תקנה אפיגנטיים של לב בידול בתאי גזע עובריים ורקמות

המטרה הכללית של יישום גישות אלו של שיקוע חיסוני של כרומטין בתאי גזע עובריים המבדילים את עצמם או ברקמות עובריות של הלב, היא לחשוף את הבקרה האפיגנטית של התפתחות הלב. מכיוון שכוונון עדין של שעתוק גנים במהלך התפתחות הלב העוברי מוסדר על ידי רכיבים אפיגנטיים, שיקוע חיסוני של כרומטין הוא גישה מתאימה להבנת תהליך זה.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת להתמקד באופן ספציפי בלוקוס מסוים ולבחון את הסימנים האפיגנטיים הנמצאים על מקטע ה-DNA הספציפי הזה. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי בקרה אפיגנטית של התפתחות הלב. ניתן להחיל אותה גם על איברים אחרים או על כל סוגי תאים.

זוהי אימן. היא דוקטורנטית במעבדה והיא תבצע את הניסוי היום. פרוצדורה זו משתמשת בתאי גזע עובריים או תאי ES.

גופי Embryoid שהופקו מתאי ES ורקמות לב עובריות שנותחו מעוברי עכבר ביום E9.5. קבעו את התאים והרקמות. השתמשו ב-1% formaldehyde ב-PBS עבור התאים ובבופר פרמיליזציה PB2 עבור הרקמות העובריות.

הניחו את המבחנות על שייקר אורביטלי במהירות של 60 RPM בטמפרטורת החדר למשך בדיוק 10 דקות. עצרו את תגובת הקישור הצולב (cross-linking) על ידי הוספת glycine לריכוז סופי של 125 millimolar, ודגרו במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר על השייקר האורביטלי במהירות של 60 RPM. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, השעיקו מחדש את המשקע ב-10 milliliters של PBS.

ואת הרקמות העובריות במיליליטר אחד של PB2. סנטריפוגה במהירות של 1000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C. השליך את העל-מבנה (supernatant) והוסף את הבאפר המתאים לשטיפה שנייה.

הוסיפו מעכבי פרוטאז לתמיסות PB1 ו-PB2 על קרח. הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסה PB1 בתוספת מעכבי פרוטאז למשקע התאים, ושאבו בעזרת פיפטה למעלה ולמטה כדי לסuspended את התאים. באופן דומה, סספנדו את הרקמות העובריות במיליליטר אחד של תמיסה PB2 בתוספת מעכבי פרוטאז.

לאחר מכן, השתמש במזרק של 1 מיליליטר עם מחט במידה 21 כדי להומוגניז את התאים או הרקמות. העבר את תרחיף התאים לשפופרת נקייה של 1.5 מיליליטר. דגור את התאים והרקמות ההומוגניים בטמפרטורה של 4 °C למשך 10 דקות.

סבבו במערך צנטריפוגה במהירות של 3000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C. השליכו את העלייה (supernatant) וסספנדו מחדש כל משקע ב-300 µL של באפר הסוניקציה המתאים, בתוספת מעכבי פרוטאז.

כדי לבצע גזירה (shearing) של הכרומטין, סוניקציה של הדגימות בטמפרטורה של four degree Celsius תוך שימוש בתוכנית הסוניקציה המתאימה לכל חומר. התאימו את משך הסוניקציה בהתאם לשאלה האם ה-DNA ישמש ל-PCR או לריצוף. לאחר מכן, סובבו בצנטריפוגה את ליסאטי התאים שעברו סוניקציה למשך 10 דקות.

העבירו את העילאי, המכיל את הכרומטין בתמיסה, מכל דגימה לפקום נקי של 1.5 מיליליטר והשליכו את המשקע. קחו מנה של 1.5 מיקרוליטר מכל דגימה ודללו אותה ביחס של 1:10 עם מים. בדקו את הצפיפות האופטית של כל הדגימות בספקטרופוטומטר ננו כדי לקבוע את ריכוז החלבון.

לפני ביצוע שיקוע חיסוני של כרומטין (chromatin immunoprecipitation), הכין חרוזי Protein A משולבים על ידי שטיפה שלהם כפי שמתואר בטקסט של הפרוטוקול. בתוך מבחנה נקייה של 1.5 מיליליטר, ערבב את הנוגדן שהופק נגד היסטונים מושנים או גורמי שעתוק, 20 µL של חרוזי Protein A משולבים שטופים ומיליליטר אחד של באפר C בתוספת מעכבי פרוטאז (protease inhibitors). הדגר את הדגימות על רוטטור במהירות 40 RPM למשך שעתיים לפחות בטמפרטורה של 4 °C.

שטפו את קומפלקס חרוזי הנוגדנים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של buffer C כפי שמתואר בטקסט של הפרוטוקול. הכינו שתי מבחנות, אחת המכילה 150 micrograms של כרומטין וקומפלקסים של חרוזי נוגדנים, והשנייה המכילה 150 micrograms של כרומטין ו-20 microliters של חרוזים שטופים. הוסיפו מיליליטר אחד של buffer C מועשר במעכבי פרוטאז לכל מבחנה, והדגרירו את הדגימות על גלגל סיבוב במהירות 40 RPM למשך לילה בטמפרטורה של ארבעה degree Celsius.

עם השלמת האימונו-שיקוע (immunoprecipitation) במהלך הלילה, הניחו את הדגימות במערך המגנטי ואספו את הנוזל העליון (supernatant) המכיל כרומטין של נוגדן שאינו קשור. בצעו אלוציה של החלבון הקשור לנוגדן על ידי הוספת 150 µL של בופר D1 לחומרים שנשטפו. דגרו את הדגימות למשך 20 דקות בטמפרטורה של 50 °C בבלוק חימום.

לאחר 20 דקות, הוציאו את הדגימות מבלוק החימום והניחו אותן במגנט. העבירו את העלייה לנוזל למבחנה נקייה של 1.5 milliliter והשליכו את החרוזין. כדי לבטל את הקשר הצלב (crosslink), הוסיפו נתרן כלורי בריכוז חמישה מולארי לעלייה לנוזל כדי להגיע לריכוז סופי של 200 millimolar.

הכינו דגימת קלט (input) של כרומטין במבחנה נקייה של 1.5 מיליליטר. השתמשו בכמות כרומטין זהה לזו שבדגימת האימונו-שיקוע (immunoprecipitation), בנפח סופי של 150 מיקרוליטר של מים נקיים מ-RNase ו-DNase ונתרן כלוריד בריכוז 5 מולרי, עד לריכוז סופי של 200 מילימולרי. דגרו את הדגימות למשך לילה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס.

ביום למחרת, הוצא את הדגימות מבלוק החימום. הוסף EDTA לריכוז סופי של 12.5 millimolar ו-Proteinase K לריכוז סופי של 250 micrograms per milliliter ובצע עיכול בטמפרטורה של 55 degree Celsius למשך שעתיים. התחל את ההליך על ידי הכנת החרוזים.

ראשית, יש להביא את החרוזים לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות. לאחר מכן, יש לערבב את החרוזים במערבל Vortex ביסודיות רבה ולהעביר במהירות באמצעות פיפטה 1 mL של חרוזים למבחנה נקייה בנפח 1.5 mL. יש להניח את מבחנת החרוזים על המגנט למשך שתיים עד שלוש דקות עד שהתמיסה תהיה צלולה, ולהיפטר מהנוזל העליון (supernatant).

הוציאו את המבחנה מהמגנט. הוסיפו 1 mL של EDTA בריכוז 0.5 M וערבבו באמצעות וורטקס קצר. שטפו את החרוזים פעמיים באופן זה והשליכו את הנוזל העליון לאחר השטיפה האחרונה.

הוצא את המבחנה מהמגנט. הוסף 1 mL של buffer E ותלה את החרוזיים באיטיות. העבר את כל התערובת אל 50 mL של buffer E. הנח על שייקר ותן לתערובת להתערבב באיטיות בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.

לאחר מכן, יש לבחון את חרוזי קישור ה-DNA באמצעות סולם DNA של 1 KB ושלושה יחסי נפחים שונים של חרוזים לנפח ה-DNA. נקבע כי יחס של 2.5/1 הוא היעיל ביותר עבור קישור ה-DNA. כדי להשתמש בחרוזים לניקוי DNA, יש להוסיף 425 microliters או 2.5 נפחים של חרוזים לכל דגימת DNA ולערבב באיטיות על ידי שאיבה והזרקה (pipetting) למעלה ולמטה כ-10 פעמים.

דגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הניחו על המגנט למשך חמש דקות. לאחר מכן, שאבו והשליכו את העלייה (supernatant).

שטפו פעמיים עם 80% ethanol שהוכן טרי, על ידי הוספת 600 µL לכל מבנה. המתינו דקה אחת, ולאחר מכן שאבו והשליכו את הנוזל העליון (supernatant). סובבו את המבנות במהירות בצנטריפוגה.

הניחו את המבחנות על המגנט. הסירו את טיפות האתנול האחרונות והניחו להן להתייבש למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. הסירו את הדגימה מהמגנט ובצעו אלוציה ל-DNA על ידי הוספת 20 µL של מים נקיים מ-DNase ו-RNase. ערבבו ב-Vortex.

אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז חשפה את הגדלים של מקטעי DNA שהתקבלו לאחר ביטול קשירה (reverse cross-link) של DNA שלם שעבר סוניקציה וחולץ מתאי ES של עכבר, גופי Embryoid ומרקמת לב עוברית. ניסוי של שיקוע חיסוני של כרומטין (chromatin immunoprecipitation) תוכנן כדי לבחון את הוויסות האפיגנטי של גנים של מעבר אפיתליאלי-מזנכימלי בתאים מסוג בר (wild type) או בתאים עם מוטציה גנטית, כאשר תאי ES מבדילים לעבר גורל תאי מזודרמי. קישור של היסטונים שעברו מודיפיקציה נוטר ב-PCR של הפרומוטורים או האנהנסרים של הגנים E-Cadherin ו-Twist.

ביצוע שיקוף של שיקוע חיסוני של כרומטין (Sequential chromatin immunoprecipitation) בוצע על כרומטין שחולץ מארבעה קווי תאי ES אנושיים, תוך שימוש בנוגדנים למסמן המפעיל כרומטין ולאחריו בנוגדנים למסמן מדכא. מסמנים אלו עוברים שינוי כאשר תאים נחשפים למורפוגנים, אך הם משתנים בהתאם לקווי תאי ה-ES האנושיים. סביר שהדבר נובע מהבלאסטוציסטות המקוריות מהן הם נגזרו.

ניתן להחיל שיקוע חיסוני של כרומטין (Chromatin immunoprecipitation) גם על כרומטין שחולץ מאזורים לבביים עובריים ספציפיים. איור זה מציג אזורים גנומיים של הגנים הלבביים Nkx2.5 ו-TBx5 המועשרים בהיסטון שעבר מודיפיקציה, ואזור גנומי אחד של הגן Shox2 הספציפי לקוצב הלב שאינו מועשר ואינו מובע בחדר). ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה בשלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבדוק את יעילות הסוניקציה לפני תחילת פרוטוקול ה-IP. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון Eth-ek-se-ek כדי לענות על שאלות נוספות, כגון בחינת מצבו הקודם של הכרומטין, פתוח או סגור, או ניטור המרווחים בין הנוקלאוזומים. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום האפיגנטיקה לבחון בקרה אפיגנטית של החלטות לגבי גורל התא בכל סוג תא או איבר עוברי.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבצע בדיקות שיקוע חיסוני של כרומטין (chromatin immunoprecipitation assays).