Name: גין השתקה נכונה: הקרנת ספריית RNA מדריך Heptamer מסוג Small בתרופות סרטן פוטנציאליות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: למד פרוטוקול לסינון ספריית sgRNA מסוג heptamer לזיהוי תרופות פוטנציאליות לסרטני דם. שיטה זו מאפשרת זיהוי מהיר של מועמדים תרפויטיים באמצעות עריכת גנים מכוונת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית העברת יכולת הסתגלות חלקה וטכנולוגיה בראי R מונחה יעד &amp; D, יפן מדע וטכנולוגיה הסוכנות, הקרן לקידום מחקר מדעי מעזר קידום הדדי Corporation עבור בתי ספר פרטיים של יפן, ואת מספרי JSPs KAKENHI גרנט 24300342 ו 15H04313 .

1. בניית ספריית sgRNA Heptamer מסוג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תת קבוצה של הרצפים 7-NT 16,384 (4 7) אלא אם הספרייה לעזרתן היא להיבנות. הערה: הרצפים יכולים להיות אקראיים ו / או שנועד למקד RNAs הסלולר הספציפי. לעניין האחרון זה, למצוא מבני סיכת ראש דומה T-היד של tRNA בתוך היעד RNA בעזרת תוכנת מחשב מתאימה ו / או ראייה, ובחרו רצפי משלים הרצפים-NT 7 מייד במורד זרם של מבני סיכת ראש 4,10, 17,18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז כל אחד heptamers נבחר בתור מלא 2&#39;- O -methylated, 5&#39;- ו- RNA 3&#39;-פוספורילציה עם סינתיסייזר DNA / RNA. השתמש בשיטה phosphoramidite על זכוכית נקבובית מבוקר (CPG) תמיכה, נוטש את הקבוצה להגנה 5&#39;-מסוף 4,4&#39;-dimethoxytrityl (DMT) על במחזור האחרון (תוספת של פוספט &#39;5) של סינתזה 23. הערה: Custom סאיםnthetic RNA ניתן להשיג גם מהספקים oligonucleotide. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת מחזור סינתזה האחרון, להעביר את CPG עם oligonucleotide מסונתז מהעמודה בקבוקון זכוכית עם ראש מתברג טפלון-אניה, להוסיף 1 מ&quot;ל של אמוניום הידרוקסיד 29%, ו דגירה אותו ב 55 מעלות צלזיוס למשך 8 שעות כדי לדבוק oligonucleotide מן CPG ולהסיר הקבוצות להגן מבסיסי ופוספטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאדות אמוניום הידרוקסיד עם המאייד צנטריפוגלי ב 40 ° C מחדש לפזר את oligonucleotide ב 0.2 מ&quot;ל של 0.1 מ &#39;n-hexylammonium אצטט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את oligonucleotide הסינטטי באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית הפוך פאזיים בעל ביצועים גבוהים באמצעות טור הקלקר-divinylbenzene עם מאגר המכיל אצטוניטריל 10-50% / 0.1 M יצטט n-hexylammonium. הפעל את הטור 2.0 מ&quot;ל / דקה במשך 25 דקות ב 80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.25-0.5 מיליליטר של חומצה אצטית מרוכזת המדגם המופרד (1-2 מיליליטר) כדי להפוך את פתרון חומצה אצטית 20%, ו אינקובטוריםte הפתרון הזה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר כדי להסיר את הקבוצה DMT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבש את המדגם עם המאייד צנטריפוגלי ב 40 ° C, מחדש לפזר אותו 1 מ&quot;ל של 29% אמוניום הידרוקסיד, דגירה הפתרון למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את שרשרת הצד של פוספט &#39;5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקטנת נפח (1 מ&quot;ל) של המדגם לכ 0.3 מ&quot;ל עם המאייד צנטריפוגלי ב 40 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze המדגם מרוכז כולו נגד מים מזוקקים (500 מ&quot;ל) באמצעות צינור דיאליזה של משקל מולקולרי חתוכים 1,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את המדגם dialyzed מהצינור דיאליזה כדי צינור 1.5 מ&quot;ל עם טפטפת, לייבש אותו עם המאייד צנטריפוגלי ב 40 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן מחדש להמיס אותו במים מים עבור הזרקת כיתה, שהיקפם צריך להיות קטן מספיק כדי להפוך את פתרון יותר מ -100 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד צפיפות אופטית של מדגם RNA ב 260 ננומטר עם ספקטרופוטומטר ולהתאים ריכוזו 100מיקרומטר על ידי הוספת מים מים-עבור-הזרקה-כיתה. אחסן את הפתרון RNA ב להלן -20 ° C לפני השימוש. </li></ol> הקרנת 2. הספרייה sgRNA עבור כדאיות התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 10 3 תאים / 99 μl / היטב (למשל, HL60 ו RPMI-8226) על צלחת 96-היטב בתקשורת RPMI-1640 בתוספת 10% בסרום שור עובריים 1% פתרון פניצילין, סטרפטומיצין. הכן בארות המכילות התקשורת רק רקע חיסור. כדי למגר תופעות קצה, להוסיף מים סטריליים כדי לרוקן בארות סביב הבארות המדגמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של sgRNA heptamer מסוג (100 מיקרומטר) מומס במים למטרות הזרקת כיתה מים זה טוב. Assay כל sgRNA בשלושה עותקים. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified 5% CO 2 למשך 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף נפח מתאים של פתרון WST-8 זמין מסחרי היטב כל אחד. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס אותו בחממה במשך 1 עד 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד ספיגt 450 ננומטר עם קורא microplate. הערה: ברוב המקרים, ליניאריות בין ספיגת ומספר תא קיימא נראה להישמר אלא אם הערך ספיגת עולה 1.0. </li></ol> 3. הערכה האפקטיבית sgRNAs ידי cytometry הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 10 3 תאים / 99 μl / היטב (למשל, HL60) על צלחת 96-היטב בתקשורת RPMI-1640 בתוספת 10% בסרום שור עובריים 1% פתרון פניצילין, סטרפטומיצין. הכן לפחות 10 בארות sgRNA אחד להיבדק. כדי למגר תופעות קצה, להוסיף מים סטריליים כדי לרוקן בארות סביב הבארות המדגמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של sgRNA heptamer מסוג (100 מיקרומטר) מומס במים למטרות הזרקת כיתה מים זה טוב. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified 5% CO 2 למשך 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוספים את התאים שטופלו באותו sgRNA מלפחות 10 בארות לתוך צינור 5 מ&quot;ל עם טפטפת. לסובב את הצינור במשך 5 דקות בתוך צנטריפוגות ב 300 XG, וזורק את התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של בופר פוספט 1x (PBS) אל הצינור, מחדש להשעות את התאים. לסובב את הצינור במשך 5 דקות בתוך צנטריפוגות ב 300 XG, וזורקים PBS. להוסיף 150 μl של חיץ מחייב 1x Annexin V אל הצינור, מחדש להשעות את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של Phycoerythrin (PE) מצומדות פתרון Annexin V ו- 1 μl של D 7-aminoactinomycin (7AAD) הפתרון הצינור, לערבב אותם היטב, דגירה הצינור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. נתח את המדגם באמצעות cytometer זרימה 24. </li></ol>

<ol><li>Scherer, L., Rossi, J. J. Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScherer%2C+L+%22RNA+and+the+Regulation+of+Gene+Expression%3A+A+hidden+layer+of+complexity%22">RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity</a>. Morris, K. V. , Caister Academic Press. 201-226 (2008).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease+to+four-base-recognizing+RNA+cutters%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Conversion of mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease to four-base-recognizing RNA cutters.</a> Nucleic Acids Res. 23, 3642-3647 (1995).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+cleavage+of+target+RNAs+from+HIV-1+with+5%E2%80%B2+half+tRNA+by+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5′ half tRNA by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> RNA. 2, 523-534 (1996).</li>
<li>Nashimoto, M., Geary, S., Tamura, M., Kasper, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+heptamers+that+directs+RNA+cleavage+by+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 26, 2565-2571 (1998).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anomalous+RNA+substrates+for+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Anomalous RNA substrates for mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> FEBS Lett. 472, 179-186 (2000).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+candidate+prostate+cancer+susceptibility+gene+encodes+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 31, 2272-2278 (2003).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+half-domain+of+the+long+form+of+tRNase+Z+is+required+for+the+RNase+65+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity.</a> Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+four-base-recognizing+RNA+cutter+that+can+remove+the+single+3%E2%80%B2+terminal+nucleotides+from+RNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3′ terminal nucleotides from RNA molecules.</a> Nucleic Acids Res. 32, e91(2004).</li>
<li>Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T+loop+structure+is+dispensable+for+substrate+recognition+by+tRNase+ZL%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL.</a> J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).</li>
<li>Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N., Daikuhara, Y., Ochi, K., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+mRNA+cleavage+by+3%E2%80%B2+tRNase+under+the+direction+of+2%E2%80%B2-O-methyl+RNA+heptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Intracellular mRNA cleavage by 3′ tRNase under the direction of 2′-O-methyl RNA heptamers.</a> Nucleic Acids Res. 31, 4354-4360 (2003).</li>
<li>Habu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HIV-1+gene+expression+by+retroviral+vector-mediated+small-guide+RNAs+that+direct+specific+RNA+cleavage+by+tRNase+ZL%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL.</a> Nucleic Acids Res. 33, 235-243 (2005).</li>
<li>Nakashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-silencing+by+the+tRNA+maturase+tRNase+ZL+under+the+direction+of+small+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA.</a> Gene Ther. 14, 78-85 (2007).</li>
<li>Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+vascular+endothelial+growth+factor+expression+by+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 924-927 (2009).</li>
<li>Sano, T., Takahashi, M., Nozaki, T., Takahashi, Y., Tamura, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+utility+of+heptamer-type+sgRNA+for+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 427-432 (2011).</li>
<li>Iizuka, S., Oridate, N., Nashimoto, M., Fukuda, S., Tamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+inhibition+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cells+by+sgRNA+targeting+the+cyclin+D1+mRNA+based+on+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing.</a> PLoS One. 9 (114121), (2014).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+specific+miRNAs+by+naked+14-nt+sgRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Elimination of specific miRNAs by naked 14-nt sgRNAs.</a> PLoS One. 7 (38496), (2012).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+naked+RNA+heptamer+targeting+the+human+Bcl-2+mRNA+induces+apoptosis+of+HL60+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells.</a> Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).</li>
<li>Watanabe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+apoptosis+of+leukemic+cells+by+TRUE+gene+silencing+using+small+guide+RNAs+targeting+the+WT1+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA.</a> Leukemia Res. 37, 580-585 (2013).</li>
<li>Elbarbary, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gene+expression+by+human+cytosolic+tRNase+ZL+through+5%E2%80%B2-half-tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA.</a> PLoS One. 4, 5908(2009).</li>
<li>Elbarbary, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytosolic+tRNase+ZL+can+downregulate+gene+expression+through+miRNA%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA.</a> FEBS Lett. 583, 3241-3246 (2009).</li>
<li>Ninomiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+small+guide+RNAs+for+tRNase+ZL+from+human+plasma%2C+peripheral+blood+mononuclear+cells%2C+and+cultured+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Potential small guide RNAs for tRNase ZL from human plasma, peripheral blood mononuclear cells, and cultured cell lines.</a> PLoS One. 10, 0118631(2015).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+a+heptamer-type+sgRNA+library+for+potential+therapeutic+agents+against+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies.</a> Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).</li>
<li>Solid-phase oligonucleotide synthesis. ATD Bio. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis">http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis</a> (2015).</li>
<li>FACSCalibur Instructions For Use. BD Bio. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf">http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf</a> (2007).</li>
<li>Shivarov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRUE+gene+silencing+for+hematologic+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">TRUE gene silencing for hematologic malignancies.</a> Leukemia Res. 38, 729(2014).</li>
</ol>

לאוניברסיטת ניאיגטה לרוקחות ומדעי החיים היישומיים יש בקשת פטנט תלויה ועומדת על תת-קבוצה של sgRNAs מסוג הפטמר.

ברוב המקרים, sgRNA מסוג הפטמר עם מתילציה של 2'-O, 5' ו-3' זרחניים מומסים במים להזרקה (בריכוז של 100 מיקרומטר) נראים יציבים מתחת ל-20 מעלות צלזיוס למשך שנה אחת לפחות, אם לשפוט על פי פעילותם לגרימת אפופטוזיס בתאים סרטניים. עם זאת, היציבות שלהם תשתנה בהתאם לרצף, לאיכות ולטוהר שלהם. במקרים מסוימים, נראה כי 5′ או 3′-פוספט של חלק ממולקולות sgRNA מוסרים באופן ספונטני במהלך האחסון, אם לשפוט על פי ניתוח ספקטרומטריית מסה, אם כי ייתכן שהדבר לא ישפיע על פעילותם ברצינות.
כאשר sgRNA להיט מתקבל על י...

להשתקת גנים TRUE (כינה לאחר L TR Nase Z - u tilizing להשתקת גנים דואר fficacious) היא אחת הטכנולוגיות להשתקת גנים מכוונת RNA 1. טכנולוגיה זו פותחה על בסיס מאפיינים של tRNase Z L (או 3 &#39;tRNase), tRNA 3&#39; endoribonuclease עיבוד: זה יכול לבקע כל RNA יעד בכל אתר צפוי בניהולו של RNA מדריך הקטן מלאכותי (sgRNA) על ידי הכרה טרום tRNA דמוי או מבנה מיקרו-טרום tRNA דמוי שנוצר בין RNA היעד ואת sgRNA 2 - 9. sgRNA, שהיא בדרך כלל 7-31 NT אורך, הוא מסווג לארבע קבוצות, 5&#39;-חצי-tRNA, RNA heptamer, RNA ליניארי 14-NT, ו- RNA וו. אנחנו הוכחנו את היעילות של להשתקת גנים נכון על ידי החדרת sgRNAs המלאכותית מעוצב השונה לתוך תאי חי 10 - 15. גם הראינו כי sgRNAs יכול להיות נלקח על ידי Wi תאיםthout כל ריאגנטים transfection ויכול downregulate רמות RNA היעד שלהם ו / או לגרום אפופטוזיס בתאי סרטן אנושי 16 - 18. להשתקת גנים TRUE מופיע לעבוד על תאיים ומערכת רשת גנטית אינטר באמצעות tRNase Z L ו- sgRNAs טבעי 19 - 21. בנינו ספריית sgRNA המכילה 156 sgRNAs heptamer מהסוג לחפש sgRNAs heptamer מהסוג טיפולי פוטנציאל סרטני דם 22. יש לנו הוקרן אותה ההשפעה על יכולת הקיום של תאים מיאלומה ולוקמיה אדם, ומצאו כי 20 מהם יכול לגרום ביעילות אפופטוזיס לפחות אחד שורות תאים סרטניים. ו -4 מהם הוכחו להפחית את שיעורי צמיחת גידולים בניסויים xenograft העכבר. כאן אנו מציגים פרוטוקול להקרנה של ספריית sgRNA heptamer מסוג עבור תרופות טיפוליות פוטנציאל נגד סרטן הדם. הפרוטוקול כולל איךכדי לבנות את הספרייה sgRNA, איך להעריך את ההשפעה של כל sgRNA על כדאיות התא, וכיצד להעריך עוד יותר את sgRNAs יעיל על ידי cytometry הזרימה. ניתוח עבור RNAs היעד הסלולרי של sgRNA והערכת sgRNAs יעיל במודלים xenograft העכבר יכול להתבצע על פי שיטות קונבנציונליות 17,22, אם כי אלה אינם נכללים בפרוטוקול זה.

<table><tbody><tr><td>מותאם אישית heptamer RNA</td><td>Nippon Bioservice</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OligoSep Prep HC מחסנית</td><td>Transgenomic</td><td>99-3860</td><td></td></tr><tr><td>מים להזרקה בדרגת מים</td><td>Otsuka Pharmaceutical&nbsp;</td><td>7131400A2129</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 בינוני</td><td>Wako</td><td>189-02025</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>172012-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין תמיסה מעורבת</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>96 באר צלחת</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>655 180</td><td></td></tr><tr><td>ערכת ספירת תאים-8</td><td>DOJINDO</td><td>343-07623</td><td>WST-8 פתרון</td></tr><tr><td>קורא מיקרופלייט, זריחה תרמו RC-R</td><td>TEKAN</td><td>510-82851</td><td></td></tr><tr><td>FACS צינור תחתון עגול</td><td>BD Falcon</td><td>60819-820</td><td></td></tr><tr><td>פוספט מאגר מלח</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P7059-1L</td><td></td></tr><tr><td>PE Annexin V מאגר מחייב</td><td>BD Biosciences</td><td>51-66121E</td><td></td></tr><tr><td>PE Annexin V</td><td>BD Biosciences</td><td>51-65875X</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A9400-1MG</td><td></td></tr><tr><td>ציטומטר זרימה, FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td>342973</td><td></td></tr></tbody></table>

ג&#39;ין השתקה נכונה: הקרנת ספריית rna מדריך heptamer מסוג small בתרופות סרטן פוטנציאליות

TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents

להשתקת גנים TRUE (כינה לאחר L TR Nase Z - u tilizing להשתקת גנים דואר fficacious) הוא אחד של הגן מכוונת RNA ההשתקה טכנולוגיות, אשר מנצל RNA מדריך קטן מלאכותית (sgRNA) להנחות endoribonuclease עיבוד &#39;tRNA 3, tRNase Z L , להכיר RNA היעד. sgRNAs יכול להיות נלקח על ידי תאים ללא כל ריאגנטים transfection ויכול downregulate רמות RNA היעד שלהם ו / או לגרום אפופטוזיס בתאי סרטן אנושיים. יש לנו הוקרנתי ספריית sgRNA המכילה 156 sgRNAs heptamer מהסוג להשפעה על כדאיות של תאי מיאלומה ולוקמיה אדם, ומצאתי כי 20 מהם יכולים לגרום ביעילות אפופטוזיס לפחות אחד שורות התאים הסרטניים. כאן אנו מציגים פרוטוקול להקרנה של ספריית sgRNA heptamer מסוג עבור תרופות טיפוליות פוטנציאל נגד סרטן הדם. הפרוטוקול כולל כיצד לבנות את הספרייה sgRNA, איך להעריך את ההשפעה של כל sgRNA על כדאיות התא, וכיצד פוrther להעריך את sgRNAs יעיל על ידי cytometry הזרימה. כ -2,000 כניסות תהיינה צפויות להיות מושגת על ידי הקרנת ספריית sgRNA בהיקף מלא מורכבת 16,384 heptamers.

ששת sgRNAs heptamer מסוג 5&#39;-AUCUUCA-3 &#39;(H1885), 5&#39;-ACACACA-3&#39; (H3277), 5&#39;-GGGGGCG-3 &#39;(H10927), 5&#39;-GGGGCCC-3&#39; (H10944), 5&#39;-GCCCCCG-3 &#39;(H12287), 5&#39;-CACCAGC-3&#39; (H13260) היו מסונתז כימית כמו 2&#39;- O -methyl RNA המכיל 5&#39;- ו 3&#39;-פוספטים. sgRNAs אלה נבדקו ההשפעות על הכדאיות של שורת תאים לוק...

כאן אנו מציגים פרוטוקול להקרנה של ספריית sgRNA heptamer מסוג עבור תרופות טיפוליות פוטנציאל נגד סרטן הדם.

ג&#39;ין השתקה נכונה: הקרנת ספריית RNA מדריך Heptamer מסוג Small בתרופות סרטן פוטנציאליות

TRUE gene silencing (termed after tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing) is one of the RNA-directed gene silencing technologies, which utilizes ...

המטרה הכללית של סריקה זו היא למצוא תרופות טיפוליות פוטנציאליות נגד סרטני דם. התחילו את הפרוצדורה בבחירת תת-קבוצה של רצפי Heptamer. הרצפים יכולים להיות אקראיים, או להיות own מתוכננים כדי להכווין ל-RNAs תאיים ספציפיים. כדי להכווין ל-RNAs תאיים ספציפיים, השתמשו בתוכנת מחשב מתאימה כדי למצוא מבני סיכת ראש (hairpin) הדומים ל-T-arm ב-RNA מטרה. בחרו רצפים משלימים של שבעה נוקליאוטידים מיד במורד הזרם (downstream) של סיכת הראש. באמצעות שיטת הפוספוראמידאית על זכוכית בעלת נקבים מבוקרים, או תמיכת CPG, סנתזו כל אחד מה-Heptamers שנבחרו כ-RNA עם 2-prime O-methylation מלא, ופוספורילציה ב-5-prime וב-3-prime, באמצעות מסנתז DNA-RNA. השאירו את קבוצת ההגנה DMT בקצה ה-5-prime במחזור האחרון של הסנתזה. לאחר השלמת המחזור האחרון, העבירו את ה-CPG עם האוליגנוקלאוטיד המסונתז מהעמודה לבקבוק זכוכית עם מכסה הברגה מצופה טפלון. הוסיפו 1mL של 29% ammonium hydroxide והדגרירו את המבחנה ב-55

true-gene-silencing-screening-heptamer-type-small-guide-rna-library

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

כאן אנו להשתמש בספריית esiRNA האדם המסך תפוקה גבוהה עבור גנים המעורבים חלוקת התא. אנו מדגימים כיצד להקים ולנהל מסכי esiRNA, וכן כיצד לנתח ולאמת את התוצאות.

המשימה esiRNA עבור הקרנת RNAi בתאי יונקים

כאן אנו להשתמש בספריית LentiPlex האנושי ונקווה המסורתית רצף שיטות לזיהוי מטרות הגן לקידום הישרדות התא. אנו מדגימים כיצד להגדיר deconvolute מסך LentiPlex ולאמת את התוצאות.

LentiPlex המשימה משולב הקרנת shRNA ספריית בתאי יונקים

התערבות RNA (RNAi) הוא בעל יתרונות רבים על פני בנוקאאוט הגן נעשה שימוש נרחב ככלי במחקרים גנים תפקודיים. המצאת ה-DNA וקטור מבוססי RNAi הטכנולוגיה הפכה לטווח ארוך הגן מושרה מציאה אפשרי, גם הגדילה את הכדאיות של השתקת...

וקטור מבוסס DNA התערבות RNA ללמוד לתפקד גנים סרטן

השגת הבנה ברמת מערכות של תהליכים תאיים היא מטרה של ביולוגיה של התא המודרנית. אנו מתארים כאן אסטרטגיות לכתבי לוציפראז ריבוב של תפקוד תאי שונים נקודות קצה לחקור את תפקוד גן באמצעות הגנום בקנה מידה ספריות RNAi.

פלטפורמת הקרנה מבוססת לוציפראז Multiplexed לחקירת מלחמה בסרטן הקשורים להעברת אותות בתאים בתרבית

כאן אנו מתארים בדיקת גן מדווח מבוססת תאים ככלי רב ערך לסינון ספריות כימיות עבור תרכובות המווסתות מנגנוני בקרה פוסט-שעתוק המופעלים באמצעות 3' UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

כאן נתאר פרוטוקול להעסקת תפוקה גבוהה ההקרנה RNAi לחשוף את מטרות המארח יכול להיות מניפולציות כדי לשפר את הטיפול וירוס oncolytic, במיוחד rhabodvirus וטיפול וירוס vaccinia, אבל ניתן בקלות להתאים oncolytic אחרים וירוס פלטפורמות או לגילוי גנים המארח לווסת את שכפול וירוס בדרך כלל.

ברמת הגנום RNAi ההקרנה כדי לזהות גורמים מארח לווסת את הטיפול Oncolytic וירוס

ספרייה CRISPR/sgRNA הוחל כדי לחקור חלבונים. עם זאת, הכדאיות של ספרייה sgRNA לחשוף את הפונקציה של גבול CTCF ב הכונה נשאר נחקרו. כאן, אנו מתארים ספרייה ספציפית sgRNA לוקוסים HOX התירי את הפונקציה של גבולות CTCF HOX לוקוסים.

HOX לוקוסים Focused CRISPR/sgRNA ספריית הקרנת זיהוי קריטי CTCF גבולות

CRISPR-Cas9 הטכנולוגיה מספקת שיטה יעילה בדיוק לערוך את הגנום היונקים בסוג תא כלשהו ומייצג את האמצעים הרומן לבצע מסכי גנטי רחב הגנום. פרוטוקול מפורט לדון בצעדים הנדרשים עבור ביצועים מוצלחים של מסכי CRISPR-Cas9 הגנום הרחב מסופק כאן.

מסכי גנטי מבוססי CRISPR במאגר תאים ממיונקים

כדי לזהות והרגולטורים הרומן של גורמי שעתוק, פיתחנו גישה למסך מסודר או לספריות RNAi ויראלי באמצעות שימוש כפול-לוציפראז מבוסס מבוססת הכתב. גישה זו מציעה דרך מהירה וזולה יחסית להקרין מאות מועמדים בניסוי אחד.

זיהוי של שעתוק מקדם ווסת באמצעות הקרנת תפוקה בינונית של ספריות מסודר וכתבת המבוססת על כפול-לוציפראז

בדיקת הפרעות RNA בתפוקה גבוהה (RNAi) באמצעות מאגר של shRNA לנטי-ויראליים יכולה להיות כלי לאיתור מטרות קטלניות סינתטיות רלוונטיות מבחינה טיפולית בממאירות. אנו מספקים גישת סינון shRNA משולבת כדי לחקור את האפקטים האפיגנטיים בלוקמיה מיאלואידית חריפה (AML).

הקרנה משולבת של ספריית shRNA לזיהוי גורמים המווסתים פנוטיפ עמידות לתרופות

פיתחנו גישה אונקוגנומית השוואתית חוצת מינים המשתמשת בניתוחים גנומיים ובמסכים גנומיים פונקציונליים כדי לזהות ולהשוות מטרות טיפוליות בגידולים הנובעים ממודלים של עכברים מהונדסים גנטית וסוג הגידול האנושי המתאים.

פרופיילינג גנטי וסינון נשירה בקנה מידה גנומי לזיהוי מטרות טיפוליות במודלים עכבריים של גידול ממאיר במעטפת עצב היקפית

למד פרוטוקול לסינון ספריית sgRNA מסוג heptamer לזיהוי תרופות פוטנציאליות לסרטני דם. שיטה זו מאפשרת זיהוי מהיר של מועמדים תרפויטיים באמצעות עריכת גנים מכוונת.

ג'ין השתקה נכונה: הקרנת ספריית RNA מדריך Heptamer מסוג Small בתרופות סרטן פוטנציאליות

גלה סרטונים נוספים