Name: קציר סלקטיבי של לויקוציטים Marginating-ריאתי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: למדו שיטת פרפוזיה כפויה לקציר סלקטיבי של לויקוציטים Marginating-ריאתי בעכברים וחולדות. טכניקה זו מאפשרת חקר אוכלוסיית תאים ייחודית עם תפקודים אימונולוגיים מובחנים בריאות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים ועבודה זו נתמכו # מענק NIH / NCI R01CA172138 (כדי SBE).

הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) באוניברסיטת תל-אביב. 1. עכברוש פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכשירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסדרים 2 פרפר 21 מחטים G. לחלופין, להכין 2 מחטים בוטות פיפיות פרפר 21 G על ידי הגשת הקצה החד של המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר כלים כירורגיים: 2 זוגות מספריים, מלקחיים קהי פיפיות, hemostat, מלקחי שן-רקמות מעוקרות ידי חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפחות על כוח משיכת הגדרה (יבשה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן heparinized PBS (30 יחידות / מ&quot;ל) על ידי הוספת 30 יחידות של הפרין לכל מ&quot;ל של בופר פוספט פתרון (1x PBS). השתמש ב RT. 35 מיליליטר הוא הנפח המינימאלי הדרוש לכל בעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזרים heparinized PBS לתוך קווי משאבת peristaltic ואת מחטי הפרפר כדי למנוע בועות אוויר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זלוף של הריאות והגבייה-לויקוציטים MP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדימו ממנת יתר של isoflurane 8%. אשר המתת חסד על ידי הפסקת נשימה ניטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפסקת נשימה, לפתוח לאלתר את החללים הצפק ובחזה באמצעות מספרי סטרילית מלקחי שן-רקמה. לבצע חתך בבטן קו האמצע לאורך הבטן עד לתהליך xiphoid. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את החזה באמצעות המלקחיים, חיתוך כלוב צלעות בזהירות משני הצדדים, ללא ניקוב כל איבר פנימי או כלי דם גדולים. קלאמפ hemostat על עצם החזה, rostrally לקפל את בית החזה כדי לחשוף את מורכבות לב-ריאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחט פרפר לתוך החדר ימני של הלב, ובתוך כ דק לאסוף את הנפח המקסימאלי של דם לתוך מזרק (~ 6 מיליליטר מבעל חי 250 גרם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את הווריד הנבוב עם hemostat להימנע זלוף לאחור של הכבד (ראה דיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את מחט פרפר בתוך החדר הימני תוך החלפת מזרק המכיל את הדם עם צינור יצוא של pמשאבת eristaltic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחט פרפר שני מחובר מזרק קציר 5 מ&quot;ל לתוך החדר השמאלי, הימנעות חדירה של מחיצת האף interventricular. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה peristaltic במהירות של כ 5 מ&quot;ל / דקה בעדינות לאסוף לתוך המזרק מיליליטר הראשון של perfusate כי הם מזוהמים עם דם. המשך עד שהצבע perfusate פונה מכהה אדום חיוור. (מחק את perfuste דם מזוהם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללא הפסקת המשאבה peristaltic, במהירות להחליף את המזרק קציר 5 מ&quot;ל עם מזרק קציר 20 מ&quot;ל ולאסוף 20 מ&quot;ל של perfusate ריאות העסקת מהירות גבוהה יותר של זלוף (עד 7 mL / min). לפקח באופן רציף את זרימת perfusate לתוך מזרק האיסוף, תוך הימנעות היווצרות ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפסיק את הזרימה של המשאבה peristaltic. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקה לויקוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה perfusate במשך 10 דקות ב g 400 ×. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">הוסף 10 מ&quot;ל PBS או בינוני, צנטריפוגות ב 400 XG במשך 10 דקות, לשאוב את הנוזל. חזור על פעולה זו פעמיים. שימוש PBS או בינוני תלוי בשימוש הסוגר של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 מ&quot;ל PBS או בינוני, צנטריפוגות ב 400 XG במשך 10 דקות, לשאוב את הנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש את התאים לריכוז הרצוי, מבוסס על השימוש במדגם (FACS, PCR, וכו &#39;). </li></ol></li></ol> 2. עכבר פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכשירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסדרים 2 פרפר 25 מחטים G. לחלופין, להכין 2 מחטים בוטות פיפיות פרפר 25 G על ידי הגשת הקצה החד של המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר כלים כירורגיים: 2 זוגות מספריים, מלקחיים קהי פיפיות, hemostat, מלקחי שן-רקמות מעוקרות ידי חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפחות על כוח משיכת הגדרה (יבשה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן heparinized PBS (30 יחידות / מ&quot;ל) על ידי הוספת 30 יחידות של הפרין לכל מ&quot;ל של תמיסת 1x PBS. השתמש ב RT. 25 מיליליטר הוא הנפח המינימאלי הדרוש לכל בעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> streאני heparinized PBS לתוך קווי משאבת peristaltic ואת מחטי הפרפר כדי למנוע בועות אוויר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זלוף של הריאות והגבייה-לויקוציטים MP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדימו ממנת יתר של isoflurane 8%. אשר המתת חסד על ידי הפסקת נשימה ניטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפסקת נשימה, לפתוח לאלתר את החללים הצפק ובחזה באמצעות מספרי סטרילית מלקחי שן-רקמה. לבצע חתך בבטן קו האמצע לאורך הבטן עד לתהליך xiphoid. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את החזה באמצעות המלקחיים, חיתוך כלוב צלעות בזהירות משני הצדדים, ללא ניקוב כל איבר פנימי או כלי דם גדולים. קלאמפ hemostat על עצם החזה, rostrally לקפל את בית החזה כדי לחשוף את מורכבות לב-ריאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את הווריד הנבוב עם hemostat להימנע זלוף לאחור של הכבד (ראה דיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחט פרפר המחובר לצינור היצוא של משאבת peristaltic לתוך ven התקיןtricle של הלב, וכן מחט פרפר שני מחובר מזרק קציר 2 מ&quot;ל לתוך החדר השמאלי של הלב, avoidingpenetration של מחיצת האף interventricular. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה למהירות של כ 2 מ&quot;ל / דקה לאסוף את מיליליטר הראשון של perfusate דם מזוהמים לתוך המזרק קציר עד perfusate פונה מכהה אדום חיוור (מחק את perfuste דם מזוהם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללא הפסקת המשאבה peristaltic, במהירות להחליף את המזרק קציר 2 מ&quot;ל עם מזרק קציר 10 מ&quot;ל ולאסוף 10 מ&quot;ל של perfusate ריאות העסקת מהירות גבוהה יותר של זלוף (עד 4 מ&quot;ל / דק &#39;). לפקח באופן רציף את זרימת perfusate לתוך מזרק האיסוף, תוך הימנעות היווצרות ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפסיק את הזרימה של המשאבה peristaltic. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקה לויקוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה perfusate במשך 10 דקות ב g 400 ×. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל PBS או בינוני, צנטריפוגות ב 400XG במשך 10 דקות, לשאוב את הנוזל. חזור על פעולה זו שלוש פעמים. שימוש PBS או בינוני תלוי בשימוש הסוגר של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל PBS או בינוני, צנטריפוגות ב 400 XG במשך 10 דקות, לשאוב את הנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש את התאים לריכוז הרצוי, מבוסס על השימוש במדגם (FACS, PCR, וכו &#39;). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kuebler, W. M., Goetz, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginated+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">The marginated pool.</a> Eur Surg Res. 34, 92-100 (2002).</li>
<li>Benish, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+mice+exhibits+increased+NK+cytotoxicity+and+unique+cellular+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics.</a> Immunol Res. 58, 28-39 (2014).</li>
<li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+rats%3A+characteristics+of+continuous+inflammation+and+activated+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells.</a> J Immunother. 33, 16-29 (2010).</li>
<li>Shakhar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+operation-induced+suppression+of+marginating+pulmonary+NK+activity+using+poly+IC%3A+a+potential+approach+to+reduce+postoperative+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Amelioration of operation-induced suppression of marginating pulmonary NK activity using poly IC: a potential approach to reduce postoperative metastasis.</a> Ann Surg Oncol. 14, 841-852 (2007).</li>
<li>Smyth, M. J., Godfrey, D. I., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fresh+look+at+tumor+immunosurveillance+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy.</a> Nat Immunol. 2, 293-299 (2001).</li>
<li>Talmadge, J. E., Meyers, K. M., Prieur, D. J., Starkey, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+NK+cells+in+tumour+growth+and+metastasis+in+beige+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of NK cells in tumour growth and metastasis in beige mice.</a> Nature. 284, 622-624 (1980).</li>
<li>Grimm, E. A., Mazumder, A., Zhang, H. Z., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphokine-activated+killer+cell+phenomenon.+Lysis+of+natural+killer-resistant+fresh+solid+tumor+cells+by+interleukin+2-activated+autologous+human+peripheral+blood+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lymphokine-activated killer cell phenomenon. Lysis of natural killer-resistant fresh solid tumor cells by interleukin 2-activated autologous human peripheral blood lymphocytes.</a> J Exp Med. 155, 1823-1841 (1982).</li>
<li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marginating+pulmonary-NK+activity+and+resistance+to+experimental+tumor+metastasis%3A+suppression+by+surgery+and+the+prophylactic+use+of+a+beta-adrenergic+antagonist+and+a+prostaglandin+synthesis+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Marginating pulmonary-NK activity and resistance to experimental tumor metastasis: suppression by surgery and the prophylactic use of a beta-adrenergic antagonist and a prostaglandin synthesis inhibitor.</a> Brain Behav Immun. 19, 114-126 (2005).</li>
<li>O'Dea, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung-marginated+monocytes+modulate+pulmonary+microvascular+injury+during+early+endotoxemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Lung-marginated monocytes modulate pulmonary microvascular injury during early endotoxemia.</a> Am J Respir Crit Care Med. 172, 1119-1127 (2005).</li>
<li>Sorski, L., Melamed, R., Ben-Eliyahu, A unique role for marginating-pulmonary and marginating-hepatic NK cells in cancer anti-metastatic surveillance and in immunotherapy. Annual Meeting of the Psychoneuroimmunology Research Society, Philadelphia, USA.(2014, , (2014).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+stress+disrupts+immunostimulatory+effects+of+IL-12%29%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Continuous stress disrupts immunostimulatory effects of IL-12).</a> Brain Behav Immun. 25, 727-735 (2011).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

השיטה המוצגת כאן מאפשרת קצירת סלקטיבית ולומדים של האוכלוסייה הייחודית של לויקוציטים MP. לעומת מחזורי או לויקוציטים טחול, אוכלוסיית MP מאופיינת רכב מובהק של תת-אוכלוסיות לויקוציטים, רמות הפעלה גבוהות, שחרור גבוה של ציטוקינים שונים, ורמות גבוהות יותר של mRNA תומך ציטוקינים אנטי דלקתי 2,3. באופן ספציפי, אנחנו הראינו כי תאי MP-NK הם יותר ציטוטוקסיות מאשר תאי NK דם נגד תאי יעד שונים 3,4, ולהביע רמות גבוהות יותר של-γ אינטרפרון. בסך הכל, התוצאות שלנו מראות כי לויקוצ...

לויקוציטים דבקים בנימי הריאות (כלומר, marginating-ריאתי (MP) לויקוציטים) 1 הוצג להציג רכב לויקוציטים ברור פעילות ייחודית לעומת לויקוציטים מ תאים חיסוניים אחרים (למשל, מחזור, טחול, מח עצם) 2- 4. לדוגמה, MP-לויקוציטים התערוכה גבוה הרג טבעיים (NK) cytotoxicity התאים מפני תאים סרטניים שונים, לעומת מחזורי הטחול תאי NK, כמו גם RNA שליח הבדיל (mRNA) רמות הפרשה מוגברת של ציטוקינים פרו ואנטי דלקתיים. הרכב של תאים הוא מובחן גם לויקוציטים במחזור כמו שיש MP-לויקוציטים יחס גבוה יותר של חסינות אדפטיבית / מולד לעומת לויקוציטים במחזור (50% לעומת 30%, בהתאמה). מטרת השיטה המוצגת כאן היא לאפשר קצירת סלקטיבית של MP-לויקוציטים, כדי ללמוד תא החיסון חשוב וייחודי זה (אוכלוסיית תאים), וכדי elucidate השפעת מניפולציות שונות (למשל, הפעלה חיסונית) על תאים ספציפיים אלה. כדי להבין את המשמעות של אוכלוסייה ייחודית זו, חשוב לציין כי מערכת החיסון יכולה לשלוט במחזור תאים סרטניים, micrometastases, ומחלות שיורית באמצעות פונקציות vivo של חסינות בתיווך התא (CMI). יכולת זו באה לידי ביטוי למרות כישלון התקדים של מערכת החיסון על מנת לשלוט בגידול הראשוני, ונתמך על ידי מספיק ראיות vivo בחולי סרטן ומודלים של בעלי חי 5. חשוב לציין, הממצאים הללו הם לעתים קרובות עולה בקנה אחד עם במבחנה במחקרים vivo לשעבר, אשר מדווחים כי רוב תאי הגידול עצמיים עמידים cytotoxicity ידי מחזורי לויקוציטים בדגימות דם מבני אדם ובעלי חיים (נמדד על ידי מבחני רעילות) 6,7. אי התאמה זו ניתן לייחס לקיומה in vivo של אוכלוסיות לויקוציטים שונות, כגון שצויןאוכלוסייה לויקוציטים MP נזכרת, ו-האוכלוסייה שלה במיוחד של תאי NK מופעלים 3. ואכן, תאים סרטניים syngeneic (MADB106), אשר נמצאו להיות עמיד במחזור לויקוציטים טחול, הוצגו להיות lysed ידי תאי MP-NK 3,8. לפיכך, התאים MADB106 &#39;NK עמיד&#39; לכאורה כי גרורות לריאות של fischer344 (F344) חולדות נשלטים על ידי תאים MP-NK, אבל לא על ידי מחזורי או תאי NK הטחול, אשר בדרך כלל נלמדים נתון קלות הגישה שלהם. מטוהרים פעילים MP-לויקוציטים אינם נגישים באמצעות שיטות קציר רמה לויקוציטים מהריאות, אשר מבוססות על שחיקה רקמת ריאה או 9 שפלה ביולוגית. הגישה שלנו כוללת שני יתרונות מרכזיים לעומת גישות עיבוד רקמות. ראשית, גישת זלוף סלקטיבי יבול MP-לויקוציטים, תוך הפרדה תאים אחרים שמקורן parenchymal ריאות, ביניים, ו compar broncho-מכתשיםtments. שנית, טכניקת זלוף טוב יותר שומרת על השלמות ובין ההוויה הפיזיולוגית של לויקוציטים MP, בניגוד שחיקה והעיבוד ביולוגי גישות הפוגעים בתאים, לשנות המורפולוגיה שלהם, ולגרום לייצור ושחרור של גורמים שונים כי לווסת את הפעילות חיסונית במיוחד לדכא NK cytotoxicity 10. הריאות הן איבר יעד מרכזי עבור גרורות סרטן ועבור מחלות זיהומיות שונות. כל התאים הממאירים במחזור התאים נגועים לעבור דרך נימי הריאות, בה הם צריכים לעוות ולתקשר עם תאי אנדותל נימים לויקוציטים תושב. בתנאים אלה, תאים במחזור יכולים להיות ממוקדים בקלות על ידי-לויקוציטים MP תושב. נראה, אם כן ביולוג יתרון יש לויקוציטים מופעלים בתא החיסון הזה, וזה חשוב ללמוד אוכלוסייה-MP הייחודית זאת בהגדרות ביולוגיות, ניסיוני, וקליניים שונים. ראוי לציין כי סאיההפעלה החיסונית stemic ידי-מכפילי ביולוגי-תגובה שונות (למשל, חומצה polyinosinic-polycytidylic (פולי לי: C) או מסוג C CPG oligodeoxynucleotides (CPG-C ODN)) הוכחו להפעיל MP-לויקוציטים יותר לויקוציטים במחזור 3, 8,11.

<table><tbody><tr>משאבה <td></td><td></td><td></td><td>פריסטלטית אוטוקלוד</td></tr><tr><td>מחט פרפר</td><td>OMG</td><td></td><td>26 גרם</td></tr><tr><td>מחט פרפר</td><td>OMG</td><td></td><td>21 גרם * 3/4 אינץ'</td></tr> <tr><td>תמיסת</td><td></td><td>מזרק תמונה</td><td>1 מ"ל</td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td><td>מזרק</td> תמונה <td>2.5 מ"ל</td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td><td>מזרק</td><td>פיק 5 מ"ל</td></tr><tr><td>מזרק</td><td>תמיסת</td><td></td> פיק <td>10 מ"ל</td></tr><tr><td>מזרק</td><td>תמיסת</td><td></td> פיק <td>25 מ"ל</td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td></td><td></td><td></td>קהים שוליים</tr><tr><td>מספריים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>המוסטט</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td></td><td></td><td></td>רקמות</tr><tr><td>הפרין נתרן חזיר רירית (ללא חומרים משמרים)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

קציר סלקטיבי של לויקוציטים marginating-ריאתי

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

לויקוציטים שוליים-ריאתיים (MP) הם לויקוציטים הנצמדים לאנדותל הפנימי של נימי הריאה. הוכח כי לויקוציטים MP מציגים הרכב ומאפיינים ייחודיים בהשוואה ללויקוציטים של תאים חיסוניים אחרים. עדויות מצביעות על ציטוטוקסיות גבוהה יותר של תאי הרג טבעיים, ופרופיל פרו-דלקתי מובהק של אוכלוסיית MP-לויקוציטים בהשוואה לאימונוציטים במחזור או טחול. השיטה המוצגת כאן מאפשרת קציר סלקטיבי של לויקוציטים MP על ידי זלוף מאולץ של הריאות בעכברים או בחולדות. בניגוד לשיטות אחרות המשמשות למיצוי לויקוציטים ריאתיים, כגון טחינת רקמות ופירוק ביולוגי, שיטה זו מניבה אך ורק לויקוציטים מנימי הריאה, שאינם מזוהמים בתאים פרנכימליים, אינטרסטיציאליים וברונכו-מכתשית. בנוסף, טכניקת הזלוף שומרת טוב יותר על השלמות והסביבה הפיזיולוגית של לויקוציטים MP, מבלי לגרום לתגובות פיזיולוגיות עקב עיבוד רקמות. אוכלוסיית לויקוציטים MP ייחודית זו ממוקמת אסטרטגית כדי לזהות ולהגיב לתאים חריגים במחזור הדם, שכן כל התאים הממאירים במחזור והתאים הנגועים נעצרים בזמן שהם עוברים דרך נימי הריאה, ומקיימים אינטראקציה פיזית עם תאי אנדותל ולויקוציטים תושבים. לפיכך, קציר סלקטיבי של לויקוציטים MP ומחקרם בתנאים שונים עשויים לקדם את הבנתנו את המשמעות הביולוגית והקלינית שלהם, במיוחד ביחס לשליטה בתאים חריגים במחזור הדם ומחלות הקשורות לריאות.

תערוכת MP-תא קומפוזיצית משנה לויקוציטים שונה לעומת מחזורים לויקוציטים. באמצעות ניתוח תזרים cytometry, תת-אוכלוסיות לויקוציטים זוהו לכמת ולאפיין את הרכב של שני מחזורי לויקוציטים MP. גרנולוציטים ו לימפוציטים זוהו מבוסס על מחליקי קדימה והצד. בתוך לימפוציטים, NKRP-1 תאים בהירים זוהו תאי NK, CD3 + כתאי T, RM1 + כמו מונוציטים, ו CD4 + / CD8 + / CD25 + שימשו לזיהוי תת-אוכלוסיות של תאי T. im...

לויקוציטים ריאתיים-שוליים מציגים מאפיינים ייחודיים ותפקודים אימונולוגיים מובהקים בהשוואה לאוכלוסיות לויקוציטים אחרות. כאן אנו מתארים קציר סלקטיבי של תת-אוכלוסייה זו של לויקוציטים ריאתיים, על ידי זלוף מאולץ של הריאות בחולדות ועכברים. נראה כי לויקוציטים ריאתיים שוליים הם קריטיים בקביעת הרגישות למחלות המועברות בדם ולמחלות הקשורות לריאות.

קציר סלקטיבי של לויקוציטים Marginating-ריאתי

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבצע פרפוזיה מאולצת של ריאות עכבר או חולדה לצורך בידוד סלקטיבי של לוקוציטים ריאתיים נצמדים (marginating-pulmonary leukocytes), הנצמדים לאנדותל הפנימי של נימי הריאה. שיטה זו מאפשרת את חקר אוכלוסיית הלוקוציטים הספציפית הזו, המציגה מאפיינים ייחודיים ותפקודים המטולוגיים מובחנים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מניבה לוקוציטים אך ורק מנימי הריאה, תוך החרגת תאים מהמדורים הפארנכימליים, הבינ-רקמתיים והברונכ׳אוולאולריים.ליאת סורסקי ולי ששוע, שני סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי, ידגימו את הפרוצדורה הזו. לפני תחילת הפרוצדורה, הזרים PBS עם הפרין דרך קווי משאבת הפריסטלטיקה ומחטי הפרפר כדי להסיר בועות אוויר. לאחר מכן, מיד עם הפסקת הנשימה, השתמש במספריים סטריליים ובפינצטה לרקמות רכות כדי לפתוח את חלל הפריטונאום וחלל החזה של החולדה שהורדמה, על ידי ביצוע חתך בקו האמצע של הבטן עד לתהליך החרב (xiphoid process).בשלב הבא, השתמשו בפינצטה כדי להרים את עצם החזה וגזרו בזהירות את כלוב הצלעות משני הצדדים. הדקו תפס כירורגי (hemostat) על עצם החזה וקפלו את כלוב הצלעות לכיוון הראש (rostrally) כדי לחשוף את המכלול הלב-ריאתי. לאחר מכן, הכניסו מחט פרפר לתוך החדר הימני של הלב ואספו את כמות הדם המרבית.כאשר כל הדם נאסף, סגרו את הונה קאבה (vena cava) באמצעות המוסטט כדי למנוע פרפוזיה לאחור של הכבד. לאחר מכן, תוך החזקת מחט הפרפר בתוך החדר הימני, החליפו את מזרק הדם בצינור היציאה של משאבת הפריסטלטיקה והחדירו מחט פרפר שנייה, המחוברת למזרק איסוף של 5 ml, אל החדר השמאלי. כעת הפעילו את משאבת הפריסטלטיקה במהירות של כ-5 ml לדקה ואספו בעדינות את המיליליטרים הראשונים של הדם המזוהם בתמיסת הפרפוזיה אל מזרק האיסוף, עד שתמיסת הפרפוזיה משנה את גוון הצבע מאדום כהה לאדום בהיר.לאחר מכן, ללא הפסקת פעולת המשאבה, החליפו במהירות את מזרק האיסוף של 5 מיליליטר במזרק איסוף של 20 מיליליטר ואספו 20 מיליליטר של נוזל פרפוזיה של הריאה כדי לבודד את הלוקוציטים ריאתיים-שוליים של החולדה, בקצב של 7 מיליליטר לדקה. שימו לב לשינוי הגוון ההדרגתי של הריאות מאדום חיוור ללבן צלול, המעיד על פרפוזיה מוצלחת. כאשר כל נפח נוזל הפרפוזיה נאסף, הפסיקו את זרימת משאבת הפריסטלטיקה והעבירו את נוזל הפרפוזיה שנאסף למבחנה.לאחר מכן, סבב את הפרפוזאט בצנטריפוגה ושאב את הסופרנאטנט. העבר PBS עם הפרין דרך קווי משאבת הפריסטלטיקה ומחטי הפרפר כדי להסיר בועות אוויר. כדי לאסוף לוקוציטים ריאתיים שוליים (marginating-pulmonary leukocytes) של עכבר, מיד עם הפסקת הנשימה, השתמש במספריים סטריליים ובפינצטה לרקמות כדי לפתוח את חלל הפריטונאום ואת חלל החזה על ידי ביצוע חתך בקו האמצע הבטני עד לתהליך החרב (xiphoid process).בשלב הבא, השתמשו בפינצטה כדי להרים את עצם החזה וחתכו את כלוב הצלעות משני הצדדים. הצמידו תפס כירורגי (hemostat) לעצם החזה וקפלו את כלוב הצלעות לכיוון הראש (rostrally) כדי לחשוף את המערכת הלבבית-ריאתית. הצמידו את הווריד הנבוב (vena cava) באמצעות תפס כירורגי כדי למנוע פרפוזיה לאחור של הכבד, והחדירו את מחט הפרפר לחדר הימני של הלב.לאחר מכן, כאשר מחט הפרפר נמצאת בתוך החדר הימני, חבר את מחט הפרפר לצינור היציאה של המשאבה הפריסטלטית והחדר מחט פרפר שנייה, המחוברת למזרק איסוף של 2 ml, לתוך החדר השמאלי. הפעל את המשאבה למהירות של כ-2 ml לדקה. אסוף בעדינות את המיליליטר הראשון של הדם המזוהם בנוזל פרפוזיה אל מזרק האיסוף, עד שצבע נוזל הפרפוזיה משתנה מאדום כהה לאדום בהיר.לאחר מכן, מבלי להפסיק את פעולת משאבת הפריסטלטיקה, החליפו במהירות את מזרק האיסוף של 2 ml במזרק איסוף של 10 ml ואספו 10 ml של נוזל פרפוזיה מהריאות בקצב פרפוזיה של 4 ml לדקה. שימו לב לשינוי ההדרגתי בגוון הריאות מאדום חיוור ללבן צח, המעיד על פרפוזיה מוצלחת. כאשר כל נוזל הפרפוזיה נאסף, הפסיקו את זרימת משאבת הפריסטלטיקה והעבירו את נוזל הפרפוזיה שנאסף למבחנה.לאחר מכן, סבב את הפרפוזאט בצנטריפוגה ושאב את העלייה. מדגם התאים השוליים בריאות (marginating-pulmonary compartment) הרכב תתי-אוכלוסיות של לוקוציטים השונה מזו שנצפית בלוקוציטים במחזור הדם. למעשה, אימונוציטים מולדים, כולל גרנולוציטים, מונוציטים ותאי NK, מהווים למעלה מ-50% מאוכלוסיית הלוקוציטים השוליים בריאות.בהשוואה לפחות מ-30% ממדור התאים במחזור הדם. לעומת זאת, אוכלוסיות תאי T ותאי דנדריטיות נמצאות באחוזים נמוכים יותר במדור הריאתי-שולי בהשוואה לתאים במחזור הדם. אחוז גבוה פי שלושה של תאי natural killer גדולים נמצא במדור הריאתי-שולי מאשר במדור התאים במחזור הדם, למרות שהמספר הכולל של תאי natural killer באופן כללי דומה.יתרה מכך, יכולתם של תאי NK (Natural Killer) מהמדור הריאתי-שולי (marginating-pulmonary compartment) לליית תאי גידול היא גבוהה יותר מזו של תאי NK במחזור הדם, כפי שנמדד באמצעות בדיקת שחרור כרומיום סטנדרטית כנגד לפחות שניים מקווי תאי גידול שונים. בנוסף, גרייה חיסונית באמצעות מתן Poly I:C in vivo מייצרת השפעה עמוקה יותר על ציטוטוקסיות של תאי NK ריאתיים-שוליים מאשר על תאי NK במחזור הדם כאשר נעשה שימוש במטרות MADB106. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך מספר דקות אם היא מבוצעת כראוי.טכניקות אלו מאפשרות איסוף סלקטיבי של לוקוציטים מ-MP. חקר לוקוציטים אלו יקדם את הבנתנו לגבי המשמעות הביולוגית והקלינית, ובמיוחד בכל הנוגע לבקרת תאים חריגים במחזור הדם ומחלות הקשורות לריאות. לאחר הליך זה, ניתן לאפיין ולנתח את התאים באמצעות ציטומטריית זרימה, PCR, או כל בדיקה אחרת הרלוונטית למחקר.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן איסוף לוקוציטים ריאתיים שולייים (marginating-pulmonary leukocytes).

selective-harvesting-of-marginating-pulmonary-leukocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הכנה מטוהרים של ריאות תאים דנדריטים עכבר מתואר. דגש ספציפי ניתנת הבידוד של תת קונבנציונאלי תאים דנדריטים.

בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר

במסמך זה אנו מתארים פרוטוקולים קצירת מקרופאגים מכתשיים Murine, אשר תושבי תאים חיסוניים מולדים בריאה, ובדיקת ההפעלה שלהם כתגובה לתרבות בשיתוף עם חלקיקים polyanhydride.

הפעלת נייד קציר המקרופאגים מכתשיים Murine והערכת בהשפעת חלקיקים Polyanhydride

בסרטון זה, אנו מדגימים את הבידוד של לויקוציטים בכבד מכבד עכבר על ידי זילוח מאולץ.

בידוד של לויקוציטים בכבד שוליים מכבד עכבר

פרוטוקול זה מתאר טכניקת בידוד לקבלת תאי סטרומה mesenchymal תושב ריאה הראשית של חולדות, באמצעות עיכול אנזימטי, הפרדת שיפוע צפיפות, דבקות פלסטיק CD146 + מבחר חרוז מגנטי.

בידוד של CD146<sup&gt; +</sup&gt; תאי סטרומה mesenchymal ריאות התושב מריאות העכברוש

לויקוציטים שוליים-כבדיים מציגים מאפיינים ייחודיים ותפקודים אימונולוגיים מובהקים בהשוואה לאוכלוסיות לויקוציטים אחרות. כאן אנו מתארים שיטה לקטיף סלקטיבי של אוכלוסיית תאי הכבד הספציפית הזו, באמצעות זלוף מאולץ של הכבד של חולדות או עכברים. לויקוציטים שוליים בכבד נראים קריטיים בקביעת הרגישות למחלות וגרורות הקשורות לכבד.

קציר סלקטיבי של לויקוציטים Marginating-כבדית

פרוטוקול זה מתאר את ההסרה של טיהור של עורק הריאה אנדותל תאים (PAECs) לדבוק קצות בלון קטטר Swan-גנץ בעת שהם נמצאים תקוע בעורק הריאה במהלך צנתור הלב הימני יישארו חסיד בלון מנוכה בעקבות הסרת מן הגוף של המטופל.

הקציר של תאי אנדותל של קצות בלון קטטר Swan-גנץ לאחר צנתור הלב הימני

אנו מתארים שיטה לעיבוד מכתשיים נוזל ששטיפה בהתאמה דם היקפי מאנשים כרוניים הנגועים באיידס על טיפול תרופתי להערכת מאגרי HIV ריאתי. שיטות אלה תוצאה של רכישת תאים CD4 T טהור מאוד מכתשי מקרופאגים שעשויים להיגרם לאחר מכן עבור immunophenotyping קלדה ו-DNA האיידס/RNA כימות על ידי תגובת שרשרת באולטרסאונד.

עיבוד של ברונמכתשיים נוזלים ומתאימים דם עבור מכתשיים מקרופאג ו CD4+ T-Cell Immunophenotyping קלדה ומאגר HIV הערכה

תאי אנדותל לימפטיים Leptomeningeal (LLECs), סוג תא תוך גולגולתי שזוהה לאחרונה, הם בעלי תפקידים לא מובנים. מחקר זה מציג פרוטוקול הניתן לשחזור לקצירת LLECs מעכברים וביסוס תרביות ראשוניות במבחנה . פרוטוקול זה נועד לאפשר לחוקרים להתעמק בתפקודים התאיים ובהשלכות הקליניות האפשריות של LLECs.

קציר ותרבית ראשונית של תאי אנדותל לימפטיים Leptomeningeal

פרוטוקול זה מפרט את הבידוד של אוכלוסיות חיסוניות ולא מחוסנות מריאות העכבר במצב יציב ובעקבות זיהום בשפעת. הוא גם מספק אסטרטגיות שער לזיהוי תת-קבוצות של תאים אפיתל ומיאלואידים.

בידוד אוכלוסיות תאים מיאלואידיים ואפיתל חיים מריאת העכבר

שיטה מהירה להשיג leukocytes חדירה מהמוח Murine מתואר. שיטה זו מנצלת שיפוע Percoll רציפה שיפוע Ficoll רציפה כדי לבחור ולטהר את שכבת ליקוציט מועשר. Leukocytes מבודד ואז עלול להיות מאופיין על ידי מדידות זרימת cytometric.

בידוד של המוח, שחדר Leukocytes

למדו שיטת פרפוזיה כפויה לקציר סלקטיבי של לויקוציטים Marginating-ריאתי בעכברים וחולדות. טכניקה זו מאפשרת חקר אוכלוסיית תאים ייחודית עם תפקודים אימונולוגיים מובחנים בריאות.

קציר סלקטיבי של לויקוציטים Marginating-ריאתי

גלה סרטונים נוספים