מרת אפיגנטיים כאמצעי בטוח ופשוט להשיג תאי מפרישי אינסולין פיברובלסטים עור בוגרים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להמיר פיברובלסטים לתאים מפרישי אינסולין מבלי לגרום לפלוריפוטנטיות או להשתמש בווקטורים רטרו-חיוניים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הרפואה הרגנרטיבית ובפרט בטיפול תאי בסוכרת. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים להשיג מתג בפנוטיפ מבלי לגרום למצב פלוריפוטנטי יציב בתאים הממירים וללא וקטורים רטרו-ויראליים.

מי שתדגים את ההליך תהיה ג'ורג'יה פנרוסה, פוסט-דוקטורנטית במעבדה שלנו. כדי להתחיל בהליך זה, הוסף 1.5 מיליליטר ג'לטין חזיר סטרילי של 0.1% לצלחות הפטרי בגודל 35 מילימטר ואפשר ציפוי למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את ביופסיות עור האדם עם PBS בתוספת תמיסת אנטי-פטריית אנטיביוטית 2%.

לאחר מכן, הניחו את הביופסיות בצלחת פטרי בגודל 100 מילימטר וחתכו אותן לשברים של כשני מילימטר מעוקב בעזרת אזמלים סטריליים. לאחר מכן, הניחו חמישה עד שישה שברי עור בצלחת הפטרי המצופה מראש בגודל 35 מילימטר. הוסף טיפה של מדיום פיברובלסטים על כל שבר ותרבית אותם ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני.

לאחר שישה ימי דגירה, השליכו את שברי הרקמה בזהירות. הפיברובלסטים צריכים להתחיל לצמוח מתוך שברי הרקמה ולהתחיל ליצור חד-שכבת תאים. בהליך זה, תרבית הפיברובלסטים ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני עד למפגש של 80%.

לאחר מכן צלחת את התאים בכלי תרבית חדשים. תרבו אותם ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני ושמרו על יחס המעבר בין אחד לשניים ואחד לארבע, תלוי בקצב הגידול. לאחר מכן, הוסיפו 0.1% ג'לטין חזיר לכלי תרבית התאים ואפשרו ציפוי למשך שעתיים.

הסר את תמיסת הציפוי העודפת 10 עד 30 דקות לפני ציפוי הפיברובלסטים. לאחר מכן, הסר את מדיום תרבית הפיברובלסטים מכלי התרבות. שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS בתוספת תמיסת אנטי-פטריית אנטיביוטית 1%.

לאחר מכן, הוסף שכבה דקה של תמיסת Trypsin-EDTA. דגרו אותו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד ששכבת התא החד-שכבתית מתחילה להתנתק מתחתית צלחת תרבית הרקמה והתאים מתנתקים. לאחר מכן, יש לדלל את תרחיף התאים בתשעה חלקים של מדיום תרבית פיברובלסטים על מנת לנטרל את פעולת הטריפסין.

לאחר מכן, ספרו את התאים באמצעות תא ספירה מתחת למיקרוסקופ בטמפרטורת החדר. חשב את נפח מדיום תרבית הפיברובלסטים הנדרש כדי להשעות מחדש את התאים ולהשיג את ריכוז התאים של 7.8 כפול 10 לפיברובלסט הרביעי לסנטימטר מרובע. לאחר מכן, צנטריפוגה את תרחיף התא ב -150 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את התאים בנפח מחושב של מדיום תרבית פיברובלסטים. לאחר מכן, צלחו את התאים על הכלים המצופים מראש בג'לטין 0.1% ותרבו אותם במשך 24 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני. ביום האפס, מיד לפני השימוש, הכינו תמיסת מלאי 5-aza-CR על ידי המסת 2.44 מיליגרם של 5-aza-CR ב-10 מיליליטר של מדיום גלוקוז גבוה DMEM.

עקר אותו על ידי סינון. לאחר מכן, יש לדלל מיקרוליטר אחד של תמיסת מלאי 5-aza-CR במיליליטר אחד של מדיום תרבית פיברובלסטים. כדי להגביר את הפלסטיות של התאים, 24 שעות לאחר ציפוי התא הסר את מדיום התרבות מהפיברובלסטים הזרעים.

הוסף תמיסת מלאי מיקרו-מולרית אחת 5-aza-CR, ותרבת במשך 18 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני. ביום הראשון, הכינו מדיום HP טרי. לאחר הדגירה עם מיקרו-מולרי אחד 5-aza-CR, הסר את המדיום ושטוף את התאים שלוש פעמים עם מדיום HP כדי להבטיח ש-5-aza-CR נשטף.

לאחר מכן, יש להטמיע את הפיברובלסטים שטופלו ב-5-aza-CR עם מדיום HP למשך שלוש שעות ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני. כדי לעקוב אחר יעילות הטיפול ב-5-aza-CR, בדוק אם יש שינויים מורפולוגיים. תאים צריכים לאבד את המורפולוגיה המוארכת האופיינית של פיברובלסטים ולרכוש צורה עגולה או אליפסה קטנה יותר עם גרעינים מוגדלים.

בימים הראשון עד השישי, הכינו את תמיסת הבסיס של הלבלב ו-Activin A. לאחר מכן, תרבית את הפיברובלסטים שטופלו ב-5-aza-CR במדיום הבסיסי של הלבלב בתוספת תמיסת מלאי Activin A למשך שישה ימים ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני והחליפו את המדיום מדי יום. בימים השביעי עד השמיני, הכינו תמיסת מלאי של חומצה רטינואית על ידי הוספת 16.6 מיליליטר של DMSO ל-50 מיליגרם של חומצה רטינואית.

תרבית התאים במדיום הבסיס של הלבלב בתוספת תמיסת מלאי Activin A ותמיסת מלאי חומצה רטינואית למשך יומיים ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני והחלף את המדיום מדי יום. בימים 9 עד 36, תרבית התאים והמדיום הבסיסי של הלבלב בתוספת תמיסת מלאי ITS, B27 ו-BFGS והחלף את המדיום מדי יום במשך 15 הימים הראשונים ורענן את המדיום כל יומיים מהיום ה-16 ואילך. תרבית התאים ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני.

איור זה מציג את השינויים המורפולוגיים המתרחשים במהלך התמיינות הלבלב האנדוקרינית. לאחר שבעה ימים של אינדוקציה, תאים אנושיים מתארגנים בהדרגה באשכולות. בתגובה לתוספת של חומצה רטינואית, הם מתארגנים מחדש בתבנית רשתית ומתקבצים באגרגטים הניתנים להבחנה.

תצורות אלה מתקדמות עם הזמן, מגייסות תאים וצוברים מושבות תלת-ממדיות מוגדלות. לבסוף, מושבות הופכות למבנים כדוריים הנוטים להתנתק ולזרום בחופשיות במדיום התרבותי, המזכירים איי לבלב טיפוסיים במבחנה. לאחר 36 ימים של אינדוקציה בלבלב, רמות המתילציה הגלובליות של DNA של תאים מומרים אפיגנטיים אנושיים חזרו לאלו שנצפו בפיברובלסטים הלא מטופלים.

הלוקליזציה המשותפת של PDX1 עם CPEP נצפית בסוף תקופת ההמרה, בעוד שסמני הלבלב האנדוקריניים הללו נעדרים לחלוטין בפיברובלסטים לא מטופלים. גרף זה מציג את כמות שחרור האינסולין מהתאים המומרים האפיגנטיים בתגובה לחשיפה של 20 מילי-גלוקוז D ו-20 מילי-מולרית L-גלוקוז. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 38 יום אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר פיתוחו, מחקר זה סלל את הדרך לחוקרים בתחום הרפואה הרגנרטיבית לחקור את הטיפול התאי בסוכרת בבני אדם. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד להמיר פיברובלסטים לתאים המפרישי אינסולין מבלי לגרום לפלוריפוטנטיות או להשתמש בווקטורים רטרו-ויראליים.