Name: בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: למדו לבודד תאים בודדים מעוברי דג הזברה ולנתח את ביטוי הגנים שלהם באמצעות מערכת מיקרו-נוזלית. שיטה זו חושפת את ההטרוגניות התאית המוסתרת בשיטות מבוססות אוכלוסיות ומסייעת להבנת תהליכי ההתמיינות וההתפתחות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר סי ג'פרי ברנס על מלאי הדגים. המחברים אסירי תודה למתקן הליבה של ציטומטריית הזרימה של UNC, ליבת UNC-CGIBD AAC על המשאבים המאפשרים פרויקט זה, ולמתקן ZAC לטיפול בבעלי חיים. L.S. נתמך על ידי מענק NIH T32 HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. נתמך על ידי מלגת מחקר לתארים מתקדמים של NSF NSF-DGE-1144081. מחקר זה נתמך על ידי מענק NIH P30DK034987 (ל-UNC Advanced Analytics Core), מענק פיתוח מדענים של איגוד הלב האמריקאי 13SDG17060010 ומענק הקרן הרפואית אליסון AG-NS-1064-13 (לד"ר קיאן), ומענק NIH R00 HL109079 (לד"ר ליו).

<ol><li>Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis%3A+toward+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis: toward the clinic.</a> Genome medicine. 5, (2013).</li>
<li>Macaulay, I. C., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+genomics%3A+advances+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Single cell genomics: advances and future perspectives.</a> PLoS genetics. 10, e1004126(2014).</li>
<li>Marco, E., et al. Bifurcation analysis of single-cell gene expression data reveals epigenetic landscape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5643-5650 (2014).</li>
<li>Yin, H., Marshall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+single+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for single cell analysis.</a> Current opinion in biotechnology. 23, 110-119 (2012).</li>
<li>Garlanda, C., Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+endothelial+cells.+Specific+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of endothelial cells. Specific markers.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 17, 1193-1202 (1997).</li>
<li>Diaz-Cano, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+heterogeneity%3A+mechanisms+and+bases+for+a+reliable+application+of+molecular+marker+design%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Tumor heterogeneity: mechanisms and bases for a reliable application of molecular marker design.</a> International journal of molecular sciences. 13, 1951-2011 (2012).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+cellular+hierarchy+by+single-cell+analysis+of+the+cell+surface+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Mapping cellular hierarchy by single-cell analysis of the cell surface repertoire.</a> Cell stem cell. 13, 492-505 (2013).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+cell+fate+decisions+revealed+by+single-cell+gene+expression+analysis+from+zygote+to+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst.</a> Developmental cell. 18, 675-685 (2010).</li>
<li>Treutlein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstructing+lineage+hierarchies+of+the+distal+lung+epithelium+using+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq.</a> Nature. 509, 371-375 (2014).</li>
<li>Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+early+development+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+genetics+%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Genetics and early development of zebrafish.</a> Trends in genetics : TIG. 5, 283-288 (1989).</li>
<li>Liu, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+in+the+study+of+early+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish in the study of early cardiac development.</a> Circulation research. 110, 870-874 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Zhao, S., Fung-Leung, W. P., Bittner, A., Ngo, K., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNA-Seq+and+microarray+in+transcriptome+profiling+of+activated+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells.</a> PloS one. 9, e78644(2014).</li>
<li>McCall, M. N., McMurray, H. R., Land, H., Almudevar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+non-detects+in+qPCR+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">On non-detects in qPCR data.</a> Bioinformatics. 30, 2310-2316 (2014).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature. 3, 1101-1108 (2008).</li>
<li>Lyons, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+and+morphogenetic+defects+in+the+heart+tubes+of+murine+embryos+lacking+the+homeo+box+gene+Nkx2-5%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Myogenic and morphogenetic defects in the heart tubes of murine embryos lacking the homeo box gene Nkx2-5.</a> Genes & development. 9, 1654-1666 (1995).</li>
<li>Chen, J. N., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+tinman+homolog+demarcates+the+heart+field+and+initiates+myocardial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish tinman homolog demarcates the heart field and initiates myocardial differentiation.</a> Development. 122, 3809-3816 (1996).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latent+TGF-beta+binding+protein+3+identifies+a+second+heart+field+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Latent TGF-beta binding protein 3 identifies a second heart field in zebrafish.</a> Nature. 474, 645-648 (2011).</li>
<li>Paffett-Lugassy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+field+origin+of+great+vessel+precursors+relies+on+nkx2.5-mediated+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Heart field origin of great vessel precursors relies on nkx2.5-mediated vasculogenesis.</a> Nature cell biology. 15, 1362-1369 (2013).</li>
<li>McCurley, A. T., Callard, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+housekeeping+genes+in+zebrafish%3A+male-female+differences+and+effects+of+tissue+type%2C+developmental+stage+and+chemical+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male-female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment.</a> BMC molecular biology. 9, 102(2008).</li>
<li>Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+reference+genes+for+quantitative+real-time+RT-PCR+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biochimica+et+biophysica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization.</a> Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).</li>
<li>Serbedzija, G. N., Chen, J. N., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+in+the+heart+field+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulation in the heart field of zebrafish.</a> Development. 125, 1095-1101 (1998).</li>
<li>de Pater, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+phases+of+cardiomyocyte+differentiation+regulate+growth+of+the+zebrafish+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart.</a> Development. 136, 1633-1641 (2009).</li>
<li>Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+cardiac+development+requires+a+conserved+secondary+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field.</a> Development. 138, 2389-2398 (2011).</li>
<li>Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+expression+of+cardiac+myosin+genes+reveals+regulated+aspects+of+heart+tube+assembly+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish.</a> Developmental biology. 214, 23-37 (1999).</li>
<li>Molina, N., et al. Stimulus-induced modulation of transcriptional bursting in a single mammalian gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20563-20568 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השיטה המתוארת במסמך זה השתמש ביטוי של חלבון פלואורסצנטי תחת השליטה של ​​מקדם ספציפי תאים מהסוג להעשיר אוכלוסייה של ובתאים לב מעוברי דג זברה לשימוש במערכת ללכוד microfluidic בסיוע תא בודד להעריך ביטוי של תת-קבוצה של גני לב יחיד תאים. ובלבד יכולות עירור ופליטה לייזר FACS עולים בקנה אחד עם fluorophore (ים) של בחירה, שיטה זו יכולה לשמש לכל קו כתב ניאון. קווי כתב דג זברה רבים כבר קיים, ודגים מהונדסים נושאת לכתבי רומן יכולים להיוצר קטן כמו 3 חודשים. בנוסף, זרימת עבודה זו יכולה להתאים לי...

רוב המחקרים הנוכחיים של ביולוגיה מולקולרית של תא מבוססים על ממוצעי אוכלוסייה. עם זאת, אירועים ביולוגיים חשובים עשויים להיות רעולי פנים על ידי ניתוחים מבוסס אוכלוסיה המסורתיים הללו, מאחר ואנשים קטין יכול לשחק תפקידים מרכזיים בתהליכים ביולוגיים ותוצאות המחלה. הבנת ביטוי גני אוכלוסיות הטרוגניות ברמת התא הבודדה יכולה (ויש לו) להוביל לתובנות ביולוגיים וקליניים רלוונטיים 1,2. דאגה ללימודי התפתחות עובריות, בתוך אוכלוסייה גדולה יותר של תאים, ובתאים הם בדרך כלל מיוצגים כראוי, מה שהופכים אותו מאתגר כדי לזהות שינויים עדינים ביטוי גנים שבסופו של דבר ליזום החלטות גורל תא 3. באופן דומה, סוג תא בודד יכול להיות ביטוי פרופילים שונים בתגובה במיקרו-סביבה של 4. לדוגמה, תאי אנדותל תושב אותו איבר או באיברים שונים (למשל., אבי העורקים או כליות) להפגין ההטרוגניות רבה, למרות שיתוף morp משותףתכונות hological ופונקציונליות 5. בנוסף, תאים סרטניים לאכלוס אותה הגידול יכולים להיות גם משתנים פרופילים או מוטציות מולקולריים ברמת התא הבודדה 6. במערכות מודל, transcriptomics יחידים תאים זיהה בהצלחת אוכלוסיות תאים חדשות, המאופיינת מצבי ביניים המתרחשים במהלך התמיינות תאים, וגילה תגובות הסלולר הפרש לגירויי 7,8,9. תובנות אלה היו רעולי פנים במחקרים מבוסס אוכלוסיה קונבנציונאלי. עוברי דג זברה הם מקור מתחת מנוצל מאוד של גזע, אב, ובידול תאים לחקר שאלות ההטרוגניות תא בודד ורגולציה מולקולרית של זהויות הסלולר במהלך פיתוח. פיתוח וקלות מניפולציה גנטית סטריאוטיפית שלהם מאוד, לשעבר vivo לגרום להם מערכת מודל מצוינת עבור גישה זו 10,11. באופן ספציפי, מגבלה משמעותית לפרשנות של תא בודד genנתוני דואר ביטוי הוא כי זיהוי אמין של מדינות תא ביניים רומן במהלך פיתוח דורש תזמון מאוד זהיר של אוסף רקמות 9. הדבר נחוץ כדי להבטיח כי ההטרוגניות בין תאים שנתפסו מייצג ההטרוגניות בתוך רקמה בנקודת זמן אחת ולא הטרוגניות בביטוי גנים שהציג התמיינות תאים תלוי גיל. בהשוואה לעכברים, פיתוח עובר דג זברה יכול להיות מסונכרן בדיוק על פני מספר גדול של עובר 12. בנוסף, עם גדלי מצמד גדולים, עוברי דג זברה יכולים לשמש מקור שופע של תאי גזע מולידם. פרוטוקול זה מתאר שיטה לבודד תאים מעוברים דג הזברה ללכוד תאים בודדים באמצעות מעגל מיקרופלואידיקה משולבת זמינים מסחרית (IFC) מערכת שבבים autoprep עבור ניתוח ביטוי גנים qRT-PCR. פרוטוקול זה יכול להיות להעברה מיד על כל מבחני ריבוב תפוקה גבוהה כולל כלרצף transcriptome המאפשר ניתוח מקיף יותר של ההטרוגניות הסלולר 13. הוא מציע גם מספר יתרונות מבחני ביטוי גנים מסורתיים. פרוטוקול בידוד תא הבודד מניב כדאיות גבוהה לאחר FACS, אשר מקטינה את חלקם של תאים נפגעים כלולי יישומים במורד זרם. באמצעות IFC, תאים שצולמו עשויים להיות שנצפו ישירות להעריך שיעורים ללכוד ולהעריך תא בריאות מורפולוגית. בנוסף, פרוטוקול זה הוא החלים רחב לקהילת מחקר דג הזברה, המחייב רק קו דג מהונדס שכותרתו וגישה לטכנולוגיות ללכוד תאי microfluidic. כהוכחה עקרונית, תאים בודדים נגזרו אבות לב הבודדים שנתפסו על שבב IFC, ולאחר מכן את השפע היחסי של סמני בידול לב נמדד על ידי qRT-PCR. ניתוח התבטאות גנים ברמת התא הבודדה מוכיח כי אבות לב לדור בכפיפה אחת עם differe שלהםצאצאי ntiating. התובנה שנצבר פרופיל תא בודד של אבות לב עשוי לשפוך אור על ההטרוגניות דפוסי ביטוי גנים בין ובתאים לב במהלך ההתפתחות חוליות, אשר עשויים להיות רעולי פנים בניתוחים מבוסס אוכלוסיה מסורתית.

<table><tbody><tr><td><חזק>אספקה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>דומונט #5 מלקחיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>להסרת הכוריון מעוברים</td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל</td><td>GeneMate</td><td>C-3261-1</td><td></td></tr><tr><td>40 מסננת תאים אום</td><td>ביובייסיק</td><td>SP104151</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית 35 מ"מ</td><td>פלקון</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>צינורות FACS עם מסננת תאים 35 אום</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>P1000 וטיפים</td><td>Rainin</td><td>17005089</td><td></td></tr><tr><td>P20 וטיפים</td><td></td> פרוטוקול יצרן שבבי <td>Rainin</td> 17005091 <td></td></tr><tr><td>IFC</td><td>Fluidigm</td><td>100-6117</td><td>גרסה 100-6117 E1 שימש בניסוי מייצג</td></tr><tr><td>פיפטת זכוכית פסטור רחב נשא</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>עבור העברת עוברים</td></tr><tr><td>דג זברה בוגר מסוג בר</td><td>N/A</td><td></td><td>השתמשנו בקו AB דג</td></tr><tr><td>זברה טרנסגני בוגר</td><td>N/A</td><td></td><td>השתמשנו ב-Tg(nkx2.5:ZsYellow)</td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>מספר קטלוגי</td><td>הערות</td></tr><tr><td>ריאגנטים לדיסוציאציה של תאים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מים מזוקקים כפולים</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אינסטנט אוקיינוס מלח ים</td><td>אינסטנט אוקיינוס</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>FisherScientific</td><td>S271-3</td><td>מכינים מלאי במים ומשתמשים למאגר הסרת חלמון</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td>מכינים מלאי במים ומשתמשים למאגר הסרת חלמון</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td>מייצרים מלאי במים ומשתמשים בו למאגר הסרת חלמון</td></tr><tr><td>L-15</td><td>Gibco</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>FisherScientific</td><td>03-600-511</td><td>השבתת חום; כל מותג של FBS צריך להיות בסדר</td></tr><tr><td>מגיב דיסוציאציה של תאים 1 -TrypLE</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td>יש לאחסן בטמפרטורת החדר.</td></tr><tr><td>מגיב דיסוציאציה תאים 2 - FACSmax</td><td>Genlantis</td><td></td><td>T200100 Store -20; להפשיר על קרח; להביא לטמפרטורת החדר לפני השימוש</td></tr><tr><td>בפרונאז (אופציונלי)</td> <td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>צבע L / D - Sytox Blue</td><td>Life Technologies</td><td>S34857</td><td>כל כתם חי / מת המתאים לזרימה ציטומטריה יעבוד</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr> <tr><td><חזק>שם< / חזק> </td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagents for ifc plate and qRT-PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>בדיקות ספציפיות</td><td></td><td></td> לגן <td>בדיקות ישתנו בהתאם לניסוי</td></tr><tr><td>TaqMan Probe ef1a</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03432748_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe gata4</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03443262_g1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe nk2-5</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03074126_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe myl7</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03105700_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe vmhc</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03431136_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe isl1</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03425734_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>ריאגנטים הרשומים בפרוטוקול</td><td></td><td></td><td></td>יצרן IFC</tr><tr><td>C1 Reagent Kit</td><td>Fluidigm</td><td>100-5319</td><td>ריאגנטים להעמסת תאים על צלחת IFC</td></tr><tr><td>Ambion Single Cell-to-CTTM</td><td>Life Technologies</td><td>4458237</td><td>ריאגנטים לשעתוק הפוך ושלבי הגברה מוקדמת</td></tr><tr><td>ביולוגיה מולקולרית איכות</td><td>מים קורנינג</td><td>46-000CM</td><td></td></tr><tr><td>C1 IFC עבור PreAmp (5-10 um)</td> <td>Fluidigm</td><td>100-5757</td><td>צלחת IFC לתאים קטנים</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק</td><td>><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק</td></tr><tr><td>><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכונת הכנה אוטומטית C1</td><td>Fluidigm</td><td>100-5477</td><td>לשימוש בצלחת IFC</td></tr><tr><td>המוציטומטר&nbsp;</td><td>Z359629 סיגמא אולדריץ'</td><td></td><td>לספירת תאים והערכת גודל התא</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td></td><td></td> ניתוח <td>להסרת עוברים מכוריון</td></tr>, <tr><td>מיקרוסקופ</td><td></td><td></td> תרבית רקמה <td>להערכת עיכול תא בודד</td></tr><tr><td>מכונת</td><td></td><td></td> FACS <td>לבידוד תאים מעניינים</td></tr></tbody></table>

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

דג הזברה (Danio rerio) הוא אורגניזם מודל רב עוצמה לחקר התפתחות בעלי חוליות. למרות שהיבטים רבים של התפתחות עוברית של דג הזברה תוארו ברמה המורפולוגית, מעט ידוע על הבסיס המולקולרי של שינויים תאיים המתרחשים עם התפתחות האורגניזם. עם ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות מיקרופלואידיקה וריבוב, ניתן כעת לאפיין ביטוי גנים בתאים בודדים. זה מאפשר לחקור הטרוגניות בין תאים בודדים של אוכלוסיות תאים ספציפיות כדי לזהות ולסווג תת-סוגים של תאים, לאפיין מצבי ביניים המתרחשים במהלך התמיינות תאים ולחקור תגובות תאיות דיפרנציאליות לגירויים. מחקר זה מתאר פרוטוקול לבידוד תאים בודדים ברי קיימא מעוברי דג זברה לבדיקות ריבוי תפוקה גבוהה. ניתן ליישם שיטה זו במהירות על כל סוג תאים עובריים של דג הזברה עם סמנים פלואורסצנטיים. ניתן להשתמש בהרחבה של שיטה זו גם בשילוב עם טכנולוגיות ריצוף תפוקה גבוהה כדי לאפיין באופן מלא את הטרנסקריפטום של תאים בודדים. כהוכחה לעיקרון, השפע היחסי של סמני התמיינות לבביים הוערך בתאים בודדים מבודדים שמקורם באבות לבביים חיוביים nkx2.5. על ידי הערכת ביטוי גנים ברמת התא הבודד ובנקודת זמן אחת, הנתונים תומכים במודל שבו אבות לבביים מתקיימים יחד עם צאצאים מתמיינים . השיטה וזרימת העבודה המתוארות כאן ישימות באופן נרחב לקהילת המחקר של דגי הזברה, ודורשות רק קו דגים טרנסגני מסומן וגישה לטכנולוגיות מיקרופלואידיקה.

כהוכחה עקרונית, ביטוי גנים הוערך לחקור דינמיקת בידול במהלך התפתחות של לב. בשנת דג זברה, אבות לב נובעים אוכלוסיית mesodermal של תאי נודדים אל mesoderm הצלחת לרוחב הקדמי שבו הם פתיל כדי ליצור את צינור הלב ליניארי. לפני היתוך, אבות לב מתחילים לבטא את nkx2.5 גורם שעתוק (NK2 homeobox 5), אשר נחשב סמן ספציפי המוקדם של אבות לב 16,17. הנה, דג מהונדס BAC שתואר לעיל Tg (nkx2.5: ZsYellow) 18, מקוצר nkx2.5: ...

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד תאים בודדים מעוברי דג הזברה, העשרה לתאים מעניינים, לכידת תאי דג זברה במערכות מולטיפלקס תאים בודדים מבוססות מיקרופלואידית, והערכת ביטוי גנים מתאים בודדים.

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לבודד תאים בודדים מעוברים של דגי זברה בשלבי התפתחות מוקדמים לצורך לכידתם במערכת מיקרופלואידית למולטיפלקס של תאים בודדים, כדי להעריך את ביטוי הגנים של תאים בודדים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית, כגון אילו שינויים שעתוקיים חלים בתאים במהלך ההגדרה (specification) וההגבהה (differentiation). היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מהווה גישה בלתי מוטה לחשיפת ההטרוגניות המוסתרת בטכניקות קונבנציונליות המבוססות על אוכלוסיות תאים.באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בטכניקה זו ייתקלו בקשיים, מכיוון שייצור של תכשירי תאים בודדים חיוניים הוא מאתגר מבחינה טכנית אך חיוני להמשך הניתוח. לאחר השליטה בשיטה, עיבוד דגימות של עוברי שלמים לתאים בודדים מולייסים על גבי שבב מיקרופלואידי אינטגרטיבי יכול להסתיים תוך שש שעות אם השלבים מבוצעים כראוי. במהלך ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לוודא שרק תאים בודדים נלכדים במכשיר המיקרופלואידי.לאחר הזווג של דגי זברה בוגרים מסוג wild-type וטרנסגניים, אספוו עוברים במרווחי זמן של 15 דקות בהתאם לנוהלי העבודה הסטנדרטיים המאושרים על ידי המתקן והמוסד. לפחות שעתיים לאחר מכן, העבירו 100 עד 300 עוברים מופריים מנקודת זמן אחת לפיתרי חדשה המכילה מי ביצים טריים. השתמשו בפינצטה עדינה כדי להסיר ידנית את הכוריון מכל עובר.בשלב הבא, השתמשו בפיפטת זכוכית בעלת פיה רחבה להעברת העוברים לשפופרת מיקרוצנטריפוז' של 2-milliliter בנפח מינימלי של מי ביצים. לאחר העברת כל העוברים, החליפו את המים ב-1 milliliter של מי ביצים קרים מאוד (בטמפרטורת קרח) והטביעו את השפופרת בקרח למשך 20 דקות. לאחר ההמתה, השתמשו בפיפטת זכוכית בעלת פיה רחבה להסרת הנוזל העליון.ופ pipette P-1000 להוספת מי ביצים טריים לעוברים פעמיים. לאחר השטיפה השנייה, החליפו את מי הביצים ב-1 milliliter של באפר להסרת החלמון (de-yolking buffer) והשתמשו ב-pipette P-1000 כדי לבצע טריטורציה לעוברים 8 עד 12 פעמים, עד להמסת החלמון ועד שגופי העוברים בלבד נראים. אספו את הרקמה באמצעות סנטריפוגציה.לאחר מכן, השתמש בפ pipette כדי להסיר בעדינות את הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע למשקע הרקמה, ותלה את התאים מחדש ב-1 milliliter של מי ביצים טריים. לאחר שטיפת העוברים פעמיים נוספות, תלה את המשקע מחדש ב-1 milliliter של cell dissociation reagent-1 בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הנח את המבחנה על צדה לדגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.יש לבצע טריטורציה עדינה מדי שתיים עד שלוש דקות כדי למנוע התגבשות. בסיום האינקובציה, סבבו שוב את התאים בצנטריפוגה ושחזרו את המשקע ב-1 milliliter של cell dissociation reagent-2. דגרו את התאים במצב אופקי בטמפרטורת החדר למשך חמש עד 15 דקות נוספות, תוך ביצוע טריטורציה עדינה מדי שתיים עד שלוש דקות.בכל חמש דקות, דללו 2 µl של עלנוס (supernatant) ב-18 µl של FACS buffer, והעבירו את התאים כטיפה על צלחת תרבית תאים. הניחו זכוכית כיסוי מעל הדגימה והשתמשו במיקרוסקופ לתרביות רקמה כדי להעריך את התקדמות העיכול בהגדלות של 10 ו-20x. כאשר התכשיר נראה כתערובת של בעיקר תאים בודדים עם כמה מקבצי תאים קטנים וגדולים ומספר גופי עובר של mostly intact, סבבו (spin down) את התאים והשביו את המשקע (pellet) ב-1 mL של FACS buffer קר.בשלב הבא, הרטבו מסננת תאים של 40 מיקרון בעזרת FACS buffer. סננו את התאים דרך המסננת אל תוך צלחת תרבית תאים של 35 מילימטר. לאחר סבב נוסף של סרקיגציה (spinning down), השביו את המשקע (pellet) ב-100 microliters של FACS buffer, וספרו את מספר התאים החיוניים בשיטת Trypan blue exclusion.בשלב הבא, דללו את הדגימה לריכוז של 5 × 10⁶ תאים למיליליטר. השאירו 10% עד 20% מהתאים עבור ביקורת ללא צביעה. צבעו את שאר התאים בצבע פלואורסצנטי להבחנה בין תאים חיים למתים.לאחר מכן, הרטבו מבחנת FACS עם מסנן תאים של 35 מיקרון באמצעות 20 µL של FACS buffer, והוסיפו את התאים למסנן, תוך איסופם באמצעות כוח הכבידה. בעזרת אסטרטגיית ה-gating המומחשת, בצעו מיון של תאים חיים בודדים המבטאים את הסמן הפלואורסצנטי. ודאו את ה-gating באמצעות התאים המסומנים בכפל.מיינו 2,000 עד 4,000 תאים מהאוכלוסייה המבוקשת אל תוך 5 µL של FACS buffer קר בתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה על קרח. לאחר מכן, העבירו 1 µL מהתאים הממוינים למבחנת FACS חדשה המכילה 100 µL של FACS sorting buffer ודילול של 1 ל-1,000 של צבע live/dead. הרצו את דגימת התאים באמצעות שערי המיון (sorting gates) כדי להעריך את החיותיות לאחר המיון.בשלב הבא, טענו 1 µL של תאים המדוללים ב-9 µL של FACS buffer אל תוך המוציטומטר (hemocytometer) כדי לקבוע את ריכוז התאים ואת קוטרם הממוצע. כעת בחרו מעגל מיקרופלואידי משולב, או שבב IFC, בגודל המתאים לקוטר התא הממוצע של הדגימה, ובצעו הטרייה (priming) למערכת הזרימה בהתאם להוראות היצרן. טענו את התאים אל הפלטה בהתאם להוראות היצרן, והכניסו את הפלטה למכונה פלואידית תואמת.לאחר מכן, הפעל סקריפט טעינת תאים מתאים עבור שבב ה-IFC כדי לדחוף את התאים אל נתיבי הלכידה. כדי לאשר שהתאים נקבעו באתרי הלכידה, הצמד את הפלטה למיקרוסקופ המצויד במתאם לפלטות והשג תמונות בשדה בהיר (brightfield) ובפלואורסצנציה של כל אתר לכידה בהגדלה של 10x. ניתן לאחר מכן לעבד את התאים לצורך הערכה המשכית (downstream) של ביטוי הגן מטרה שלהם באמצעות QRT-PCR.בשלב של 18 סומיטים, ניתן להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לאמת את ביטוי ה-ZsYellow בעוברים. לאחר המיון, מתקבלים תאים בטווח של קטרי שונים. ניתן להשתמש בפלטת ה-IFC כדי ללכוד תאים בקוטר הרצוי.לדוגמה, בניסוי זה, תאים בקוטר של 5 עד 10 µm. כצפוי, התאים הממוינים והנלכדים מעוברים 18 שעות לאחר ההפריה ביטאו את הסמן הפלואורסצנטי ZsYellow. כאן, נעשה שימוש ב-QRT-PCR כדי להעריך את ביטוי הגנים היחסי של גנים ספציפיים בעלי עניין ב-40 תאים בודדים מאתרי לכידת תאים על לוח IFC.מכיוון שטווח ערכי סף המחזור (cycle threshold) עבור הגן של בית השאיבה (housekeeping gene) היה רחב מדי כדי להשוות ביטוי גנים בין דגימות, וערכי סף מחזור רבים עלו על 30, הערכים הוצגו כמפת חום (heat map). בהשוואה בין הדגימות, נצפתה בניסוי זה הטרוגניות משמעותית בביטוי הגנים, כאשר התאים סווגו כסוגים 1 עד 5 בהתבסס על דפוס ביטוי הגנים שלהם.ברגע שהשיטה נשלטת, עיבוד דגימות של עוברים שלמים לתאים בודדים שעברו ליזיס על גבי שבב מיקרופלואידי אינטגרטיבי יכול להסתיים תוך שש שעות, אם השלבים מבוצעים כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שרק תאים בודדים נלכדים על השבב המיקרופלואידי. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ריצוף של תאים בודדים בתפוקה גבוהה, כדי לאפיין באופן מלא את הטרנסקריפטומים של תאים בודדים.לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה ההתפתחותית לחקר ההטרוגניות התאית בעוברים בשלבי התפתחות מוקדמים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו מבודדים תאים בודדים מעוברים של דגי zebrafish, לוכדים תאים בודדים במערכת multiplex לתאים בודדים מבוססת מיקרופלואידיקה, ומעריכים את ביטוי הגנים של תאים בודדים.

isolation-and-characterization-of-single-cells-from-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה שבאמצעותה לנתח את המוח חוליות עוברי דג הזברה מתפתח לחיות ברזולוציה של תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. זה כולל את השיטה שבאמצעותה אנו מזריקים את העובר מתא בודד דג הזברה ולאחר מכן הר התמונה במוח המתפתח.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

מפתח להבנת תהליכים המוךפו"גנטי שהולך המעצבים את העובר המוקדם הוא היכולת תאים תמונה ברזולוציה גבוהה. אנו מתארים כאן טכניקה תיוג תאים בודדים או קבוצות קטנות של תאים עוברי דג הזברה שלם עם חלבון הממברנה ממוקד, פלורסנט ירוק.

סימון תאים הדמיה למוח האחורי של דג הזברה

דג הזברה, דגים טרופיים קטנים, הפכה לדגם פופולרי ללימוד תפקוד גן במהלך התפתחות מחלה וחוליות. הביטוי של הזמן ומרחב של גני המטרה יכול להיקבע על...

הר שלם ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה בתוך עוברי דג הזברה לחקר ביטוי גנים ותפקוד

פרוטוקול זה מציג גישה לניתוח transcriptome כל מעוברים דג זברה, הזחלים, או תאים ממוינים. אנו כוללים בידוד של RNA, מסלול ניתוח של נתוני RNASeq, המבוססות על לרביעיית-PCR אימות של שינויים בביטוי הגנים.

הכנת הדוגמא וניתוח של נתונים ביטוי גנים מבוססת RNASeq דג זברה

דג זברה שימשו לאחרונה מערכת מודל ויוו ללמוד תזמון שכפול ה-DNA במהלך הפיתוח. . זה מפורט הפרוטוקולים עבור שימוש דג זברה העוברים של פרופיל שכפול תזמון. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות ללמוד שכפול תזמון מוטציות, סוגי תאים בודדים, מודלים המחלה ו מינים אחרים.

פרופיל תזמון שכפול ה-DNA באמצעות דג זברה כמערכת מודל In Vivo

אנו מציגים פרוטוקול לבודד את הנוירונים, מאקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח דג זברה הזחל בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. על בידוד, RNA מופק מן התאים האלה כדי לנתח את פרופיל ביטוי גנטי. פרוטוקול זה מאפשר האוסף של RNA באיכות גבוהה עבור ביצוע ניתוח במורד הזרם כמו qPCR ו- transcriptomics.

בידוד והפקת RNA של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה

אנו מציגים פרוטוקול יעיל, קל לשימוש עבור הכנת תרביות תאים הראשי של דג זברה העוברים על תרביות תאים, תא חי הדמיה, כמו גם פרוטוקול להכין ראשי תאים מהמוח דג זברה למבוגרים.

תרבות, תרביות תאים תאים ראשי דג זברה

פרוטוקול זה ממחיש החיסונית רציפים של האנטי ואימונוהיסטוכימיה על קריודורים מן השלב המוקדם של העוברים ומאפשרים לניתוחי לוקליזציה מדויקים באוכלוסיות תאים ספציפיות.

מרפאוולוגיה רציפה ואימונוהיסטוכימיה על קריוסינות עוברי דג

הפרוטוקול הנוכחי מתאר בידוד חריף של תאי שריר לב וכלי דם חלקים בני קיימא מדגי זברה בוגרים, צעירים, זחליים ועובריים (Danio rerio), המתאימים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים.

בידוד תאי שריר חלק לבביים וכלי דם מדגי זברה בוגרים, צעירים, זחליים ועובריים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים

במאמר זה אנו מתארים שיטה לבידוד מעיים מזחלי דגי זברה 5 ימים לאחר ההפריה, לצורך ניתוח ריצוף RNA חד-תאי.

בידוד מעיים מזחלי דגי זברה לריצוף RNA חד-תאי

למדו לבודד תאים בודדים מעוברי דג הזברה ולנתח את ביטוי הגנים שלהם באמצעות מערכת מיקרו-נוזלית. שיטה זו חושפת את ההטרוגניות התאית המוסתרת בשיטות מבוססות אוכלוסיות ומסייעת להבנת תהליכי ההתמיינות וההתפתחות.

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

גלה סרטונים נוספים