Assay Microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של Hemagglutinins וירוס שפעת A
29 במאי 2016
באמצעות אסטרטגיית מיקרו-מערך גליקן מודפסת, מבחן צלחת קונבנציונאלי של 96 בארות ממוזער לניתוח של נגיף ההמגלוטינין של נגיף השפעת A והספציפיות לקולטנים המכילים חומצה סיאלית.
המטרה הכוללת של מערך גליקן ממוזער זה היא לנתח את הספציפיות והלהט של המגלוטינינים של נגיף שפעת A. בדיקה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי קשירת קולטן לנגיף שפעת A ולהיבות. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שבתוך בדיקה בודדת אנו יכולים להתייחס לספציפיות כמו גם ללהט קשירה יחסי, שבדרך כלל אינו מושג במערך גליקן טיפוסי ובמבחנים מבוססי צלחת.
פרוטוקול זה מתחיל בהכנות של דגימות הגליקן. הפתרון הבסיסי לגליקנים הוא מאגר הדפסת מלאי, שכאשר הוא מיוצר, יש לטטר אותו לאט ל-pH של 8.5 ולאחר מכן לתת לו תוספת של חומר פעילי שטח. בעזרת מאגר ההדפסה המוכן, יש לדלל את הגליקנים המצומדים ב-PAA ל-100 מיקרוגרם למיליליטר.
לאחר מכן, יש לדלל את הגליקנים החד-ערכיים ל-100 מיקרומולר גם במאגר ההדפסה. לבסוף, הכינו מלאי עבודה של הצבעים המתפקדים על ידי אמין במיקרו-טוחנת אחת. כעת טען עשרה מיקרוליטר מכל דגימת גליקן לבאר של צלחת מיקרוטיטר של 384 בארות.
פתרון זה מספיק כדי להדפיס חמש שקופיות. העבירו גם עשרה מיקרוליטר של סמן הצבע לבאר אחת של לוחית ההדפסה. התכוננו להדפסת המערכים על ידי מיקום ראשון של פיני המערך וראש ההדפסה בהתאם לפריסה.
במקרה זה, סיכה אחת יכולה להדפיס את כל הדגימות. מערכי הגליקנים מודפסים בבלוקים של שישה מוקפים בנקודה ריקה מכל הצדדים. לבש כפפות כדי להתמודד עם המגלשות.
פרקו אותם ופוצצו כל פסולת מעל פני השטח שלהם עם גז חנקן בטוהר גבוה במיוחד. לאחר מכן, מקם את השקופיות עם הצד המצופה כלפי מעלה על שלב המארגן. לאחר מכן, תכנת את המערך.
במקרה זה, תכנת 27 נקודות לכל ביקור בלוחית המקור. שלושה כתמים מקדימים המונחים על האזור שאינו מערך של שקופית מצופה פולי-ליזין משמשים להסרת עודפי נוזלים בקצה הסיכה. 24 הנקודות האחרות לכל ביקור בפין משמשות להצבת שישה מקומות בארבעה מערכי שכפול.
הפרטים מסופקים בפרוטוקול הטקסט. כעת, טען את לוחות הבאר המרובים למדפסת והתחל להדפיס את המערכים. בזמן ההדפסה, ודא שהלחות נשארת בין 55 ל-65% שימו לב למראה הכתמים המקדימים בשקופיות המצופות פולי-ליזין.
לאחר ההדפסה, בדוק חזותית כל שקופית. בדוק אם יש יישור נכון של הכתמים בתוך גבולות הטפלון, וזה חיוני, ובדוק את המספר הנכון של תכונות מנומרות. כדי לעזור להומוגניזציה של הצמדת הנקודות, הכניסו את השקופיות המודפסות לתא לחות של 100% כשהצד המודפס שלהן כלפי מעלה מיד לאחר הכנתן
השתמש במגבות נייר רטובות כדי לרפד מיכל ומתלה מאולתר. עטפו את החדר בניילון כדי ללכוד את הלחות. לאחר חצי שעה הסר את השקופיות.
לאחר מכן, מספר את השקופיות עם טוש עמיד בפני ממס ואחסן אותן בקופסת ייבוש למשך הלילה. למחרת, הכינו מלאי טרי של חיץ חוסם תוך ערבוב נמרץ. התאם את ה-pH של 9.2 באמצעות נתרן הידרוקסיד מרוכז.
לאחר מכן, דגרו את השקופיות במאגר למשך שעה. כדי להסיר את הבלוק, שטפו את השקופיות במים מזוקקים כפולים. לאחר מכן, העבירו את השקופיות למחזיקי כתמי זכוכית והעמיסו את המחזיקים למחזיק צלחת מתנדנד כדי לסובב את השקופיות יבשות ב-10 G למשך חמש דקות.
לאחר הייבוש, במידת הצורך אחסן את השקופיות במינוס 20 מעלות צלזיוס בשקיות ניילון אטומות. בהכנה, הכינו תא לחות נוסף כמו קודם. כדי לזהות את הגליקנים המשותקים, הכינו לקטינים ביוטיניים של SNA ו-ECA ב-10 מיקרוגרם למיליליטר במאגר בדיקה, והוסיפו שני מיקרוגרם למיליליטר של סטרפטווידין 555 לכל דילול.
כדי לצבוע עם ההמגלוטינינים, הכינו תמיסה של 20 מיקרוגרם למיליליטר של נוגדנים מורכבים מראש במאגר חוסם ביחס מולארי של ארבע לשניים לאחד כמתואר בפרוטוקול הטקסט. העבירו 20 מיקרוליטר מהתמיסות המוכנות לבארות של צלחת 384 בארות. לאחר מכן, יש לדלל באופן סדרתי את הלקטינים וההמגלוטינינים אחד לאחד במאגרים המתאימים להם.
בצע שמונה דילול, מלא כל באר ב -10 מיקרוליטר דגימה ו -10 מיקרוליטר חיץ. כעת, דגרו את הצלחת על קרח למשך 30 דקות. כעת הוסף שמונה מיקרוליטר מכל דילול לאחת מ-48 המיקרו-בארות בשקופית מודפסת.
לאחר מכן, דגרו את השקופית המוכנה בתא הלחות למשך 90 דקות. לאחר 90 דקות, שטפו את השקופית תוך החזקתה מהקצה; טבלו אותו ב-PBS-T ארבע פעמים, ואז טבלו אותו ב-PBS ארבע פעמים ולבסוף, טבלו אותו במים נטולי יונים ארבע פעמים. כעת, סובב את המגלשה כמו קודם.
לאחר ייבוש הסיבוב, סרוק מיד את השקופית. הקפד לטעון בזהירות את השקופית לסורק בכיוון הנכון. באמצעות הספק לייזר נמוך של חמישה מילי-וואט סרוק את השקופיות באופן איטרטיבי, והגדל בהדרגה את הרווח מ-25 ל-75%תוך אופטימיזציה של הגדרות הסריקה, זכור שהפלואורופורים ילבינו עם סריקות חוזרות ונשנות.
נתח את התמונה השמורה לאיגוד אותות באמצעות התוכנה המשויכת. ניתן לטעון רשימת מערכים עם דפוס האיתור. שכב-על על הסריקה כדי לסייע בניווט במיקום סמני הרשת.
לאחר מכן, השתמש בתוכנה כדי לנתח את עוצמות הנקודות ולשמור את התוצאות כקובץ טקסט מופרד בכרטיסיות לייצוא לגיליון אלקטרוני או לחבילה סטטיסטית אחרת. נתח את הנתונים על ידי חישוב עוצמת האות הממוצעת פחות הרקע. קח בממוצע ארבע מתוך שש נקודות השכפול עבור כל דגימה, והשאיר את האות הגבוה ביותר ואת האות הנמוך ביותר.
לאחר מכן, צור גרף קו של האות הממוצע הממוצע פחות הרקע כנגד שמונת ריכוזי החלבון. החלק את הקו המתקבל באמצעות רגרסיה לא ליניארית. מערך ה-PAA שימש להערכת ספציפיות קשירת הקולטן של המגלוטינינים של נגיף שפעת A.
המערך כלל בקרות לא סיאליליות באותן מיקרובארות. לקטינים צמחיים עם ספציפיות ידועה לתרכובות המודפסות שימשו כבקרות חיוביות. לקטין ה-ECA הקשור לגלקטוז הסופי בטא 1-4 קשור לאנצטיל גלוקוזאמין ולא נקשר לאותה תרכובת אם הגלקטוז הסופי היה מכוסה בחומצה סיאלית.
כדי לבדוק חומצה סיאלית מקושרת אלפא 2-6, נעשה שימוש בלקטין SNA. כצפוי, SNA קשור רק לחומצות סיאליות הקשורות אלפא 2-6, אך עם הבדלים בולטים בזיקה לחזרות צבע המקושרות ל-PAA לעומת צבע שאינו מקושר ל-PAA. לאחר מכן, נבדק המגלוטינין H5 שמקורו בנגיף וייטנאם/1203/04 שמזהה רק חומצות סיאליות הקשורות לאלפא 2-3.
פרופיל הקישור של המגלוטינין H5 הראה את הספציפיות הצפויה עם להיטות גבוהה יותר למבנים המקושרים ל-PAA. לבסוף, נבדק המגלוטינין H1 מזן H1N1 עונתי אנושי. כצפוי, המגלוטינין זה נקשר רק למבנים המכילים חומצה סיאלית מקושרת אלפא 2-6.
לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה לחשוף את הספציפיות הקשורה והקסם היחסי של נגיפי שפעת בבדיקה אחת. טכניקה זו תשפר מאוד את היעילות של בדיקות קשירת שפעת וכן תפחית את הצריכה של חומרים ביולוגיים יקרי ערך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
המחקר הזה מציג מערך גליקן מזעור שנועד לנתח את הספציפיות והאווידיות של המגלוטינינין של וירוס שפעת A. השיטה מאפשרת הערכה בו זמנית של קישור קולטן ואווידיות, דבר שלא ניתן להשיג בדרך כלל בבדיקות סטנדרטיות.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- וירולוגיה
- גליקוביולוגיה
- פיתוח בדיקות
רקע
- המגלוטינין של וירוס שפעת A משחק תפקיד מכריע בקישור הקולטן.
- הבנת הספציפיות של הקולטן חיונית לפיתוח חיסונים.
- בדיקות מסורתיות לרוב חסרות את היכולת למדוד בו זמנית אווידיות וספציפיות.
- מזעור של בדיקות יכול להגדיל את התפוקה ולהפחית את עלויות הריאגנטים.
מטרת המחקר
- לפתח מערך גליקן מזעור לניתוח וירוס שפעת A.
- להעריך את האווידיות והספציפיות של המגלוטינינין לקולטני חומצה סיאלי.
- לשפר את היעילות של בדיקות מערך גליקן.
שיטות בשימוש
- הכנת דגימות גליקן באמצעות מאגר הדפסה.
- טיטרציה של מאגר ההדפסה ל-pH של 8.5.
- דילול של גליקנים מצומדים PAA ל-100 מיקרוגרם למליליטר.
- שימוש בפורמט צלחת 96 באר עבור הבדיקה.
תוצאות עיקריות
- הבדיקה המזערית מודדת בהצלחה את האווידיות של המגלוטינין.
- נתחה ביעילות את הספציפיות לקולטנים המכילים חומצה סיאלי.
- התוצאות מצביעות על יעילות משופרת בהשוואה לשיטות מסורתיות.
- הטכניקה מאפשרת ניתוח מקיף בתוך בדיקה אחת.
מסקנות
- מערך הגליקן המזעור הוא כלי חשוב למחקר שפעת.
- שיטה זו יכולה להקל על הבנה טובה יותר של אינטראקציות הקולטן.
- יישומים עתידיים עשויים לשפר אסטרטגיות לפיתוח חיסונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This miniaturized glycan microarray enables simultaneous assessment of influenza A virus hemagglutinin specificity and avidity, addressing a critical gap in receptor-binding analysis. By reducing reagent consumption and increasing throughput, the assay supports early-stage antiviral and vaccine development with improved predictive confidence. The format allows for efficient screening of hemagglutinin variants across sialic acid linkages, informing target validation and lead identification efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates hemagglutinin binding to α2-3 and α2-6 sialic acid receptors to clarify receptor specificity and host range potential.
- Operational Value: Enables side-by-side comparison of PAA-linked and non-PAA-linked glycans to assess avidity differences within a single assay.
- Scientific Value: Uses plant lectins (SNA, ECA) as positive controls to validate array functionality and ensure reliable readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports serial dilution of hemagglutinins across eight concentrations to generate binding curves for avidity estimation.
- Operational Value: Miniaturized format prints 48 arrays per slide, equivalent to 18 conventional 96-well plates, significantly reducing sample and reagent use.
- Scientific Value: Allows simultaneous testing of six glycan-binding proteins at eight dilutions across six different glycans, including non-sialylated controls.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Assesses binding profiles of hemagglutinins from avian (H5) and human seasonal (H1N1) strains to evaluate receptor adaptation trends.
- Operational Value: Enables rapid comparison of binding specificity and relative avidity between viral strains to inform preclinical risk assessment.
- Scientific Value: Includes non-sialylated controls in each microwell to distinguish specific from nonspecific binding, improving data interpretability.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from early target validation to lead identification, providing quantitative binding data that supports go/no-go decisions in influenza therapeutic and vaccine programs.
- Discovery Biology: Tests hemagglutinin-receptor interactions to clarify mechanistic basis of viral entry and host specificity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence readouts after blocking, incubation, washing, and scanning steps.
- Analytics: Generates signal intensity data averaged from replicate spots, enabling nonlinear regression and avidity modeling.
- Translational Research: Links in vitro binding data to phenotypic outcomes such as receptor adaptation and cross-species transmission potential.
- Enterprise Reuse: The printed slide format allows for storage, batch processing, and reuse across multiple hemagglutinin screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides dual readouts of specificity and avidity, reducing mechanistic ambiguity in hemagglutinin-receptor interactions.
- Operational Value: Standardizes glycan presentation via PAA conjugation and controlled printing, enhancing assay reproducibility.
- Strategic Value: Accelerates screening timelines and reduces costs, improving capital efficiency in early influenza research.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of hemagglutinin targets based on receptor binding profiles and avidity metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in glycan chemistry, microarray printing, and fluorescence detection.
- Dependent on arrayer precision, humidity control (55–65% during printing), and proper slide handling to ensure spot integrity.
- Necessitates standardized blocking, probing, and washing protocols to minimize background and ensure specific signal detection.
- Requires calibration of scanning settings (low laser power, incremental gain) to avoid fluorophore bleaching while maximizing sensitivity.
- Limited to soluble glycan-binding proteins; not suitable for intact virions or membrane-bound complexes without adaptation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:42
Glycan Preparation and Plate Setup
1:56
Printing the Arrays
3:49
Humidifying, Numbering, and Blocking the Arrays
5:10
Analyzing Glycan Binding Proteins
6:55
Slide Scanning and Analysis
8:21
Results: Polyacrylamide (PAA) Array Specificity and Discrimination
10:00
Conclusion
