Name: Assay Microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של Hemagglutinins וירוס שפעת A (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: למדו להעריך את הספציפיות והלהיטות של Hemagglutinins של וירוס שפעת A באמצעות מערך glycan מיניאטורי. שיטה זו מאפשרת ניתוח מקיף של קישור קולטנים בנפח קטן וביעילות גבוהה יותר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מתקן Core Microarray סקריפס, וחוזה מן המרכז לבקרת מחלות (JCP). RPdV היא כלת מענק הרוביקון ו Veni מההסתדרות הולנד למחקר מדעי (NWO). המאגד עבור glycomics פונקציונלית (http://www.functionalglycomics.org/) במימון NIGMS מענק GM62116 (JCP) סיפק כמה גליקנים השתמשו במחקר זה. זהו פרסום 29,113 ממכון המחקר סקריפס.

הערה: כל השלבים מבוצעים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. בניית Array 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת glycan והגדרת פלייט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו מלאי של חיץ הדפסה. תחילה הפוך 500 מ&quot;ל של פתרון המניות 150 מ&quot;מ של פוספט נתרן dibasic. גם לעשות 50 מ&quot;ל של פתרון המניות 150 מ&quot;מ של פתרון פוספט נתרן monobasic. בבקבוק, באמצעות בר ומערבבים מגנטי מטר pH, לאט לכיל הפתרון פוספט נתרן dibasic עם הפתרון monobasic עד pH של 8.5 הוא הגיע. הוספת Tween-20 0.005%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את דגימות glycan. לדלל PAA גליקנים מצומדות, (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) ו 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (איור 1A הם להיות מדולל)) כדי 100μg / ml דפוס חיץ מן step1.1.1. גליקנים חד ערכי,diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH 2) 3 NH 2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2) ו 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2)) כדי 100μM במאגר הדפסה משלב 1.1.1. לבסוף, להכין את הצבעים פונקציונליים האמינים, להשתמש כסמני רשת / אורות נחיתה. כתמים סמן דיי מודפסים ב 1 מיקרומטר. הערה: צבע Atto488-NHS משמש הדפסים שלנו. עם זאת, כל צבען פונקציונלי אמין, קריא על ידי סורק השקופיות מתאים למטרה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 10 μl של כל דגימה glycan צלחות microtiter 384 גם משמש לטיפול רובוט הדפסה. חנות גליקנים בשימוש בתמיסת חיץ הדפסה ב -20 מעלות צלזיוס צינורות אטומים. Tansfer 10 μl של סמן צבע לצלחת הדפסה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הַדפָּסָה הערה: כל STEps כי חששו לגעת או להזיז את המגלשות חייבים להיעשות עם כפפות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח סיכות arrayer בראש ההדפסה על פי התצורה הנכונה של הפריסה. עבור פריסה זו להשתמש סיכה אחת כדי להדפיס את כל הדגימות ומערכים. הדפס את גליקנים בבלוקים של שש, מדלגי תכונה אחת (תכונה מוגדרת נקודה אחת של תרכובת מסוימת), בכל צד, כך כתם של המדגם הזהה אינם מודפסים בדיוק זה לצד זה. הערה: משתמש הקצה חייב להחליט את התצורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר שקופית משקיות, קופסות פתוחות, ולהסיר כל חלקיקי אבק או חתיכות קטנות של פלסטיק שעשויה להיות על פני השטח שלהם על ידי פיצוץ גז חנקן טוהר גבוה במיוחד על כל שקופית. מניחים את המספר הרצוי של שקופיות, צד מצופה למעלה, על הבמה arrayer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכנת את arrayer, השתמש בפרמטרים של 27 נקודות בכל ביקור לצלחת מקור, באמצעות 3 &quot;טרום כתמים&quot; על גבי שקופיות מצופה פולי- L- ליזין, כדי להסיר עודפי נוזלים על קצה סיכות הדפסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל MPU (יחידת כוח ראשית) יחידת בקרת האקלים. התוכנה להרחיב ניתוח ריצוף במחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פריסה בחר את האותיות. בחרו כלי פין אפשרויות → לשמש להדפסת כלי הדפסת המערך 1 x 1 - 1 סיכה אחת. בחר בכרטיסייה יעד → Definition מערך כלי → תבנית הדפסה ולהוסיף המגרש (spot-אל-המקום מרחק), מספר שורות ועמודות כדי להכיל דגימות שיודפס, ואת תבנית ההדפסה של דגימות (עבור מערך זה 8 8 x דפוס הדפסה משמש ב 340 מיקרומטר מגרש עבור 7 מכלל דגימות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פריסת שקופיות יעד → ולתכנת את מרחק בלוק ל-בלוק כדי לאפשר הדפסה של כל מערך לשכפל לתוך תבנית שקופית 48-היטב (4 x 12). בחר מקור ולהוסיף מספר טנדרי מקור (1 עבור כל דגימה בעת שימוש 1 פינים) (עבור טנדרי מקור הדפסת 7 זה ישמש כדי להכיל 6 בארות מדגם סמן צבע 1 היטב). הערה: מקור הדיאלוג צריך להפוך לירוק כדי להראות כי המספרביקורי מקור תואמות את הדגימות שתודפסנה בדפוס ההדפסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פלייט מתאם → יעד וחלק פריסה ולהתאים את מספר השקופיות (5 מגלשות מודפסות בכל פעם עבור בהדפסה עם שקף 1 תצפית מראש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את המגש על ידי לחיצה על כפתור T1 כדי להפעיל את המגש ולהוסיף את המספר הרצוי של שקופיות למגש, הקדשת תשומת לב למקומות של השקופית מראש התצפית (הכחולה) &quot;אמיתיות&quot; שקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח שקופיות זכוכית רגילות על כל יציאות הוואקום הנותרים לחסום את החלל ולחץ על אישור כדי להפעיל את הוואקום. בדוק שכל השקופיות מוחזקות במקום ולחץ על אישור כדי להחזיר את המגש למיקום הביתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את צלחת ההדפסה לתוך מחזיק הצלחת ולהבטיח המדף הוגדר כראוי במקום. לחץ GO ולאפשר את תהליך ההדפסה כדי להמשיך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדפס את 24 הנקודות שנותרו משכפל של 6 נקודות לכל מערך (4 מערכים / מקור הביקור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את 384 גם הצלחותלתוך המדפסת להתחיל בהדפסה. לשמור על לחות יחסית, במהלך ההדפסה, ברחבי ההדפסה בין 55 ו -65%. המדפסת מפסיקה לאחר הדפסת 5 שקופיות. הערה: בעוד microarray assay זה מודפס בדפוס 8 x 8 ספציפי, רובוטי הדפסת microarray שונים ידרשו תכנות ציוד ספציפי כדי להשיג את הפריסה הרצויה. זה תלוי למשתמש הקצה כדי לקבוע את הדפוס המתאים ביותר בהתחשב מפרט הציוד שלהם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחות / משתקות הערה: לאחר שקופיות סיום הדפסה, הם עוברים שלב קיבוע זמני, גם humidifying שנקרא. Humidifying-הדפסה פוסט עוזר homogenize את הקובץ המצורף מדגם ידי מחדש להרטיב את הנקודות ולהבטיח חסימה מלאה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים שקופיות בתא לחות 100% מיד לאחר ההדפסה לתקופה של 30 דק &#39;. לבנות את החדר על ידי צבת מגבות נייר רטובות מאוד שטוחות בחלקו התחתון של צלחת זכוכית גדולה, צבת השקופיותעל איזה מדף, כגון למעלה בצד מתלה מבחנה, הדפסה, ואיטום בניילון נצמד כדי ללכוד את הלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספר המחליק עם אלכוהול / עט חנות עמידות ממסים סימון בקופסא התייבשות. לייבש לילה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספור, חסימה, ואחסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החיץ חסימה - 50 מ&quot;מ ethanolamine ב 50 מ&quot;מ חיץ borate. ראשית, לפזר חומצה בורה, DDH 2 O, לריכוז סופי של 50 מ&quot;מימ בבקבוק המכיל בר ומערבבים מגנטי. מערבב את הפתרון נמרצות על צלחת ערבוב עד שכל המוצק נמס. תוך ערבוב מתמיד, להוסיף את הכמות המתאימה של ethanolamine מפתרון 16.54 M המניה להגיע 50 ריכוז מ&quot;מ הרצוי. הוספת סודיום הידרוקסיד מרוכז להסתגל pH הסופי של 9.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות מודפסות הפתרון למאגר החסימה עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות 1 hr, לשטוף את שקופיות DDH 2 O כדי להסיר כל עקבות עודפות של חיץ חסימה.השלך חיץ חסימה מיכל פסולת מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שקופיות לבעלי מכתים זכוכית ספין יבש. מערכים יבשים על ידי הצבה בצנטריפוגה מצוידת מחזיקי צלחת מתנדנד, במהירות של 10 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השקופיות הן יבשות, הם יכולים להיות מודגרות מייד או שומרים אותו. תנאי אחסון הם -20 ° C בתוך שקית פלסטיק אטומה. </li></ol></li></ol> 2. ניתוח חלבונים מחייב glycan <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תא humidified שבו מערכים להיות הכלאה יתאים. חדר פשוט מורכב תבנית פיירקס, שכבתי בתחתית עם מגבות נייר לחות ו מתל, שעליו השקופיות תנחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש לקטינים biotinylated SNA (agglutinin סמבוקה nigra) ו ECA (Erythrina cristagalli agglutinin) ב 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל + 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל של צבע streptavidin-555, ב חיטוט חיץ (PBS + 0.01% Tween-20). עבור HA (A / וייטנאם / 1203/04 H5N1 ו- A / KY / 07 H1N1, בדוגמה זו), שימושריכוז התחלתי של 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל מראש ומורכבת, כפי שתואר לעיל 34. בקצרה, לעשות HA: עכבר-α-סטרפטוקוקוס: תערובת עיזים-α-עכבר-Alexa647 בחסימת המאגר (PBS + 3% BSA + 0.01% Tween-20), בכל 4: יחס טוחנת 1: 2. הערה: המערך ומישש עם לקטינים כדי לוודא גליקנים הם משותקים ו לגילוי (איור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון לערבב חלבון-נוגדן מחייב glycan של 20 μl לצלחת 384 גם לדגור על קרח למשך 30 דקות. סדרתי לדלל לקטינים ו HA דגימות 1: 1, במאגר שלהם מתאימה, 8 פעמים, על ידי ערבוב 10 μl של המדגם עם 10 μl של חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 8 μl של המדגם על פני השטח מיקרו-היטב דגירה של humidification אטום (100% לחות יחסית) תא במשך 90 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השקופיות אחד בכל פעם על ידי לחיצה על בקצוות טבילתם ארבע פעמים בתערובת של PBS ו 0.05% Tween, אז ארבע פעמים PBS, ולבסוף ארבע פעמים deionized H 2 O. שימושבאותו פרוטוקול הייבוש שמתואר בשלב החסימה, לסובב את המערכים לייבש בצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 10 x ז. </li></ol> 3. ניתוח סריקת נתונים הערה: microarrays glycan ניתן לסרוק על הגדרות שונות, בהתאם ליצרן של סורק microarray. על ידי שינוי כוח לייזר רזולוציה, המכשיר יכול לייצר תמונה עם אותות רבים ככל האפשר בתוך הטווח הדינמי שלה (תרשים 1C). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בסורק שקופיות פלורסנט ולסרוק את המערכים מייד לאחר דגירה עם החלבונים המחייבים glycan. תשמור על מנת להבטיח את השקופית מוכנסת כהלכה לתוך מכשיר הסריקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנת סריקה להרחיב. לחץ על התחל כדי לפתוח את התוכנית. להתחבר סורק: Connect → סורק או כפתור ירוק &#39;מתפריט החלונית ניווט סורק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלת autoloader להרחיב של הסורק. מניח שקופיות חריצי autoloader בסדר מסוימים. דלת autoloader סגורה. Clאיכס &quot;לקרוא מטעין&quot; בחלונית ניווט כלים לזהות אוטומטית שקופיות הסורק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדר פרמטר סריקה: פרמטרי סריקת → הסורק מתאימים הניסוי (למשל 635 כוח הליזר גבוה, רווח זיהוי 50%). שקופיות סריקה: סורק → סריקה. בחר נתיב-ידי יצירת תיקייה לשמור את תמונות סריקה וסריקות בודדות שם. האם לפני זה כדי הסריקה בפועל. חזור על הפעולה עבור כל שקופית הפרט. לחץ על אישור כדי להתחיל בסריקה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת הסורק כדי להגדיר את המכשיר לסרוק את השקופיות. סורק הגדר כדי לסרוק באופן איטרטיבי בהספק לייזר נמוך (5 mW) עם חיזוק הגדרות רווח של 25%, 50% ו -75%. הערה: ההגדרות תוכלנה להיבדק ולקבל טיפול מותאם, אך יש לזכור כי כל סריקה יכולה להפחית את תפוקת הקרינה של הצבעים בשל photobleaching. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת תוכנת ניתוח נתוני פתיחה כגון תוכנות Mapix. לחץ על התחל כדי לפתוח את התוכנית. התמונה הסרוקה להרחיב: קובץ → im פתוחגיל. קובץ GAL להרחיב: נתח → רשת פתוחה ובחר בקובץ GAL המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן בלוקים מצב: תמונה → בלוקים מצב להזיז את הרשת. השתמש בסמנים ברשת כדי להגדיר את הרשת אל המיקום המתאים בשקופית. התאם בלוקים בודדים לפי צורך להתאים את המערך המודפס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זן כתמי מצב: תמונת → מצב כתם להתאים מיקום וגודל של מקומות מסוימים בתוך הבלוק. לאחר כל אבני כתמים מותאמים ובמקום, עוצמות אות מידה ידי לנתח חישובים photometric →. שמור את קובץ הפלט. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השקופיות סיימו סריקה, תמונות מנותחות לכריכת אותות עם תכנית עיבוד תמונה המותקנת (האיור 1D - G). לניתוח תמונה, לטעון קובץ GAL (רשימת Array) מעל התמונה TIFF סרק. הערה: קובץ GAL מכיל הוא את דפוס פריסת ספוט זהותם של כל מיקום נקודה. קבצי GAL עבור מערכים הם created ידי תוכנת המדפסת באמצעות קובץ טקסט מופרד באמצעות טאבים המכיל את זהותם של דגימות ומיקומם בצלחת מקור 384 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אורות רשת סמן / נחיתה מודפסים על microarrays למקם את רשת GAL כראוי. מקומות מסוימים ייתכן שיהיה צורך להתרגש בנפרד, אלא מערך מודפס היטב יאפשר בדרך כלל בלוקים בתוך הרשת להציב בקלות. בעקבות מיקום הרשת, לאסוף עוצמות במקום על ידי התוכנה והציל כקובץ טקסט מופרד באמצעות טאבים (.txt). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת גיליונות אלקטרוניים, לפתוח את קובץ הפלט מהסורק. פתח את קובץ מאקרו המתאים ממיקום התיקייה. לחץ על הצג → מאקרו → RunMacro. הערה: כתובה מראש יעתיק את נתוני תפוקת גלם, להסיר שורות ועמודות מיותרות, למיין הנתונים לפי מדגם, לחשב את ערכי רקע מינוס אות תוחלת הממוצעים ואת העלילה ערכי הנובע ממנו אל גיליון עבודת התפשטות גיליון המכיל את הגרפים עבור כל מששת samples נבדק על המערך. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Tumpey, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-amino+acid+change+in+the+hemagglutinin+of+the+1918+influenza+virus+abolishes+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission.</a> Science. 315 (5812), 655-659 (2007).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+balance+of+the+hemagglutinin+and+neuraminidase+activities+accompanies+the+emergence+of+the+2009+H1N1+influenza+pandemic%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Functional balance of the hemagglutinin and neuraminidase activities accompanies the emergence of the 2009 H1N1 influenza pandemic.</a> J Virol. 86 (17), 9221-9232 (2012).</li>
<li>Bouvier, N. M., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">The biology of influenza viruses.</a> Vaccine. 26, Suppl 4. D49-D53 (2008).</li>
<li>Freidl, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+at+the+animal-human+interface%3A+a+review+of+the+literature+for+virological+evidence+of+human+infection+with+swine+or+avian+influenza+viruses+other+than+A%28H5N1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveill%22%5BJournal%5D)">Influenza at the animal-human interface: a review of the literature for virological evidence of human infection with swine or avian influenza viruses other than A(H5N1).</a> Euro Surveill. 19 (18), (2014).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+recognition+of+avian-like+receptors+in+human+influenza+A+H7N9+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Preferential recognition of avian-like receptors in human influenza A H7N9 viruses.</a> Science. 342 (6163), 1230-1235 (2013).</li>
<li>Paulson, J. C., de Vries, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H5N1+receptor+specificity+as+a+factor+in+pandemic+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">H5N1 receptor specificity as a factor in pandemic risk.</a> Virus Res. 178 (1), 99-113 (2013).</li>
<li>Tzarum, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+receptor+binding+of+the+hemagglutinin+from+a+human+H6N1+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Structure and receptor binding of the hemagglutinin from a human H6N1 influenza virus.</a> Cell Host Microbe. 17 (3), 369-376 (2015).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human-Infecting+H10N8+Influenza+Virus+Retains+a+Strong+Preference+for+Avian-type+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">A Human-Infecting H10N8 Influenza Virus Retains a Strong Preference for Avian-type Receptors.</a> Cell Host Microbe. 17 (3), 377-384 (2015).</li>
<li>Carroll, S. M., Higa, H. H., Paulson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+cell-surface+receptor+determinants+of+antigenically+similar+influenza+virus+hemagglutinins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Different cell-surface receptor determinants of antigenically similar influenza virus hemagglutinins.</a> J Biol Chem. 256 (16), 8357-8363 (1981).</li>
<li>Gambaryan, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+receptor-binding+phenotypes+of+influenza+virus+isolates+from+different+hosts+using+synthetic+sialylglycopolymers%3A+non-egg-adapted+human+H1+and+H3+influenza+A+and+influenza+B+viruses+share+a+common+high+binding+affinity+for+6%27-sialyl%28N-acetyllactosamine%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolymers: non-egg-adapted human H1 and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6'-sialyl(N-acetyllactosamine).</a> Virology. 232 (2), 345-350 (1997).</li>
<li>Rogers, G. N., D'Souza, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+binding+properties+of+human+and+animal+H1+influenza+virus+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Receptor binding properties of human and animal H1 influenza virus isolates.</a> Virology. 173 (1), 317-322 (1989).</li>
<li>Rogers, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+amino+acid+substitutions+in+influenza+haemagglutinin+change+receptor+binding+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity.</a> Nature. 304 (5921), 76-78 (1983).</li>
<li>Paulson, J. C., Rogers, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resialylated+erythrocytes+for+assessment+of+the+specificity+of+sialyloligosaccharide+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Resialylated erythrocytes for assessment of the specificity of sialyloligosaccharide binding proteins.</a> Methods Enzymol. 138, 162-168 (1987).</li>
<li>Paulson, J. C., Sadler, J. E., Hill, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+specific+myxovirus+receptors+to+asialoerythrocytes+by+incorporation+of+sialic+acid+with+pure+sialyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Restoration of specific myxovirus receptors to asialoerythrocytes by incorporation of sialic acid with pure sialyltransferases.</a> J Biol Chem. 254 (6), 2120-2124 (1979).</li>
<li>Chutinimitkul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assessment+of+attachment+pattern+and+replication+efficiency+of+H5N1+influenza+A+viruses+with+altered+receptor+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">In vitro assessment of attachment pattern and replication efficiency of H5N1 influenza A viruses with altered receptor specificity.</a> J Virol. 84 (13), 6825-6833 (2010).</li>
<li>Glaser, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+amino+acid+substitution+in+1918+influenza+virus+hemagglutinin+changes+receptor+binding+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A single amino acid substitution in 1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity.</a> J Virol. 79 (17), 11533-11536 (2005).</li>
<li>Herfst, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airborne+transmission+of+influenza+A%2FH5N1+virus+between+ferrets%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets.</a> Science. 336 (6088), 1534-1541 (2012).</li>
<li>Nobusawa, E., Ishihara, H., Morishita, T., Sato, K., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Change+in+receptor-binding+specificity+of+recent+human+influenza+A+viruses+%28H3N2%29%3A+a+single+amino+acid+change+in+hemagglutinin+altered+its+recognition+of+sialyloligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Change in receptor-binding specificity of recent human influenza A viruses (H3N2): a single amino acid change in hemagglutinin altered its recognition of sialyloligosaccharides.</a> Virology. 278 (2), 587-596 (2000).</li>
<li>Gambaryan, A. S., Matrosovich, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+solid-phase+enzyme-linked+assay+for+influenza+virus+receptor-binding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity.</a> J Virol Methods. 39 (1-2), 111-123 (1992).</li>
<li>Totani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoenzymatic+synthesis+and+application+of+glycopolymers+containing+multivalent+sialyloligosaccharides+with+a+poly%28L-glutamic+acid%29+backbone+for+inhibition+of+infection+by+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Chemoenzymatic synthesis and application of glycopolymers containing multivalent sialyloligosaccharides with a poly(L-glutamic acid) backbone for inhibition of infection by influenza viruses.</a> Glycobiology. 13 (5), 315-326 (2003).</li>
<li>Gambaryan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+specificity+of+influenza+viruses+from+birds+and+mammals%3A+new+data+on+involvement+of+the+inner+fragments+of+the+carbohydrate+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals: new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain.</a> Virology. 334 (2), 276-283 (2005).</li>
<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+specificity+of+influenza+A+viruses+correlates+with+the+agglutination+of+erythrocytes+from+different+animal+species%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Receptor specificity of influenza A viruses correlates with the agglutination of erythrocytes from different animal species.</a> Virology. 227 (2), 493-499 (1997).</li>
<li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+human-type+receptor+binding+specificity+by+new+H5N1+influenza+virus+sublineages+during+their+emergence+in+birds+in+Egypt%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Acquisition of human-type receptor binding specificity by new H5N1 influenza virus sublineages during their emergence in birds in Egypt.</a> PLoS Pathog. 7 (5), e1002068(2011).</li>
<li>Chandrasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+topology+determines+human+adaptation+of+avian+H5N1+virus+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Glycan topology determines human adaptation of avian H5N1 virus hemagglutinin.</a> Nat Biotechnol. 26 (1), 107-113 (2008).</li>
<li>Blixt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printed+covalent+glycan+array+for+ligand+profiling+of+diverse+glycan+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (49), 17033-17038 (2004).</li>
<li>Childs, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-binding+specificity+of+pandemic+influenza+A+%28H1N1%29+2009+virus+determined+by+carbohydrate+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Receptor-binding specificity of pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus determined by carbohydrate microarray.</a> Nat Biotechnol. 27 (9), 797-799 (2009).</li>
<li>Nycholat, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+Sialylated+Poly-N-acetyllactosamine+Chains+on+N-+and+O-Linked+Glycans+by+Human+and+Avian+Influenza+A+Virus+Hemagglutinins%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Recognition of Sialylated Poly-N-acetyllactosamine Chains on N- and O-Linked Glycans by Human and Avian Influenza A Virus Hemagglutinins.</a> Angew Chem Int Ed Engl. , (2012).</li>
<li>Rillahan, C. D., Paulson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+microarrays+for+decoding+the+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glycan microarrays for decoding the glycome.</a> Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).</li>
<li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sialylated+glycan+microarray+reveals+novel+interactions+of+modified+sialic+acids+with+proteins+and+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A sialylated glycan microarray reveals novel interactions of modified sialic acids with proteins and viruses.</a> J Biol Chem. 286 (36), 31610-31622 (2011).</li>
<li>Gulati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+H3N2+Influenza+Viruses+Isolated+from+1968+To+2012+Show+Varying+Preference+for+Receptor+Substructures+with+No+Apparent+Consequences+for+Disease+or+Spread%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human H3N2 Influenza Viruses Isolated from 1968 To 2012 Show Varying Preference for Receptor Substructures with No Apparent Consequences for Disease or Spread.</a> PLoS One. 8 (6), (2013).</li>
<li>Stevens, J., Blixt, O., Paulson, J. C., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+microarray+technologies%3A+tools+to+survey+host+specificity+of+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Glycan microarray technologies: tools to survey host specificity of influenza viruses.</a> Nat Rev Microbiol. 4 (11), 857-864 (2006).</li>
<li>de Vries, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+hemagglutinin+protein+of+the+new+pandemic+H1N1+influenza+virus%3A+maintaining+optimal+receptor+binding+by+compensatory+substitutions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Evolution of the hemagglutinin protein of the new pandemic H1N1 influenza virus: maintaining optimal receptor binding by compensatory substitutions.</a> J Virol. 87 (24), 13868-13877 (2013).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+receptor+binding+preferences+of+recombinant+human+A%28H3N2%29+virus+hemagglutinins%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Structure and receptor binding preferences of recombinant human A(H3N2) virus hemagglutinins.</a> Virology. 477, 18-31 (2015).</li>
<li>de Vries, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influenza+A+virus+hemagglutinin+glycosylation+state+affects+receptor-binding+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The influenza A virus hemagglutinin glycosylation state affects receptor-binding specificity.</a> Virology. 403 (1), 17-25 (2010).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף

הערכה סגולית הקולטן IAV היא צעד חשוב בניתוח פוטנציאל מגיפת וירוסי עופות. הכרת חומצת sialic ידי הנגיף קשור לכמה מאפיינים ביולוגיים כגון קשירה ושחרור מהתא. ידיעה אשר מוטציות-חומצת אמינו נחוצות וירוסי עופות להשיג α2-6 מחייבים ולחצות את מחסום המינים מאפשר מוכן לקראת מגפה. מבחנים כמה משמשים כדי לקבוע סגוליות הקולטן; יש עם זאת, כל החסרונות שלהם, כולל להיטות מדידה בלבד ולא סגולי ולהיפך. כאן אנו מתארים כלי רומן ...

עופות מים ברים הם המאגר הטבעי של IAV, אבל IAV הוא מסוגל לחצות את מחסום המינים כדי עופות ויונקים, כולל בני אדם. IAVS עופות להכיר חומצות sialic α2-3 צמוד (קולטנים מסוג העופות), ואילו וירוסי אדם להיקשר α2-6 חומצות sialic צמודות (קולטנים מסוג האדם). כדי להיות מסוגל לשכפל ביעילות ולהעביר בין בני האדם IAV עופות צריך להיקשר לקולטנים מסוג האדם 1. IAVS מחולקים לפי סרולוגיה המאפיינת את antigenicity של hemagglutinin שלהם (HA) נורמינידאז גליקופרוטאינים המעטפה (NA). HA נקשר חומצות sialic, ואילו NA הוא האנזים להרוס קולטן בקצה השני של מחזור החיים של נגיפי ודבק sialic חומצה 2. כל הווירוסים מדביקים האדם, כולל H1N1, H2N2 ו H3N2, יש מוצא עופות 3. בשנים של העשורים האחרונים עופות כדי crossovers אדם התרחש, עם H5N1, H7N7, H7N9 ו להיות הכי ידוע; HoweVer, תת אחרים נגועים בני האדם יותר באופן ספוראדי (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. למרבה המזל, נראה כי אף אחד הווירוסים הללו הצליחו להסתגל באופן מלא לקולטנים חומצת sialic אדם מהסוג צמוד α2-6 5-8. הסתגלות של וירוסים zoonotic העופות או אחרים כדי להתאים שכפול והעברת ב המארחים אדם יכול להיות בעל השפעה הרסנית על בריאות האדם. לכן, ידע מוקדם של כמה וירוסים אלה מתפתחים להיקשר לקולטנים אדם מהסוג יעזרו מעקב חובק-עולם של נגיפי שפעת מתעוררים. קביעת העדפת קולטן הובררה ראשונה באמצעות אריתרוציטים של מינים שונים ונשארת assay מועדף בקרב כל חוקרי שפעת 9-12. ההפגנה כי וירוסים העופות להכיר חומצה sialic α2-3 ווירוסים האדם α2-6 מקושר חומצה sialic התבססה במקור על assay באמצעות hemagglutination של אריתרוציטים מהונדסים enzymatically להכיל כל אחד linkages 13,14. למרות ההודעה היא hemagglutination, assay תקן וירולוגים, מבני glycan הבסיסיים אינם מוגדרים, הצמדת המסוף בלבד. בנוסף, הזמינות המוגבלת של sialyltransferases, המשמש מחדש sialylate התאים, מצמצמת את השימוש של assay זה 15-18. בהמשך לכך, שיטות אחרות של בקביעת העדפות מחייב קולטן הוכנסו באמצעות מבנים glycan sialylated צמוד פולי-acrylamide (PAA) או פולי-גלוטמט (PGA) מבנים מבוססי מבחני צלחת 19,20. כמה וריאציות אפשריות ציפוי גם את גליקנים או וירוסי צלחות microtiter, שכל אחת מהן התוצאה היא assay ELISA מהסוג איתנה, אמינות מאוד רגישה 21-23. לחלופין, גליקנים צמודים ביוטין יכולים להחליף PAA / PGA וניתן מצומדות כדי צלחות streptavidin מצופה 2,24. למרות שהחלק סר ספציפי עשויים להידרש, ELISAs הם גליקנים תקן וכמה צמוד PAA הם בקלות commercially ושאינם זמינים מסחרית (קונסורציום glycomics פונקציונלית (http://www.functionalglycomics.org)). טכנולוגיות microarray glycan צמחו כמו כלי רב ערך כדי לקבוע סגוליות הקולטן, כפי הם הבחינו גליקנים שונים מרובים, והיקשרות מגוון רחב של מבנים שונים ניתן להעריך בתוך assay יחיד 25-29. עקידת IAV במבנים אלו מספקת הבנה טובה יותר של מבנים glycan כי IAV מזהה מועדף 30-33. microarrays glycan דורש כמויות קטנות של נפח דגימה לבצע assay מחייב ורק משתמש בכמויות זעירות של glycan לכל נקודה (2 nl). עם זאת, מערכים אלו משמשים בדרך כלל רק להעריך סגוליים של קולטנים גליקנים. ניתוח של וירוסים מרובים, או חלבוני hemagglutinin, בטווחי ריכוז מרובים יכול להיות מונע בשל מספר השקופיות הנדרשות. יתר על כן, עד כה, לא assay להיטות ביחס פותח באמצעות ar glycanטכניקות ray. כדי לשלב את דרישת המדגם הנמוכה המוענקת על ידי טכניקות microarray glycan ואת הרגישות של גליקנים צמודים PAA מבחנים מבוססים ELISA, בקשנו לפתח מערך glycan רב גם שיאפשר ניתוח תפוקה גבוהה עם רזולוציה דומה או טובה יותר לעומת אל assay ELISA המבוסס המסורתי. במקביל, רצינו לצמצם את כמות ביולוגיות וכימיקלי כתב נצרכו. התוצאה הסופית היא assay להיטות מיניאטורי, שפותחה במיוחד עבור ניטור סגולי IAV והוא ישים באותה מידה להעריך חלבונים מחייבים glycan אחרים. באמצעות שקופיות זכוכית מתחלקות 48-בארות מייקרו ידי מסכת טפלון, 6 גליקנים שונים הם הבחינו ב 6 משכפל לכל טוב. פלטפורמת microarray מקנה המגמות אותו קולטן כריכה לראות בפורמט מאקרו ELISA עם מספר יתרונות. אלה כוללים (I) הדפסה של המתחם ב 6 משכפל, באמצעות מדגם מינימלי, לעומת ציפוי של כמה שורות אניצלחת נה, באמצעות 100 μl לכל היטב; (II) תרכובות שונות מרובות נתחו במקביל באר יחיד, לרבות בקרות; (III) ירידה מסיבית נפח דגירה; (IV) טווח דינמי גדול יותר באמצעות הודעת ניאון. שקופית יחידה ניתן לחשב להיות שווה ערך ל 18x 96-גם הצלחות. עם הפרוטוקול הבא, מסוגל במעבדה כל בפברוק וניתוח הבחין microarrays אמור להיות מסוגל לייצר פורמט ELISA מיניאטורי זה.

<table><tbody><tr><td>NEXTERION&reg; שקופית H MPX-48&nbsp;</td><td>Schott</td><td>1091525</td><td>Microwell שקופיות</td></tr><tr><td>ProScanArray Plus&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>הופסק</td><td>סורק מיקרו-מערך קונפוקלי</td></tr><tr><td>Innoscan 1100AL סורק/תוכנת Mapix</td> <td>סורק מיקרו-מערך קונפוקלי</td><td>Innopsys-microGrid</td><td></td></tr> <tr><td>II&nbsp;</td><td></td><td>מדפסת Digilab-microaray</td><td></td></tr> <tr><td>SNA</td><td>Vector Labs</td><td>B-1305&nbsp;</td><td>לקטין צמחי</td></tr><tr><td>ECA</td><td>Vector Labs</td><td>B-1145&nbsp;</td><td>לקטין צמחי</td></tr><tr><td>נוגדנים נגד סטרפטוקוקוס</td><td>IBA</td><td>2-1509-001&nbsp;</td><td>Anitbody לקשירת HA</td></tr><tr><td>אנטי עכבר Alexa-647</td><td>Life</td><td>A-21235</td><td>Anitbody עבור HA מחייב</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287&nbsp;</td><td>מחטא</td></tr><tr><td>די-בסיסי נתרן פוספט</td><td>סיגמא</td><td></td><td>255793 רכיב חיץ הדפסה</td></tr><tr><td>מונו-בסיסי נתרן פוספט</td><td>סיגמא</td><td>229903&nbsp;</td><td>רכיב מאגר הדפסה</td></tr><tr><td>תמיסת פולי-ליזין</td><td>Sigma</td><td>P8920&nbsp;</td><td>רכיב שקופית לאיתור מראש</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>סיגמא</td><td>221465</td><td>רכיב שקופיות טרום איתור</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סיגמא</td><td>493546</td><td>רכיב שקופית מראש</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח</td><td>קורנינג</td><td>46-013-CM</td><td>מאגר דגירה/כביסה</td></tr><tr><td>סיכות SMP4B סיכת</td><td>הדפסה Telechem</td><td>SMP4B</td><td></td></tr><tr><td>חנקן דחוס (דרגה 5)</td> <td>Praxair</td><td>UN1066</td><td>כלי אבק/ייבוש כללי</td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>סיגמא</td><td>B6768-500G</td><td>מגיב חסימת שקופיות</td></tr><tr><td>אתנולמין</td><td>סיגמא</td><td>E9508-500ML</td><td>מגיב חסימת שקופיות</td></tr><tr><td>Atto 488</td><td>AttoTec</td><td>AD 488-91</td><td>סמן רשת על מערך</td></tr><tr><td>קונסורציום PAA-LNLN</td><td>עבור גליקומיקס פונקציונלי</td><td>PA368</td><td>גליקנים מנומרים</td></tr><tr><td>PAA-3SLNLN</td><td>קונסורציום עבור Functional Glycomics</td><td>PA362</td><td>Spotted glycans</td></tr><tr><td>PAA-6SLNLN</td><td>Consortium for Functional Glycomics</td><td>PA343</td><td>Spotted Glycans</td></tr><tr><td></td><td>LNLN Consortium for Functional Glycomics</td><td>Te98</td><td>Spotted glycans</td></tr><tr><td>3SLNLN</td><td>Consortium for Functional Glycomics</td><td>Te175</td><td>Spotted glycans</td></tr><tr><td>6SLNLN</td><td>Consortium for Functional Glycomics</td><td>Te176</td><td>גליקנים מנומרים</td></tr><tr><td>צלחת מיקרוטיטר 384 באר</td><td>מטריקס TechCorp</td><td>4361</td><td>צלחת הדפסה</td></tr><tr><td>סמן מעבדה VWR</td><td></td><td>52877-150</td><td>מספור שקופיות</td></tr><tr><td>צלחת מכתים שקופיות Wheaton</td><td>Sigma</td><td>Z103969-1EA</td><td>חסימה וייבוש</td></tr></tbody></table>

assay microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של hemagglutinins וירוס שפעת a

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

שפעת וירוס (IAV) hemagglutinins להכיר חומצות sialic על פני התא קולטנים תפקודית כדי לזכות הכניסה לתאי. עופות מים ברים הם המאגר הטבעי של IAV, אבל IAV יכול לחצות את מחסום המינים כדי עופות, חזירים, סוסים ובני אדם. וירוסים העופות להכיר חומצה sialic מחוברת גלקטוז הלפני אחרון על ידי הצמדה α2-3 (קולטנים מסוג העופות) ואילו וירוסים האדם מעדיפים להכיר חומצה sialic עם הצמדה α2-6 (קולטנים מטיפוס אנושי). כדי לפקח אם וירוסים העופות מסתגלים קולטנים מסוג אדם, מספר שיטות שניתן להשתמש בהם. microarrays glycan עם ספריות מגוונות של sialosides הסינתטי משמש יותר ויותר להעריך סגוליות הקולטן. עם זאת, הטכניקה הזו לא נעשה שימוש למדידת avidities. מדידת הלהיטות בדרך כלל מושגת על ידי הערכת עקידת hemagglutinin בדילול סדרתי או וירוס גליקנים שנספחו 96-גם צלחות פוליפרופילן קונבנציונליות. ב assay זה, גליקנים עם α2-3 או α2-6 חומצות sialic הם מצמידים את ביוטין שנספחו צלחות streptavidin, או הם מצמידים את polyacrylamide (PAA) אשר לספוג ישירות פלסטיק. יש לנו מיניאטורי משמעותי assay זה על ידי הדפסה ישירות sialosides PAA צמודי עמיתיהם PAA הלא צמוד שלהם בשקופיות זכוכית מיקרו היטב. הגדרה זו, עם 48 מערכים בשקופית אחת, מאפשרת מבחני סימולטני של 6 glycan מחייב חלבונים ב -8 דילולים, חוקר 6 גליקנים שונים, כולל שני פקדים שאינם sialylated. זה שווה 18x 96-גם צלחות ב assay הצלחת המסורתית. פורמט המערך glycan פוחת צריכת תרכובות וביולוגיה ובכך משפר את יעילות.

הדפסה, סריקה &amp; Data מנתח כדי להבטיח הדפסה נכונה, זה חיוני כדי לקבל את היישור הנכון של הרשת הבחינה בתוך מסכת הטפלון, המתווה כל מערך בשקופית. במהלך ההדפסה, בשל האופי של ציפוי טפלון, כתמים שלא ניתן לראות בעין בלתי מזוינת בשקופיות MPX. תשומת לב מוקדשת ואז הופעת הכתמים מראש בשקופיות פולי- L- ליזין המצופות. מייד לאחר הדפסה, כל שקופית צריכה להיבדק על ...

באמצעות אסטרטגיית מיקרו-מערך גליקן מודפסת, מבחן צלחת קונבנציונאלי של 96 בארות ממוזער לניתוח של נגיף ההמגלוטינין של נגיף השפעת A והספציפיות לקולטנים המכילים חומצה סיאלית.

Assay Microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של Hemagglutinins וירוס שפעת A

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

המטרה הכללית של מערך הגליקנים הממוזער הזה היא לנתח את הספציפיות והאווידיות של המגלוטינין של נגיף השפעת A. בדיקה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע לקשירה לרצפטור ולאווידיות של נגיף השפעת A. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שבמסגרת בדיקה אחת ניתן לבחון הן את הספציפיות והן את אווידיות הקשירה היחסית, דבר שבדרך כלל לא ניתן להשיג במערכי גליקנים טיפוסיים או בבדיקות המבוססות על פלטות.פרוטוקול זה מתחיל בהכנת דגימות הגליקנים. התמיסה הבסיסית עבור הגליקנים היא באפר הדפסה (printing buffer) מלאי, שבעת הכנתו יש לתתר אותו באיטיות עד ל-pH של 8.5 ולאחר מכן להוסיף לו חומר פעיל שטח. באמצעות באפר ההדפסה שהוכן, יש לדלל את הגליקנים המצומדים ל-PAA לריכוז של 100 µg/mL.לאחר מכן, דללו את הגליקנים החד-ערכיים לריכוז של 100 micromolar גם כן בתוך תמיסת הבאפר להדפסה. לבסוף, הכינו תמיסות עבודה של הצבעים הפונקציונליים עם קבוצות אמין בריכוז של one micromolar. כעת, טענו ten microliters מכל דגימת גליקן לתוך באר של פלטת מיקרוטיטר בעלת 384 בארות.כמות זו של תמיסה מספיקה להדפסת חמש שקופיות. כמו כן, העבירו 10 µL של סמן הצבע לבאר אחת בלוח ההדפסה. הכינו את המערכים להדפסה על ידי מיקום פיני המערך וראש ההדפסה בהתאם לתוכנית הפריסה.במקרה זה, פין אחד יכול להדפיס את כל הדגימות. מערכי הגליקנים מודפסים בבלוקים של שישה, המוקפים בנקודה ריקה מכל הצדדים. יש להרכיב כפפות לטיפול בلامיות.הוצאו אותן מהאריזה ונפחו כל לכלוך מפניהן באמצעות גז חנקן בדרגת טהרה גבוהה במיוחד. לאחר מכן, הניחו את השקופיות כאשר הצד המצופה פונה כלפי מעלה על משטח המערך (arrayer stage). לאחר מכן, תכננו את מכשיר המערך.במקרה זה, הגדירו 27 נקודות לכל ביקור בלוחית המקור. שלוש נקודות מקדימות (pre spots), הממוקמות באזור שאינו חלק מהמערך על גבי שקף מצופה poly-L-lysine, משמשות להסרת עודפי נוזל מקצה הפין. 24 הנקודות האחרות לכל ביקור של פין משמשות להנחת שש נקודות בארבעה מערכים חוזרים.פירוט מלא מופיע בפרוטוקול הטקסט. כעת, טענו את הפלטות בעלות הבארות המרובות למדפסת והתחילו בהדפסת המערכים. במהלך ההדפסה, ודאו שהלחות נשמרת בין 55 ל-65%. שימו לב למראה הנקודות המקדימות (pre spots) על השקופיות המצופות ב-poly-L-lysine.לאחר ההדפסה, בצעו בדיקה ויזואלית של כל זכוכית. בדקו את הדיוק של מיקום הנקודות בתוך גבולות הטפלון, דבר שהוא חיוני, ובדקו אם מספר הנקודות המודפסות הוא נכון. כדי לסייע בהומוגניזציה של היצמדות הנקודות, הניחו את הזכוכיות המודפסות בתא עם 100% humidity כאשר הצד המודפס פונה כלפי מעלה מיד לאחר השלמת ההדפסה.השתמשו במגבונים נייר רטובים כדי לרפד מיכל ומעמד מאולתר. עטפו את התא בניילון כדי לכלוא את הלחות. לאחר חצי שעה, הוציאו את השקופיות.לאחר מכן, מספרו את העגיות באמצעות טוש עמיד בממסים ואחסנו אותן בכלי ייבוש (desiccation box) למשך לילה. למחרת, הכינו תמיסת מלאי רעננה של בופר חסימה (blocking buffer) תוך ערבוב נמרץ. התאימו את ה-pH ל-9.2 באמצעות נתרן הידרוקסיד מרוכז.לאחר מכן, הדגרו את השקופיות בבופר למשך שעה. כדי להסיר את החסימה, שטפו את השקופיות במים מזוקקים פעמיים. לאחר מכן, העבירו את השקופיות למחזיקי צביעה מזכוכית והכניסו את המחזיקים למחזיק פלטות מתנדנד כדי לייבש את השקופיות בסיבוב ב-10 G's למשך חמש דקות.לאחר הייבוש, במידת הצורך, יש לאחסן את השקופיות בטמפרטורה של 20- °C בשקיות פלסטיק אטומות. להכנה, צור תא לחות נוסף כפי שבוצע קודם לכן. כדי לזהות את הגליקנים המקובעים, הכן לקטינים ביוטיניליים מסוג SNA ו-ECA בריכוז של 10 µg/mL בבופר חדירה (probing buffer), והוסף 2 µg/mL של streptavidin 555 לכל דילול.לצביעה באמצעות ההמגלוטינינים, הכין תמיסה של 20 microgram per milliliter של נוגדן קומפלקס-מוקדם בבופר חסימה ביחס מולרי של ארבעה-לשניים-לאחד כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. העבר 20 microliters מהתמיסות שהוכנו לבארות של פלטת 384-well. לאחר מכן, בצע דילול סדרתי של הלקטינים וההמגלוטינינים ביחס של אחד-לאחד בבופרים המתאימים להם.הכינו שמונה דילולות, על ידי מילוי של כל באער ב-10 µL מדגימה וב-10 µL מבופר. כעת, דגרו את הפלטה על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 8 µL מכל דילול לאחד מ-48 המיקרובאערים שעל שקופית מודפסת.לאחר מכן, הדגרו את השקופית שהוכנה בתא הלחות למשך 90 דקות. לאחר 90 דקות, שטפו את השקופית תוך כדי החזקתה מקצה השקופית; טבלו אותה ב-PBS-T ארבע פעמים, לאחר מכן טבלו אותה ב-PBS ארבע פעמים ולבסוף, טבלו אותה במים דה-יוניים ארבע פעמים. כעת, ייבשו את השקופית באמצעות סבב (spin-dry) כפי שבוצע קודם לכן.לאחר ייבוש בצנטריפוגה, סרקו מיד את הפיתה. ודאו שאתם טוענים את הפיתה לסורק בזהירות ובכיוון הנכון. השתמשו בהספק לייזר נמוך של 5 mW לסריקה חוזרת של הפיתות, תוך הגדלה הדרגתית של ה-gain מ-25% ל-75%. בעת אופטימיזציה של הגדרות הסריקה, זכרו כי הפלואורופורים יעברו דהייה (bleaching) כתוצאה מסריקות חוזרות.נתחו את התמונה השמורה כדי לאתר אותות קישור באמצעות התוכנה הרלוונטית. ניתן לטעון רשימת מערך (array list) הכוללת את תבנית הפיסור (spotting pattern). הניחו אותה כשכבה מעל הסריקה כדי לסייע בניווט במיקומי סימני הרשת.לאחר מכן, השתמש בתוכנה כדי לנתח את עוצמות הנקודות ושמור את התוצאות כקובץ טקסט עם מפרידי טאב (tab delimited) לייצוא לגיליון אלקטרוני או לחבילה סטטיסטית אחרת. נתח את הנתונים על ידי חישוב עוצמת האות הממוצעת פחות הרקע. חשב ממוצע של ארבע מתוך שש נקודות החזרים לכל דגימה, תוך השמטת האות הגבוה ביותר והאות הנמוך ביותר.לאחר מכן, צור גרף קווי של ממוצע האות פחות הרקע אל מול שמונת ריכוזי החלבון. החלק את הקו שהתקבל באמצעות רגרסיה לא ליניארית. מערך ה-PAA שימש להערכת ספציפיות הקישור של קולטנים להמאגלוטינינים של נגיף השפעת A.המערך כלל בקרות שאינן סיאליליות באותן מיקרו-בארים. לקטינים מצמחים בעלי ספציפיות ידועה לתרכובות המודפסות שימשו כבקרות חיוביות. לקטין ECA נקשר לגלקטוז טרמינלי בקישור beta 1-4 ל-N-acetylglucosamine, ולא נקשר לאותה תרכובת אם הגלקטוז הטרמינלי היה חסום על ידי חומצה סיאלית.כדי לבחון חומצה סיאלית מקושרת בקישור alpha 2-6, נעשה שימוש בלקטין SNA. כצפוי, SNA נקשר רק לחומצות סיאליות מקושרות בקישור alpha 2-6, אך עם הבדלים בולטים באפinity עבור חזרות של dye lacNAc מקושרות ל-PAA לעומת כאלה שאינן מקושרות ל-PAA. לאחר מכן, נבחן H5 hemagglutinin המופק מנגיף Vietnam/1203/04, המזהה אך ורק חומצות סיאליות מקושרות בקישור alpha 2-3.פרופיל הקישור של ההמאגלוטינין H5 הראה את הספציפיות הצפויה, עם אבדיות גבוהה יותר למבנים מקושרים ב-PAA. לבסוף, נבדק ההמאגלוטינין H1 מזן H1N1 עונתי אנושי. כצפוי, המאגלוטינין זה נקשר רק למבנים המכילים חומצה סיאלית המקושרת ב-alpha 2-6.לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן יהיה לחשוף את ספציפיות הקישור ואת האווידיות היחסית של נגיפי שפעת במסגרת בדיקה אחת. טכניקה זו תשפר משמעותית את היעילות של בדיקות קישור לשפעת, וכן תפחית את הצריכה של חומרים ביולוגיים יקרי ערך.

a-miniaturized-glycan-microarray-assay-for-assessing-avidity

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטה פשוטה כתם חריץ פותחה עבור כימות של hemagglutinin שפעת ויראלי neuraminidase באמצעות נוגדנים אוניברסלי מיקוד רצפים שימור ביותר שלהם מזוהה באמצעות ניתוחים ביואינפורמטיקה. גישה חדשנית זו עשויה לספק חלופה שימושי להגדרה כמותית של hemagglutinin כל נגיפיים neuraminidase.

ניתוח כמותי של השפעת כל סוג Hemagglutinins ויראלי ו Neuraminidases באמצעות נוגדנים יוניברסל מבחני כתם פשוט חריץ

שיטה זו מתארת ​​את השימוש במערכת הדמיה צבע אינפרא אדום מבוסס על זיהוי של H1N1 בנוזל bronchioalveolar (BAL) שטיפה של עכברים נגועים על רגישות גבוהה. מתודולוגיה זו ניתן לבצע 96 - או 384 גם צלחת, דורש &lt;10 נפח μl של חומר הבדיקה יש פוטנציאל הקרנה בו זמנית של פתוגנים רבים.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

בסרטון זה אנו מדגימים את התהליך לאיתור איזוטיפים של נוגדנים במספר דגימות נסיוב אנושי באמצעות שקופית microarray המודפסת עם תת-סוגים אנטיגניים של זני נגיפי שפעת.

בדיקת מיקרו-מערך אנטיגן נגיפי לאיתור איזוטיפים של נוגדנים בסרום נגד אנטיגן נגיפי

הסרטון מדגים בדיקת עיכוב hemagglutination לאיתור נוגדנים בסרום כנגד אנטיגנים ספציפיים. אישור של עיכוב המגלוטיציה בבאר הבדיקה והמגלוטינציה בבאר הבקרה מושג באמצעות דפוסים חזותיים ברורים. בדיקה זו ממלאת תפקיד מכריע בהערכת התגובה החיסונית, יעילות החיסון וחקר זיהומים נגיפיים בווירולוגיה ובאימונולוגיה.

בדיקת עיכוב Hemagglutination לאיתור נוגדנים בסרום כנגד אנטיגן מטרה

הסרטון מדגים בדיקה לכימות נגיפי שפעת A ו-B. בדיקה זו משתמשת בהגברה של אנדונוקלאז עם פריימרים ספציפיים לשפעת וזיהוי מטרות באמצעות בדיקות משואות מולקולריות.

בדיקה מבוססת מולקולרית לכימות נגיפי שפעת A ו-B

סרטון זה מדגים בדיקה המודדת שפעת נוירמינידז (NA) המעכבת טיטרים נוגדנים בדגימת סרום. דגימת סרום המכילה נוגדנים נגד NA מתווספת לצלחת מיקרווול מצופה פטואין. עם הוספת הנגיף, הנוגדנים מונעים מ-NA נגיפי לנתק את הפטואין ולחשוף את הגלקטוז שלו. לאחר מכן מוסיפים לקטין מצומד פרוקסידז, שנקשר לגלקטוז החשוף. טיטר נוגדנים מעכבי NA נקבע באמצעות בדיקה קולורימטרית, שבה מצע פרוקסידאז נבקע על ידי פרוקסידאז מצומד לקטין משותק כדי לייצר צבע.

בדיקה למדידת נוגדנים מעכבי שפעת Neuraminidase Inhibition Titers

אנו מתארים את בדיקת הלקטין המקושרת לאנזים (ELLA) למדידת טיטר נוגדנים לעיכוב שפעת נויראמינידאז (NA) ב-sera. הבדיקה משתמשת באגלוטינין בוטנים כדי לכמת שאריות גלקטוז שהופכות לנגישות כאשר NA מסיר חומצה סיאלית מצלחות מצופות פטואין, 96 בארות.

מדידת טיטר נוגדנים עיכוב Neuraminidase שפעת ידי enzyme-linked Assay לקטינים

מחקר זה מתאר   מבוססי הדמיה assay מיקרו-נטרול לנתח את היחסים בין אנטיגני וירוסים. פרוטוקול מעסיקה וסורק ויש לו ארבעה שלבים, כולל טיטרציה, quantitation טיטרציה, נטרול, ו quantitation הניטרול. את assay עובד היטב עם שפעת A במחזור הנוכחי (H1N1) pdm09, A (H3N2), ווירוסים B.

אופטימיזציה של Assay כמותי מיקרו-נטרול

הפרוטוקולים הציג מתארים כיצד לבצע וזמינותו עיכוב hemagglutination לכמת נוגדן ספציפי שפעת titers מן הדוגמאות סרום מקבלי החיסון נגד שפעת. הבדיקה הראשונה קובע ריכוזים מיטביים אנטיגן ויראלי על-ידי hemagglutination. הבדיקה השניה מכמתת נוגדן ספציפי שפעת titers על ידי עיכוב hemagglutination.

Assay עיכוב (איץ ' אי) Hemagglutination אופטימיזציה לכמת נוגדן ספציפי שפעת Titers

אנו מתארים שיטה כדי למדוד ההפעלה של פונקציות אפקטור Fc בתיווך על ידי נוגדנים את המטרה hemagglutinin וירוס שפעת. ניתן גם להתאים assay הזה כדי להעריך את היכולת של נוגדנים חד-שבטיים או polyclonal סרה מיקוד אחרים glycoproteins משטח ויראלי לזירוז חסינות בתיווך Fc.

שיטה להערכת פונקציות אפקטור בתיווך Fc המושרה על ידי שפעת Hemagglutinin נוגדנים ספציפיים

אנו מציגים פרוטוקול לשימוש מיקרוarray חלבון שנבנה על ידי הדפסת אנטיגנים שפעת על ניטרוצלולוזה מצופה שקופיות בו סרום בדיקה עבור נוגדנים מרובים isotypes נגד מעל 250 אנטיגנים מפני זנים וירוסים שונים, ובכך המאפשר מדידה של רוחב של נוגדנים סרום ברחבי תת וירוס.

שימוש של מיקרוarray אנטיגן שפעת כדי למדוד את היקף של נוגדנים סרום ברחבי תת וירוס

למדו להעריך את הספציפיות והלהיטות של Hemagglutinins של וירוס שפעת A באמצעות מערך glycan מיניאטורי. שיטה זו מאפשרת ניתוח מקיף של קישור קולטנים בנפח קטן וביעילות גבוהה יותר.

Assay Microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של Hemagglutinins וירוס שפעת A

גלה סרטונים נוספים