוסיות התאים על ידי ציטומטריית זרימה, תוך הקפדה על צבע לפצות את הדגימות. כדי לתרבית משותפת של התאים הלוקמיים העיקריים עם הנויטרופילים האוטולוגים, ראה 200,000 תאים למיליליטר של תאים לוקמיים בלבד או עם נויטרופילים אוטולוגים בצלחת של 24 בארות במדיום RPMI שלם.

מערבבים את התאים בזהירות. לאחר מכן טפלו בתאים עם מעכב טירוזין קינאז של ברוטון למשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזי CO2. למחרת, אספו אליקוונט של התאים בשפופרת פקס מפלסטיק של חמישה מיליליטר.

לאחר מכן, סובב את התאים ושטוף את הכדורים במיליליטר אחד של FBS PBS. לאחר הצנטריפוגה השנייה, סמנו את התאים אנינקסין חמש ופרופידיום יודיד לפי הוראות היצרן למשך עשר דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן, נתח את הנויטרופילים ותאי הלוקמיה הראשוניים על ידי זרימה ציטומטרית באמצעות אסטרטגיית השער המאוירת.

כדי להקים תרבית משותפת תלת-ממדית, הוסף 50,000 תאי B של לימפומה RL בלבד או ערבב עם תאים מובחנים HL60 בצינורות סטריליים של 15 מיליליטר. סובב את הדגימות והשהה מחדש את הכדורים ב -300 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף, באמצעות קצה פיפטה מילימטר אחד עם פתח חתוך לשניים עד שלושה מילימטרים. לאחר מכן, דגרו 300 מיקרוליטר של התאים בכל באר של צלחת של 24 בארות למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזי CO2.

בתום הדגירה, הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום RPMI שלם לכל באר והחזירו את התרביות התלת-ממדיות לחממה למשך שבעה ימים נוספים עם החלפת מדיום כל יומיים. ביום החמישי, הוסף עשרה ננו-מולרים של אינקריסטין לתרביות. לאחר שבוע של תרבית, יש לשאוב את המדיום ולשטוף כל באר פעמיים עם מיליליטר PBS קר כקרח.

לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיליליטר PBS קר כקרח עם EDTA לכל באר וגרדו את קרקעית הבארות עם קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לנתק את הג'לים. מנערים את הצלחת בעדינות על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן, העבירו את תרחיפי התאים לצינורות סטריליים בודדים של 15 מיליליטר לנער עדין על קרח למשך 30 דקות נוספות.

אשר את המראה של תרחיף תאים הומוגני. לאחר מכן, סובב את התאים ואחריו שטיפת PBS והשהה מחדש את הכדורים ב-PBS טרי עם FBS. לבסוף, סמן את התאים עם הנוגדנים המתאימים וצבעי הכדאיות כפי שהודגם זה עתה ונתח את התאים המובחנים RL ו-HL60 על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות אסטרטגיית השער המאוירת.

ניתוח כל האירועים של אוכלוסיות התאים המבודדות על ידי זרימה ציטומטרית מדגים כי שיטת הפרדה זו מביאה ל-CD19 שיא יחיד טהור ביותר המבטא אוכלוסיית תאים לוקמיים ראשונית. ויותר מ-90 אחוז אוכלוסיית נויטרופילים טהורה חיובית לאנטיגנים הנפוצים של לויקוציטים CD45, ואנטיגנים CD15 ו-CD16 המתבטאים על ידי נויטרופילים בוגרים. הליכה על התאים הלוקמיים הראשוניים מתרביות קו-נויטרופילים מדגימה כי לנויטרופילים יש השפעה מגנה על הישרדות התאים כנגד מעכב הטירוזין איברוטיניב עם מספר גבוה משמעותית של תאים לוקמיים ראשוניים ברי קיימא בהשוואה לתרבית של תאים לוקמיים ראשוניים בלבד.

תאי HL60 מובחנים יציבים יותר בתרביות תלת D מאשר נויטרופילים. לאחר אינדוקציה של התפתחותם הגרנולוציטית, תאים אלה קטנים יותר מתאי HL60 לא ממוינים ומבטאים רמות גבוהות יותר של CD11B ו-CD38. תאי HL60 מובחנים מציגים גם גרעינים מרובי אונות.

תאים אלה מציגים השפעה מגנה על תאי RL עם מספר גבוה משמעותית של תאי RL ברי קיימא בשלוש תרביות D לאחר טיפול בווינקרוסטין בהשוואה לתאי לימפומה שטופלו בוינקרוסטין שגודלו לבד. לאחר השליטה, ניתן להשלים את שיטת הצנטריפוגה של שיפוע הצפיפות תוך 90 דקות. לאחר פיתוחן, טכניקות אלו סללו את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של הסרטן לחקור את ההשפעה של תאי דם לבנים שונים על ממאירות גידול במודלים פרה-קליניים ובדגימות חולים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד במהירות ובאמינות תאים חד-גרעיניים ואת הנויטרופילים, לנתח את ההשפעה של נויטרופילים על תיווך תגובות תאי הגידול לחומרים אנטי-סרטניים, ולהקים תרבית משותפת תלת מימדית.