Name: העברת גנים לתוך האיברים השמיעתיים עוף ידי ב אובו מיקרו electroporation (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: למד שיטת מיקרו-אלקטרופורציה מותאמת לתוך האיבר השמיעתי של עוף החל מיום עוברי ארבע. טכניקה זו מאפשרת מניפולציות גנטיות לחקירת התפשטות ותמיון תאי קדם שמיעתיים בפיתוח החוש השמיעתי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר דוריס ק וו עבור פלסמידים הביטוי והן בדיקות באתרו, במרכז האוניברסיטאי ג&#39;ונס הופקינס עבור מתקן הדמיה ביולוגיה חושי והמרכז השמיעה ושיווי המשקל. עבודה זו נתמכה על ידי NIDCD גרנט T32 DC000023 אל LE

הביצים עובר שלא נולד הם דאגו וטפלו אתיים ובאנושיות. כל הפרוטוקולים לשימוש עובר שלא נולד אושרו על ידי הטיפול בבעלי חי הוועדה השתמשתי בבית ספר ג&#39;ונס הופקינס לרפואה, בולטימור, מרילנד. 1. ביצים הכנת בונה הביטוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 3 - 4 ביצים עוף מופרית תריסר (גאלוס גאלוס) שוכב על צדם על 37 מעלות צלזיוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות של דגירה, למשוך 3 סמ&quot;ק של חלבון עם מזרק מתום הסיבוב לאחור של הביצה לאטום את החור עם קלטת ברורה. זה יוצר אוויר בין העובר לבין קליפת הביצה, המאפשר נוחות הגישה עובר ללא עובר דבק הקליפה בעת חיתוך בחלון לגישה על גבי הביצה 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 117 שעות של זמן דגירה, לביים את העוברים על פי המבורגר המילטון 20 שלבי התפתחותב E4 (HH24-25) (ראה איור 1D). </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביטוי בונה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ה- DNA פלסמיד באמצעות ריאגנטים והפרוטוקול שספק היצרן של ערכת הכנה זמינה מסחרי. בצעד של הכנה הסופי, elute את ה- DNA לתוך 500 μl TE (טריס-EDTA) חיץ המסופק בערכה לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתנול להאיץ את ה- DNA להתרכז אותו על ידי הוספת 50 μl של 3 M נתרן אצטט 1 מ&quot;ל של אתנול 100% אל הצינור. מניחים את הצינור ב -20 ° CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור במשך 30 דקות ב 14,000 סל&quot;ד ב 4 ° C.. הסר את supernatant ואוויר-יבש גלולה במשך 10 דקות ב RT. ממיסים את גלולה ב 15 μl חיץ TE, אשר אמור להניב ריכוז של ~ 4 מיקרוגרם / μl. ההערה: בונת ביטוי השליטה בשימוש הנה pMES-IRES-GFP 10, אשר מונע על ידי אמרגן העוף β-יקטין, או-H2B PCI-IRES-RFP <sעד&gt; 10, אשר מונע על ידי האמרגן CMV. </li></ol></li></ol> 2. עוף ב אובו מיקרו electroporation ו ב assay שגשוג התאים לג&#39;ימי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב אובו מיקרו הזרקה של Construct הביטוי-electroporation מיקרו: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את צינורות זכוכית נימי לתוך מחטים דקות באמצעות חולץ מיקרו-פיפטה עם פרמטרים אופטימיזציה הבאים עבור 2.5 x 2.5 מ&quot;מ Box פלטינום חימום נימה: לחץ = 500, חום = 600 ° C, משוך = 64, מהירות = 105, ושעה = 150 msec (ראה טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מתייחסות לזה בשלבים-מניפולטור מיקרו ימניים איגוף המיקרוסקופ (ראו איור 1 א). The-מניפולטור מייקרו הימני מחזיק את מחט נימי הזכוכית במייקרו-מניפולטור האם אתה השמאלי מחזיק האלקטרודות (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מחט זכוכית נימי דק משכו עבור הזרקת מיקרו ידי חיתוךקצה המחט עם מלקחיים תוך כדי עבודה תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את המחט באופן ידני על ידי היד באמצעות-מניפולטור מיקרו עם 2.5 μl של ה- DNA פלסמיד כהים עם 0.1% Fast הירוק תוך כדי עבודה תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הביצה שוכבת על צידו בתוך מכשיר חזק עובש / ביצה (ראה איור 1 א). חותכי חלון עגול על גבי הביצה באמצעות מספריים 19 (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך כדי העבודה תחת מיקרוסקופ, לפתוח בזהירות את שתי ממברנות שכיסו את העובר באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך כדי עבודה תחת מיקרוסקופ, לספק כ ~ 0.5 μl של ה- DNA פלסמיד לומן שלפוחית ​​תקין otic ידי הזרקת מיקרו באופן ידני באמצעות יד ימין באמצעות-מניפולטור מיקרו ידי-electroporation מיקרו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשם כך, מיקרו-להזריק לומן שלפוחית ​​otic תקין עם ה- DNA עם-מניפולטור מיקרו ימנית ביד (איור 1 ב- D) בעוד באותו זמן באמצעות אוחזים ביד שמאלמלקחי ga כדי לייצב את הראש של העובר, כי הראש של העובר טובל בשלב E4. אל מיקרו-להזריק בעבר לומן שלפוחית ​​otic, כי זה יפגע שלפוחית ​​otic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר הזרקת מיקרו, תוך כדי עבודה תחת מיקרוסקופ, השתמש-מניפולטור מיקרו שבצד שמאל כדי למקם את (האנודה) חיובי 2 מ&quot;מ הקדמי-הגחון אלקטרודה פלטינה אל שלפוחית ​​תקין otic לבין אלקטרודה 2 מ&quot;מ שלילית (הקתודה) במקביל 1 מ&quot;מ זה מזה (ראה איור ג 1). לספק 4 פעימות ב 12 V עם 100 משך msec וריווח 200 msec. שלפוחית ​​otic עזבה משמשת קבוצת ביקורת פנימית. הערה: יש לנקות את האלקטרודות בין electroporations עם מקלון צמר גפן שקצהו טבול 1x PBS. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב assay שגשוג התאים לג&#39;ימי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר electroporation להוסיף 50 μl של 0.25 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​edu ב 1x PBS על ידי הטלת ידני 50 μl פתרון Edu על כלהעובר ב אובו בעזרת פיפטה. חותם את הביצים עם קלטת ולחזור בחממה במשך 18 - 96 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את הקלטת ולבדוק את העוברים על אות ה- GFP או RFP ניאון בתוך שלפוחית ​​otic לאחר 18 - 24 שעות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי (ראה איור 1 א &#39;א&#39; &#39;). אם אות ניאון הוא ההווה, בשלב זה לקצור את העוברים ניתוחים או לאטום עם קלטת ולהחזיר אותו אל האינקובטור לקציר ומנתח בשלבים מאוחרים יותר (ראה איור 1 FP &#39;&#39;). הערה: הביטוי של אות ה- GFP עם מבנה pMES-IRES-GFP ניכר 6 - 7 שעות לאחר electroporation 10. </li></ol></li></ol> קציר העובר 3. עיבוד רקמות עבור RNA הכלאה באתרו ו אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר את העוברים באמצעות מלקחיים. יש לשטוף את העובר ב PBS 1x הקר. הסר את הראש של העוברים, על ידי חיתוך הראש בצווארובאמצעות מלקחיים, ומניחים את הראש לתוך O paraformaldehyde 4% / N ב 4 ° C. לנקב את המוח באמצעות מלקחיים כדי לאפשר חדיר של paraformaldehyde 4% בתוך הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים את הראשים סוכרוז 30% (ב 1x PBS) O / N ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר ראשי במדיום cryoprotective ידי להקפאה מהירה בתוך slurry קרח methylbutane יבש (2-Methylbutane). לחלופין, מהיר להקפיא את הראשים במדיום cryoprotective עם חנקן נוזלי. אחסן את ראשי הרכוב ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryosection הראשי לתוך 12 מיקרומטר סעיפי רקמה עבים לאסוף את כל חלקי רקמה הפנימיים המכילה אוזן על גבי שקופיות זכוכית מיקרוסקופ superfrosted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע RNA תקן הכלאה באתרו אימונוהיסטוכימיה כפי שתואר לעיל 4,21, ולנתח עבור התפשטות תאים edu בעקבות פרוטוקול שסיפק היצרן של הערכה. הערה: תאי שיער ניתן לזהות באמצעות ארנב polyclonal α-MyosinVIIa (Myo7a)tibody (1: 1,000, Biosciences פרוטאוס) ו נוגדנים משני שכותרתו fluorescently (1: 250, נגד ארנב עיזים AlexaFluor 488; Invitrogen). </li></ol> לכידת תמונה 4. ועיבוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלמו תמונות עם ציוד הדמיה דיגיטלית. תוצאות אימונוהיסטוכימיה תמונה עם מיקרוסקופ ותוצאות תקן הניאון של באתרו באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב סטנדרטי (החל 5x כדי 40x בהגדלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את התמונות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה. </li></ol>

<ol><li>Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+atlas+of+the+gross+anatomy+of+the+developing+inner+ear+of+the+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken.</a> The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).</li>
<li>Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+of+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Patterning of the mammalian cochlea.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).</li>
<li>Whitfield, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+genetics+%26+development%22%5BJournal%5D)">Development of the inner ear.</a> Current opinion in genetics & development. 32, 112-118 (2015).</li>
<li>Raft, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-regulation+of+Ngn1+and+Math1+coordinates+the+production+of+neurons+and+sensory+hair+cells+during+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development.</a> Development. 134, 4405-4415 (2007).</li>
<li>Satoh, T., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+the+relationships+between+mechanosensory+cells+and+the+neurons+that+innervate+them+in+the+chicken+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear.</a> Development. 132, 1687-1697 (2005).</li>
<li>Katayama, A., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+production+in+the+chicken+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Cell production in the chicken cochlea.</a> The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).</li>
<li>Cotanche, D. A., Sulik, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+stereociliary+bundles+in+the+cochlear+duct+of+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos.</a> Brain Res. 318, 181-193 (1984).</li>
<li>Alsina, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signaling+is+required+for+determination+of+otic+neuroblasts+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo.</a> Developmental biology. 267, 119-134 (2004).</li>
<li>Chang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp4+is+essential+for+the+formation+of+the+vestibular+apparatus+that+detects+angular+head+movements%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements.</a> PLoS genetics. 4, e1000050(2008).</li>
<li>Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+neurogenesis+in+the+inner+ear+requires+inhibition+of+Sox2+transcription+by+neurogenin1+and+neurod1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).</li>
<li>Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2-mediated+gene+transfer+and+in+ovo+electroporation+of+the+otic+placode%3A+a+powerful+and+versatile+approach+for+investigating+embryonic+development+and+regeneration+of+the+chicken+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear.</a> Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).</li>
<li>Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Id+gene+regulation+and+function+in+the+prosensory+domains+of+the+chicken+inner+ear%3A+a+link+between+Bmp+signaling+and+Atoh1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).</li>
<li>Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+Sox2+and+Sox3+in+neuronal+and+sensory+progenitors+of+the+developing+inner+ear+of+the+chick%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick.</a> The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).</li>
<li>Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prosensory+function+of+Sox2+in+the+chicken+inner+ear+relies+on+the+direct+regulation+of+Atoh1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1.</a> PLoS One. 7, 30871(2012).</li>
<li>Das, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Developmental biology. 294, 554-563 (2006).</li>
<li>Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory+neural+crest+cell+alphaN-catenin+impacts+chick+trigeminal+ganglia+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation.</a> Developmental biology. 392, 295-307 (2014).</li>
<li>Kumar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+non-small+cell+lung+tumor+development+by+the+let-7+microRNA+family%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).</li>
<li>Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf+signaling+regulates+development+and+transdifferentiation+of+hair+cells+and+supporting+cells+in+the+basilar+papilla%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla.</a> Hearing research. 289, 27-39 (2012).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. , e306(2007).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+bone+morphogenetic+proteins+in+the+developing+vestibular+and+auditory+sensory+organs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).</li>
<li>Bell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+segregation+of+auditory+and+vestibular+neurons+in+the+otic+placode%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode.</a> Developmental biology. 322, 109-120 (2008).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השיטה המתוארת כאן של מיקרו-electroporation אובו מותאמת במיוחד עבור העברת גנים לתוך איבר השמיעה מתפתחות. זה תואם עם וקטורי ביטוי פלסמיד מבוסס DNA משמשים בדרך כלל כדי לתפעל גן פונקציה / ביטוי. העיתוי של electroporation ב E4 הוא אופטימלי עבור חקירות המתמקדות בפיתוח HC באיבר השמיעה. השלבים הקריטיים ביותר הם מיקרו-הזרקת DNA לתוך לומן שלפוחית ​​otic מבלי לעבור עמוק מדי עם המחט ופגיעה שלפוחית ​​otic (ראה איור. 1A-D), מיקוד ה- DNA לתוך תחום-הגחון הקדמי של שלפוחית...

למרות הבדלים במורפולוגיה דפוסים הסלולר בין יונקי איבר חישת שמיעת עופות, הגורמים המולקולריים והשבילים אחראים לפיתוח HC חושי נחשבים ישומרו 1-3 אבולוציונית. את הגבשושיות basilar, שבו שוכנים HCS שמיעתי גיל שמסביב שלהם, מפתחת כקובץ outpocketing של otocyst האוזן הפנימית. מוקדם על מאגר של אבות HC ו SC המצוין בתוך placode otic / כוס otic עצבית-החושי התחום המוסמך (NSD). נתוני גורל מיפוי לספק ראיות כי שושלות עצביות ועל חושים תהיינה צמודות לנבוע NSD ממוקם באזור הגחון-אנטרו של כוס otic או otocyst בעכברים ועוף 4,5. ראשית, neuroblasts delaminate מן NSD להצמיח נוירונים של גנגליון השמיעתי-שיווי משקל, אשר בסופו של דבר התפצל גרעינים שמיעתיים שיווי משקל. נוירונים אלה מעצבב HCS החושית של האוזן הפנימית גרעינים בגזע המוח. תאי הב להישאר NSD נחשבים להצמיח טלאים חושיים שונים, כוללים איבר חישת השמיעה, מורכב של HCS החושית transducing-mechano ו SCS הקשורים בם. בשני האפרוח ואת Murine, יציאת אב חוש שמיעת איבר מחזור התא והבחנת HC להתרחש מנוגדים הדרגתיים. בשנת חומוס, יציאה-מחזור תא שמיעת אבי מתחילה בסביבות ~ E5 ומתקדם מהבסיס אל הקודקוד, ומן המרכז לפריפריה 6. יום אחד מאוחר יותר, בידול HC מתחיל ב איפקס ומתקדם לבסיס 7. לימוד הפיתוח של האוזן הפנימית עוף מספק יתרונות טכניים רבים ככל שניתן לחקור מנגנונים תפקודיים בקלות יחסית ב אובו בניגוד המניפולציה עוברת ברחם במערכות מודל אחרים, מחייב ניתוחים מורכבים. השיטה המתוארת כאן משתמשת במיקרו-electroporation אובו למקד הגנים של עניין באזילה משוערתr באזור פטמית-ventrally הקדמי של שלפוחית ​​otic ספציפית E4. Electroporation ב אובו הוא טכניקה כי הוא מבוסס היטב נפוץ 8-14. העיקרון של טכניקת electroporation מבוסס על העובדה כי נוקלאוטידים (למשל, ה- DNA פלסמיד, DNA הסינטטי, או RNA oligonucleotides) הם בעלי מטען שלילי. ה- DNA מוזרק לתוך הרקמה של עניין. כאשר זרם חשמלי ומוצבות הרקמות, הזרם פותח נקבוביים חולף מרכיבי דופן התא ומאפשר הספיג של DNA, כמו ה- DNA המטען השלילי זורם לכיוון האלקטרודה החיובית (האנודה). בניסויים הרווחים של פונקציה, גנים של עניין הם subcloned נפוץ לתוך פלסמידים ביטוי המכילים קלטות ביטוי מתאימות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP). בניסויים הפסד של פונקציה בונה מדכא שלילי דומיננטי מבוססי פלסמיד, או RNAi, או בונה morpholino הם גommonly בשימוש 15,16. כדי לעכב microRNA (מירנה) miRNAs פונקציה בונה ספוג, שהן בדרך כלל פלסמיד מבוסס, יכול לשמש 17. השיטה המתוארת כאן מאפשר לחקור את המנגנונים המולקולריים השולטים התפשטות והבחנה באיבר השמיעה, כמו בשיטה מיקרו-electroporation אובו ניתן לשלב בקלות עם ב assay שגשוג התאים אובו ידי הוספת edu לעובר שלם. את electroporation והוספת edu מתבצע E4 של שלפוחית ​​otic, שהוא יום אחד לפני תחילת היציאה מחזור התא באיבר השמיעה. ניתוח של איבר השמיעה הוא בדרך כלל מבוצע 18 - 96 שעות לאחר electroporation ב E5 (תחילת יציאת מחזור תא ובתאים חושיים), E6 (תחילת בידול HC), ו E7 (במהלך התמיינות HC); ובהמשך עד ~ E9 (סוף בידול HC). שיטת electroporation זה של העברת גנים הוא חולף שנמשך כ ~ 4 ימים, because הגנים של עניין לא להשתלב בגנום, אבל השיטה ישימה לשימוש עם וקטורי ביטוי מבוסס DNA פלסמיד המתאים, אשר יש להם את היכולת להשתלב בגנום, כגון העברת גנים בתיווך Tol2 11. באמצעות שיטה זו GFP החזק או ביטוי RFP נמשך ~ 4 ימי השבלול, ולאחר מכן הם האותות לדעוך, עדיין מספקים חלון זמן מספיק כדי ללמוד על ההתפתחות הסבוכה של איבר השמיעה. זה בשיטת העברת גני אובו הוא רומן ומאפשר למקד את איבר השמיעה המשוער ספציפית E4, שבו הוא אופטימלי עבור חקירות המתמקדות בפיתוח HC באיבר השמיעה. זוהי תוספת טובה שיטות חלופיות, אשר electroporate בבית הרבה שלבי התפתחות צעירים 11,12 או בהשוואה לשימוש של תרבויות explant גבשושיות basilar במבחנת 18.

<table><tbody><tr><td>סטרילי 1x PBS pH 7.4</td><td>gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>מהיר ירוק FCF אבקת</td><td>סיגמה</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>EdU אבקת</td><td>Invitrogen</td><td>E10187</td><td></td></tr><tr><td>Click-IT EdU Alexa Fluor 555 ערכת הדמיה</td><td>Invitrogen</td><td>C10338</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מידי פלסמיד HiSpeed (25)</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 ElectroSquarePorator&nbsp;</td><td>BTX הרווארד מנגנון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בננה למיקרו-גרבר ערכת כבלים</td><td>BTX הרווארד</td><td>45-0216</td><td></td></tr><tr><td>ימני & מיקרומניפולטורים שמאליים</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>M3301R & M3301L</td><td></td></tr><tr><td>שני שלבי מכשיר אחיזה מגנטיים 12 מ"מ עם עמודים אנכיים בגודל 7 אינץ'</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td>לוחית בסיס פלדה <td>מתכת M10</td><td></td></tr><tr><td>12x24 אינץ'</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>5479</td><td></td></tr><tr><td>מספריים לביצים באורך 12 ס"מ מעוקלים, להבים עדינים במיוחד 12 מ"מ; מספריים קפיצים</td><td>מכשירים מדויקים בעולם בע"מ&nbsp;</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה למשיכת מחטים</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>2.5x2.5 מ"מ קופסה פלטינה חימום נימה</td><td>סאטר מכשיר ושות'</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורות נימי זכוכית / מחטים / ללא סיבים / בורוזיל 1 מ"מ</td><td>FHC</td><td>27-30-0</td><td></td></tr><tr><td>מזרק זכוכית המילטון 100 &mu; l</td><td>המילטון</td><td>80601 דגם 710LT</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי (כבד) למזרק זכוכית המילטון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>O122-1</td><td></td></tr><tr><td>צינורות פוליאתילן לחיבור מזרק הזכוכית ומחטי נימי הזכוכית / בקטון לא רעיל</td><td>דיקינסון ושות' (BD)</td> <td>427420 Intramedic Clay Adams מותג</td><td></td></tr><tr><td>3 סמ"ק מזרקים חד פעמיים</td><td>בקטון דיקינסון ושות' (BD)</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>מחטים חד פעמיות 21 מד</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)305122</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>זוג אחד של אלקטרודות פלטינה 2 מ"מ</td><td>בולדוג ביו. / Nepagene</td><td>CUY611P3-2</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק אלקטרודות</td><td>בולדוג ביו. / Nepagene</td><td>CUY580</td><td></td></tr><tr><td>זוג אחד של מלקחיים עדינים של Dumont מספר 5</td><td>כלי מדע עדינים (FST)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סרט בלתי נראה בגימור מט לאיטום ביצים</td><td>אופיס דיפו</td><td>520-928</td><td></td></tr><tr><td>ספוגיות כותנה</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>טיפים</td><td></td><td></td><td></td> לסינון סטרילי</tr></tbody></table>

העברת גנים לתוך האיברים השמיעתיים עוף ידי<em&gt; ב אובו</em&gt; מיקרו electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

עוברי עוף הם מערכות מודל אידיאלי ללימוד ההתפתחות העוברית מניפולציות של תפקוד הגן ניתן לבצע בקלות יחסית ב אובו. האורגן החושי השמיעה באוזן הפנימית הוא קריטי ליכולת שלנו לשמוע. זה בתים האפיתל חושי מאוד מיוחד שמורכב בתאי שיער transducing-mechano (HCS) וסביבת גליה דמוית תאים תומכים (SCS). למרות הבדלים מבניים באיברי השמיעה, מנגנונים מולקולריים להסדיר את הפיתוח של איבר השמיעה שמורים אבולוציונית בין יונקי עופות ב electroporation אובו מוגבל בעיקר בשלבים מוקדמים ב E1 -. E3. בשל ההתפתחות מאוחר יחסית של איבר השמיעה ב E5, מניפולציות של איבר השמיעה על ידי ב electroporation אובו בעבר E3 הן להיתקל בקשיים עקב הפיתוח המתקדם של עובר העוף בשלבים מאוחר יותר. השיטה המוצגת כאן היא שיטת העברת גנים חולפת למיקוד גנים של ריביתבשלב E4 - E4.5 באיבר חושי השמיעה עוף בפיתוח באמצעות in-electroporation מיקרו אובו. שיטה זו חלה על gain- ואובדן-של-פונקציות עם וקטורי ביטוי מבוסס DNA פלסמיד הקונבנציונלי יכולה להיות משולבת עם ב assay שגשוג תאי אובו ידי הוספת EDU (5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine) לעובר השלם בבית זמן של electroporation. השימוש של חלבון פלואורסצנטי ירוק או אדום (GFP או RFP) פלסמידים הביטוי מאפשר הנסיין לברר במהירות אם electroporation בהצלחה ממוקד החלק השמיעתי של האוזן הפנימית בפיתוח. במאמר שיטה זו, דוגמאות מייצגות של דגימות electroporated GFP מומחשות; עובר נבצרו 18 - 96 שעות לאחר electroporation ומיקוד של GFP לאזור פרו-החושי של איבר השמיעה אושר על ידי RNA כלאה באתרה. עיתון השיטה גם מספק פרוטוקול אופטימיזציה עבור שימוש thymidine אנלוגי edu לנתח תא proliferation; דוגמא assay התפשטות תאים מבוססת edu המשלב תיוג חיסוני ולחץ כימית edu מסופקת.

ב DNA פלסמיד נייר שיטה זו מורכבת של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) קלטות ביטוי הייתה ממוקדת לתוך פטמית basilar עוף מתפתחות (BP) עם פרמטרים אופטימיזציה של 12 וולט ו -4 פעימות עם 100 משך ומרווחי דופק msec של 200 msec, מניב ~ 50% שיעור הישרדות עובר ויעילות של ה- DNA פלסמיד מיקוד לתוך BP. הדמית פלורסנט ביטוי GFP יליד בפיתוח עובר הראתה שיטה זו של electroporation מעדיף מטרות ההיבט הקדמי-גחון של otocyst, כי מוליד את BP (EE איור 1 &#39;; החץ...

איבר השמיעה מתווך את השמיעה. כאן אנו מציגים שיטת מיקרו-אלקטרופורציה שונה בביצית המותאמת לחקר התפשטות והתמיינות של תאי אב שמיעתיים באיבר השמיעה המתפתח.

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

המטרה הכללית של שיטה זו היא לבצע מניפולציות גנטיות באיבר השמיעה המתפתח של העוף החל מהיום הרביעי לעובר ואילך. דבר זה הוא משמעותי בשל הקושי בעבודה עם שלב התפתחותי מתקדם של עובר העוף. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא פונה באופן ספציפי לאיבר השמיעה המתפתח בתוך הביצה (in ovo) בקלות יחסית בהשוואה לטכניקות אחרות הדורשות ניתוחים מורכבים ברחם (in utero).שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע להתפתחות החושים השמיעתיים, כולל האופן שבו מתואמים התבנית המרחבית והזמנית של התרבות תאי אב חושיים והבידול התורשתי שלהם. כדי להתחיל בהליך זה, חברו את מחט הנימיזית מזכוכית באמצעות הפיתול המחובר למזרק הזכוכית המוצב על המיקרו-מניפולטור הימני, והניחו את האלקטרודות על המיקרו-מניפולטור השמאלי.תחת המיקרוסקופ, חתכו את קצה המחט באמצעות פינצטה. לאחר מכן, העבירו 2.5 µL של DNA מפלזמה צבוע ב-0.1% fast green לתוך צלחת. מלאו את המחט ב-DNA מפלזמה באמצעות הבוכנה של המזרק המחובר למיקרו-מניפולטור הימני.הניחו ביצה על צדה במכשיר תמיכה. לאחר מכן, גזרו חלון עגול בחלק העליון של הביצה באמצעות מספריים. לאחר מכן, הניחו את הביצה במכשיר התמיכה תחת המיקרוסקופ.פתחו בזהירות את שתי הממברנות המכסות את העובר באמצעות פינצטה כדי לחשוף את הבועה האוטיות (otic vesicle) הימנית. תוך כדי ייצוב ראשו של העובר עם פינצטה ביד שמאל, הזריקו כ-0.5 µL של plasma DNA באמצעות המיקרו-מניפולטור ביד ימין. היזהרו לא להזריק מעבר לחלל הבועה האוטיות, שכן הדבר יגרום לנזק לבועה האוטיות.הזרקה מיקרוסקופית של DNA לתוך חלל הבועת האוטיקה (otic vesicle) ללא פגיעה בבועת האוטיקה היא קריטית ודורשת שימוש בשתי הידיים. מיד לאחר ההזרקה המיקרוסקופית, השתמש במיקרו-מניפולטור של יד שמאל כדי למקם את סט האלקטרודות החיובית והשלילית מפלטינה באורך שני מילימטרים בחלק הקדמי-בטני (anterior ventral) של בועת האוטיקה הימנית, והעבר ארבעה פולסים במתח של 12 volts באמצעות הפעלת האלקטרופורטור. מיקום מדויק של האלקטרודות על האזור הקדמי-בטני של איבר השמיעה העתידי הוא חשוב ומבטיח כי איבר השמיעה המתפתח הוא המטרה.מיד לאחר האלקטרופורציה, הוסיפו 50 µL של EdU על העובר השלם בתוך הביצה (in ovo). לאחר מכן, אטמו את הביצה בעזרת סרט דביק. החזירו את כל הביצים שעברו מניפולציה ואטימה למדגרה למשך 18 עד 96 שעות.לאחר 18 עד 24 שעות, הסירו בזהירות את הסרט. בדקו את העוברים לאיתור אות פלואורסצנציה של GFP או RFP בתוך השלפוחית האוזנית (otic vesicle) באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה סטנדרטי. אם קיים אות פלואורסצנציה, אספו את העוברים לצורך אנליזות, או אטמו אותם שוב בעזרת סרט והחזירו אותם לאינקובטור לצורך איסוף ואנליזות בשלבים מאוחרים יותר.היברידיזציה של RNA in situ שימשה כדי לקבוע האם האלקטרופורציה התמקדה בהצלחה בחלק השמיעתי של האוזן הפנימית המתפתחת. בתוך ה-BP המתפתח, תאי אב תחושתיים זוהו על פי ביטוי של Sox2 ו-Lunatic Fringe. תמונות אלו מדגימות כי תאי אב תחושתיים לאורך ה-BP המתפתח בבסיס ובקודקוד סומנו בהצלחה וביטאו GFP לאחר 68 שעות של אלקטרופורציה.בנוסף, GFP התבטא מחוץ לתחום החושי בתאי אפיתל שאינם חושיים ובגנגליון השמיעתי שסומן על ידי ביטוי של Neurod1. כדי לקבוע את התנהגות השכפול של תאי אב חושיים, EdU, אנלוג של תימידין, הוסף בזמן האלקטרופורציה ביום העוברים E4, וארבעה ימים מאוחר יותר, נותחה שילובו של EdU ב-BP המתפתח בחתכי רקמה. סימון אימונולוגי לחלבון הספציפי לתאי שיער, Myosin7a, שימש לזיהוי תאי שיער המבדילים ב-BP המתפתח. בחלק האפיקלי של ה-BP, תאי שיער חיוביים ל-Myo7a היו לעיתים קרובות חיוביים ל-EdU.בעוד שבבסיס, רק תאי שערה בודדים חיוביים ל-Myo7a שילבו EdU, מה שמרמז כי בזמן הוספת ה-EdU ביום E ארבע, פרוגניטורים תחושתיים בבסיס הם כבר ברובם פוסט-מיטוטיים. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להשלים אותה בחמש עד שמונה דקות לביצית. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להשתמש בריאגנטים סטריליים שהוכנו טרי כדי להבטיח את הישרדות העוברים.בעקבות הליך זה, ניתן לשנות את פרמטרי השיטה כדי לחקור תופעות אחרות באוזן הפנימית המתפתחת, כגון התפתחות איברי השיווי והנוירוגנזה של האוזן הפנימית. טכניקה זו סוללת את הדרך עבור חוקרים בתחום האוזן הפנימית ללמוד באופן ספציפי את איבר השמיעה של העוף, המתפתח בשלב מאוחר יחסית, מהיום הרביעי לעוברית ואילך. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי הטיפול הנכון בעוברית העוף, ביצוע מיקרו-הזרקה ואלקטרופורציה, וביצוע בדיקת שגשוג תאים in ovo.

gene-transfer-into-chicken-auditory-organ-ovo-micro

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

צ'יק ב electroporation אובו היא טכניקה המאפשרת מניפולציה גנטית של העובר העופות. יישומים נפוצים של טכניקה זו כוללות אנליזה פונקציונלית של גנים המשוערת אלמנטים משפר. וידאו זה מדגים electroporation neural tube אצל ה"ה 10 עוברי אפרוח. טכניקת הזרקת וטיפול נאות ביצה הם דנו.

ב Electroporations אובו של HH 10 עוברים שלב עוף

האוזן הפנימית העכבר הוא איבר placode הנגזרות חושית אשר התפתחותית תוכנית מפורטת במהלך ההריון. אנו...

ין העברת לאוזן הפנימית על ידי פיתוח מאוס<em&gt; In vivo</em&gt; Electroporation

המטרה הכללית של סרט זה היא להראות כיצד לבצע הזרקת רשתית...

ב electroporation לג&#39;ימי ברשתית צ&#39;יק עובריים

כדי להעריך את תפקוד רגולציה של גנים במהלך ההתפתחות של נוירונים המוח התיכון דופאמין, אנו מתארים שיטה...

ב electroporation לג&#39;ימי של המוח התיכון צ&#39;יק לחקר תפקוד הגן בהתפתחות Neuron דופאמין

השיטה של ​​העברת גנים לעוברי עוף בשלבי דגירה מאוחר יותר (מעל גיל המבורגר המילטון הבמה (ה"ה) 22) מתואר. שיטה זו מתגברת על החסרונות...

ין העברת לעוברי עוף מבוגרים יותר על ידי<em&gt; לג&#39;ימי לשעבר</em&gt; Electroporation

אנו מציגים שיטה המתארת בידוד ותרבית של צמחי שבלול מהאוזן הפנימית של עכבר עוברי.  אנו גם מדגימים שיטה להעברת גנים לתוך צמחי שבלול באמצעות אלקטרופורציה של גל מרובע. תרבית הצמח במבחנה יחד עם טכניקת העברת גנים מאפשרת לחוקרים לחקור את ההשפעות של שינוי ביטוי גנים במהלך ההתפתחות.

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג&#39;ין העברה על ידי Electroporation

נוירונים גזעיים של גזע המוח של avians ויונקים הם מיוחדים עבור קידוד עצבי מהיר, תהליך בסיסי עבור פונקציות השמיעה הרגילה. נוירונים אלה נובעים מבשרי ברורים של המוח האחורי עובריים. אנו מציגים טכניקות ניצול electroporation להביע גנים במוח האחורי של עוברים עוף ללמוד תפקוד הגן במהלך פיתוח השמיעה.

ב Electrooration Ovo ב המוח עוף שמיעה

פיתחנו גישה חדשנית של אובדן תפקוד הכוללת החדרה ואינטגרציה גנומית של רצפי מיקרו-רנ"א מלאכותיים לעוברי אפרוחים באמצעות אלקטרופורציה ומערכת טרנספוזון Tol2. טכניקה זו מספקת מתודולוגיית פירוק גנים חזקה ויציבה לחקר תפקוד גנים במהלך ההתפתחות.

גישת אובדן תפקוד ברשתית הגוזל העוברי באמצעות ביטוי טרנסגני בתיווך Tol2 של מיקרו-רנ"א מלאכותי

הגוזל הוא אורגניזם מודל חסכוני, נגיש וזמין באופן נרחב למגוון מחקרים. כאן מפורטת סדרה של פרוטוקולים להבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההתפתחות וההתחדשות של האוזן הפנימית של העופות.

בשיטות אובו ואקס אובו לחקר התפתחות האוזן הפנימית של העופות

תוך שימוש באלקטרופורציה של ovo , פיתחנו שיטה לטרנספציה סלקטיבית של האוזן הפנימית השמיעתית וגרעין השבלול בעוברי עוף כדי להשיג פגיעה ספציפית לקבוצת התאים של חלבון פיגור שכלי X שביר במהלך תקופות בדידות של הרכבת מעגלים.

ניתוח תפקוד אוטונומי של תאים של חלבון פיגור שכלי X שביר במעגל שמיעתי על ידי אלקטרופורציה של In Ovo

למד שיטת מיקרו-אלקטרופורציה מותאמת לתוך האיבר השמיעתי של עוף החל מיום עוברי ארבע. טכניקה זו מאפשרת מניפולציות גנטיות לחקירת התפשטות ותמיון תאי קדם שמיעתיים בפיתוח החוש השמיעתי.

העברת גנים לתוך האיברים השמיעתיים עוף ידי

גלה סרטונים נוספים