Assay Microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של Hemagglutinins וירוס שפעת A

המטרה הכללית של מערך הגליקנים הממוזער הזה היא לנתח את הספציפיות והאווידיות של המגלוטינין של נגיף השפעת A. בדיקה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע לקשירה לרצפטור ולאווידיות של נגיף השפעת A. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שבמסגרת בדיקה אחת ניתן לבחון הן את הספציפיות והן את אווידיות הקשירה היחסית, דבר שבדרך כלל לא ניתן להשיג במערכי גליקנים טיפוסיים או בבדיקות המבוססות על פלטות.

פרוטוקול זה מתחיל בהכנת דגימות הגליקנים. התמיסה הבסיסית עבור הגליקנים היא באפר הדפסה (printing buffer) מלאי, שבעת הכנתו יש לתתר אותו באיטיות עד ל-pH של 8.5 ולאחר מכן להוסיף לו חומר פעיל שטח. באמצעות באפר ההדפסה שהוכן, יש לדלל את הגליקנים המצומדים ל-PAA לריכוז של 100 µg/mL.

לאחר מכן, דללו את הגליקנים החד-ערכיים לריכוז של 100 micromolar גם כן בתוך תמיסת הבאפר להדפסה. לבסוף, הכינו תמיסות עבודה של הצבעים הפונקציונליים עם קבוצות אמין בריכוז של one micromolar. כעת, טענו ten microliters מכל דגימת גליקן לתוך באר של פלטת מיקרוטיטר בעלת 384 בארות.

כמות זו של תמיסה מספיקה להדפסת חמש שקופיות. כמו כן, העבירו 10 µL של סמן הצבע לבאר אחת בלוח ההדפסה. הכינו את המערכים להדפסה על ידי מיקום פיני המערך וראש ההדפסה בהתאם לתוכנית הפריסה.

במקרה זה, פין אחד יכול להדפיס את כל הדגימות. מערכי הגליקנים מודפסים בבלוקים של שישה, המוקפים בנקודה ריקה מכל הצדדים. יש להרכיב כפפות לטיפול בلامיות.

הוצאו אותן מהאריזה ונפחו כל לכלוך מפניהן באמצעות גז חנקן בדרגת טהרה גבוהה במיוחד. לאחר מכן, הניחו את השקופיות כאשר הצד המצופה פונה כלפי מעלה על משטח המערך (arrayer stage). לאחר מכן, תכננו את מכשיר המערך.

במקרה זה, הגדירו 27 נקודות לכל ביקור בלוחית המקור. שלוש נקודות מקדימות (pre spots), הממוקמות באזור שאינו חלק מהמערך על גבי שקף מצופה poly-L-lysine, משמשות להסרת עודפי נוזל מקצה הפין. 24 הנקודות האחרות לכל ביקור של פין משמשות להנחת שש נקודות בארבעה מערכים חוזרים.

פירוט מלא מופיע בפרוטוקול הטקסט. כעת, טענו את הפלטות בעלות הבארות המרובות למדפסת והתחילו בהדפסת המערכים. במהלך ההדפסה, ודאו שהלחות נשמרת בין 55 ל-65%. שימו לב למראה הנקודות המקדימות (pre spots) על השקופיות המצופות ב-poly-L-lysine.

לאחר ההדפסה, בצעו בדיקה ויזואלית של כל זכוכית. בדקו את הדיוק של מיקום הנקודות בתוך גבולות הטפלון, דבר שהוא חיוני, ובדקו אם מספר הנקודות המודפסות הוא נכון. כדי לסייע בהומוגניזציה של היצמדות הנקודות, הניחו את הזכוכיות המודפסות בתא עם 100% humidity כאשר הצד המודפס פונה כלפי מעלה מיד לאחר השלמת ההדפסה.

השתמשו במגבונים נייר רטובים כדי לרפד מיכל ומעמד מאולתר. עטפו את התא בניילון כדי לכלוא את הלחות. לאחר חצי שעה, הוציאו את השקופיות.

לאחר מכן, מספרו את העגיות באמצעות טוש עמיד בממסים ואחסנו אותן בכלי ייבוש (desiccation box) למשך לילה. למחרת, הכינו תמיסת מלאי רעננה של בופר חסימה (blocking buffer) תוך ערבוב נמרץ. התאימו את ה-pH ל-9.2 באמצעות נתרן הידרוקסיד מרוכז.

לאחר מכן, הדגרו את השקופיות בבופר למשך שעה. כדי להסיר את החסימה, שטפו את השקופיות במים מזוקקים פעמיים. לאחר מכן, העבירו את השקופיות למחזיקי צביעה מזכוכית והכניסו את המחזיקים למחזיק פלטות מתנדנד כדי לייבש את השקופיות בסיבוב ב-10 G's למשך חמש דקות.

לאחר הייבוש, במידת הצורך, יש לאחסן את השקופיות בטמפרטורה של 20- °C בשקיות פלסטיק אטומות. להכנה, צור תא לחות נוסף כפי שבוצע קודם לכן. כדי לזהות את הגליקנים המקובעים, הכן לקטינים ביוטיניליים מסוג SNA ו-ECA בריכוז של 10 µg/mL בבופר חדירה (probing buffer), והוסף 2 µg/mL של streptavidin 555 לכל דילול.

לצביעה באמצעות ההמגלוטינינים, הכין תמיסה של 20 microgram per milliliter של נוגדן קומפלקס-מוקדם בבופר חסימה ביחס מולרי של ארבעה-לשניים-לאחד כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. העבר 20 microliters מהתמיסות שהוכנו לבארות של פלטת 384-well. לאחר מכן, בצע דילול סדרתי של הלקטינים וההמגלוטינינים ביחס של אחד-לאחד בבופרים המתאימים להם.

הכינו שמונה דילולות, על ידי מילוי של כל באער ב-10 µL מדגימה וב-10 µL מבופר. כעת, דגרו את הפלטה על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 8 µL מכל דילול לאחד מ-48 המיקרובאערים שעל שקופית מודפסת.

לאחר מכן, הדגרו את השקופית שהוכנה בתא הלחות למשך 90 דקות. לאחר 90 דקות, שטפו את השקופית תוך כדי החזקתה מקצה השקופית; טבלו אותה ב-PBS-T ארבע פעמים, לאחר מכן טבלו אותה ב-PBS ארבע פעמים ולבסוף, טבלו אותה במים דה-יוניים ארבע פעמים. כעת, ייבשו את השקופית באמצעות סבב (spin-dry) כפי שבוצע קודם לכן.

לאחר ייבוש בצנטריפוגה, סרקו מיד את הפיתה. ודאו שאתם טוענים את הפיתה לסורק בזהירות ובכיוון הנכון. השתמשו בהספק לייזר נמוך של 5 mW לסריקה חוזרת של הפיתות, תוך הגדלה הדרגתית של ה-gain מ-25% ל-75%. בעת אופטימיזציה של הגדרות הסריקה, זכרו כי הפלואורופורים יעברו דהייה (bleaching) כתוצאה מסריקות חוזרות.

נתחו את התמונה השמורה כדי לאתר אותות קישור באמצעות התוכנה הרלוונטית. ניתן לטעון רשימת מערך (array list) הכוללת את תבנית הפיסור (spotting pattern). הניחו אותה כשכבה מעל הסריקה כדי לסייע בניווט במיקומי סימני הרשת.

לאחר מכן, השתמש בתוכנה כדי לנתח את עוצמות הנקודות ושמור את התוצאות כקובץ טקסט עם מפרידי טאב (tab delimited) לייצוא לגיליון אלקטרוני או לחבילה סטטיסטית אחרת. נתח את הנתונים על ידי חישוב עוצמת האות הממוצעת פחות הרקע. חשב ממוצע של ארבע מתוך שש נקודות החזרים לכל דגימה, תוך השמטת האות הגבוה ביותר והאות הנמוך ביותר.

לאחר מכן, צור גרף קווי של ממוצע האות פחות הרקע אל מול שמונת ריכוזי החלבון. החלק את הקו שהתקבל באמצעות רגרסיה לא ליניארית. מערך ה-PAA שימש להערכת ספציפיות הקישור של קולטנים להמאגלוטינינים של נגיף השפעת A.

המערך כלל בקרות שאינן סיאליליות באותן מיקרו-בארים. לקטינים מצמחים בעלי ספציפיות ידועה לתרכובות המודפסות שימשו כבקרות חיוביות. לקטין ECA נקשר לגלקטוז טרמינלי בקישור beta 1-4 ל-N-acetylglucosamine, ולא נקשר לאותה תרכובת אם הגלקטוז הטרמינלי היה חסום על ידי חומצה סיאלית.

כדי לבחון חומצה סיאלית מקושרת בקישור alpha 2-6, נעשה שימוש בלקטין SNA. כצפוי, SNA נקשר רק לחומצות סיאליות מקושרות בקישור alpha 2-6, אך עם הבדלים בולטים באפinity עבור חזרות של dye lacNAc מקושרות ל-PAA לעומת כאלה שאינן מקושרות ל-PAA. לאחר מכן, נבחן H5 hemagglutinin המופק מנגיף Vietnam/1203/04, המזהה אך ורק חומצות סיאליות מקושרות בקישור alpha 2-3.

פרופיל הקישור של ההמאגלוטינין H5 הראה את הספציפיות הצפויה, עם אבדיות גבוהה יותר למבנים מקושרים ב-PAA. לבסוף, נבדק ההמאגלוטינין H1 מזן H1N1 עונתי אנושי. כצפוי, המאגלוטינין זה נקשר רק למבנים המכילים חומצה סיאלית המקושרת ב-alpha 2-6.

לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן יהיה לחשוף את ספציפיות הקישור ואת האווידיות היחסית של נגיפי שפעת במסגרת בדיקה אחת. טכניקה זו תשפר משמעותית את היעילות של בדיקות קישור לשפעת, וכן תפחית את הצריכה של חומרים ביולוגיים יקרי ערך.