זיהוי של תנאים קריטיים לImmunostaining באפונה בכנימות עוברים: הגדלת רקמות חדירות והפחתת מכתים רקע

המטרה הכללית של פרוטוקול צביעה אימונוהיסטוכימית זה היא לזהות ביטוי חלבוני בעוברי כינים. זוהו תנאים קריטיים המגבירים את חדירות הרקמה ומפחיתים את צביעת הרקע, שניהם מהווים בעיות רב-שנתיות בעת צביעת רקמות עובריות של כינים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת תנאים ספציפיים לחדירה יעילה של נוגדנים ולהפחתת צביעת הרקע, תנאים שבדרך כלל אינם מתוארים בפרוטוקול סטנדרטי לצביעה אימונוהיסטוכימית.

ראשית, עלה בדעתנו להשתמש במדד זה כאשר חקרנו כיצד נקבעים תאי הנבט בכנין השעורה, זן של חרק המשמש כמודל למחקרי גנומיקה ומחקרים סביבתיים. זן המעבדה של כנין השעורה, *A. pisum*, נאסף במקור ממסרוע טייוואן, וגודל על צמחי מאכסן במשך יותר מ-300 דורות.

להנבטה, השרו את זרעי צמחי העממי במי ברז למשך שלושה עד חמישה ימים בטמפרטורת החדר. החליפו את המים במים טריים פעם ביום. גדלו עשרה זרעים מנביטים בעציץ קטן עם מצע דגמון בתא גידול תחת מחזור תאורה של 16 שעות אור ושמונה שעות חושך, בטמפרטורה של 20 °C.

כ-10 ימים לאחר תחילת הצמיחה, גובה הצמחים הוא בדרך כלל יותר משמונה סנטימטרים. החזיקו כל עציץ של צמחים בתוך ביקר זכוכית של 1 liter והעבירו כינימנים בוגרים אל הצמחים באמצעות מכחול. לאחר מכן, אטמו את הביקר עם כיסוי חדיר לאוויר, כגון רשת גזה, כדי למנוע מהכינימנים לברוח.

דגרו את הכנימות בתא גידול תחת מחזור תאורה של 16 שעות אור ושמונה שעות חושך, בטמפרטורה של 20 degrees Celsius, תוך השקיית כל עציץ פעם ביום. מלאו באר אחד של פלטת נקודות בכ-500 microliters של 4 percent paraformaldehyde. הניחו את הפלטה תחת מיקרוסקופ סטריאוס בהגדלה נמוכה, ושקעו כנימה בוגרת לתוך ה-paraformaldehyde לצורך נתיחה.

בצעו דיסקציה לשחלות על ידי החזקת הראש והבטן עם סט אחד של פינצטות, חיתוך של הקוטיקולה הגבית של הבטן וגרירת השחלות החוצה מחלל הבטן. לאחר מכן, קבעו שלושה זוגות של שחלות בתוך מבחנה של 1.5 מיליליטר המכילה מיליליטר אחד של פאראפורמאלדהיד בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, תוך ניעור קל על שייקר. השליכו את תמיסת הקיבוע באמצעות טפטוף זכוכית, ולאחר מכן שטפו את השחלות עם PBST שלוש פעמים למשך 10 דקות, תוך ניעור קל.

כדי לטפל בשחלות, ראשית הדגרי אותן עם Proteinase K למשך 10 דקות עם ניעור קל כדי להגביר את חדירות הרקמות העובריות. לאחר ההדגרה, השליכי את תמיסת ה-Proteinase K, ולאחר מכן שטפי את השחלות עם 700 µL של glycine שלוש פעמים למשך חמש דקות. לאחר מכן, שטפי את השחלות עם PBST פעמיים למשך 10 דקות.

קבעו שוב את השחלות באמצעות תמיסת קיבוע למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין. כדי לדכא את פעילות הפרוקסידאז האנדוגנית, בצעו דהידרציה סדרתית לשחלות באמצעות ריכוזים שונים של methanol ב-0.2 אחוז PBST ביחסי נפח של אחד לשלוש, אחד לאחד ושלוש לאחד, ולאחר מכן דגרו את השחלות עם 100 אחוז methanol למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין. לאחר מכן, בצעו רהידרציה סדרתית לשחלות, כפי שהודרך בפרוטוקול הכתוב.

עבור שלושה זוגות של שחלות בתוך מבחנה של 1.5 milliliter, נפח של 200 microliters הוא הנפח המינימלי לחסימת הדגימות ולצביעה בנוגדנים. דגרו את השחלות עם תמיסת חסימה 1x DIG-B למשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר, או למשך הלילה בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius, תוךما ניעור עדין. לאחר הדגירה, השליכו את העליון והחליפו אותו בתמיסית חסימה 1x DIG-B טרייה, המכילה את הנוגדן הראשוני ביחס הדילול המתאים.

צבעו את השחלות במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר, או למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס תוך써 ניעור מתון. לאחר שטיפת השחלות כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, השליכו את הנוזל העליון והחליפו אותו בתמיסת חסימה 1x DIG-B טרייה המכילה את הנוגדן המשני ביחס הדילול המתאים, וצבעו את השחלות כפי שנעשה קודם לכן. לצביעה אימונופלואורסצנטית, בצעו את הצביעה בחושך, כיוון שהנוגדן המשני רגיש לאור.

עוביהם של עוברים של כנימות משתנה בין שלבי ההתפתחות. לפיכนั้น, אסטרטגיות הסמיכה מותאמות לעוברים בשלבים מוקדמים, בינוניים ומאוחרים. העבירו את השחלות, יחד עם תמיסת הסמיכה, לתבנית התאים באמצעות טפטפת פלסטיק, ובחנו את הדגימות תחת מיקרוסקופ סטריאומטרי בהגדלה נמוכה.

גזרו את הקלוס (calluses) הקשור לצינור הביצים (oviduct) הצדדי באמצעות סיכות לחרקים, ולאחר מכן העבירו אווריולה (ovariole) מבודדת לבאר זכוכית ריקה באמצעות פיפטה. השלימו את הנפח הסופי ל-50 עד 100 µL באמצעות מדיום קיבוע. לאחר מכן, העבירו אווריולה לעל תיתורה באמצעות פיפטת זכוכית.

בצעו דיסקציה של תאי הביצה (egg chambers) באמצעות סיכות לחרקים. עבור עוברים בשלב התפתחותי מאוחר יותר משלב שש, מומלץ לבצע הפרדה של תאי הביצה. עבור הגרמריה (germaria) ושני תאי הביצה הראשונים, ההפרדה היא רשות.

העבירו לשקף נקי תא ביצה שבוצע באמצעות טפטפת זכוכית. עבורו Embryos בשלבי התפתחות 1 עד 10, הניחו באיטיות זכוכית כיסוי על הגרמאריום (germarium) או על תאי הביצה שבוצע כדי למנוע היווצרות בועות. לחלופין, עבור Embryos בשלבי התפתחות 11 עד 18, קבעו את תאי הביצה על שקף באמצעות גשר של זכוכית כיסוי חד-צדדית, והניחו זכוכית כיסוי נוספת מעל הדגימה.

עבור עוברים הגדולים משלב התפתחות 19, קבעו את תאי הביצים על גבי זכוכית כיסוי עם גשר של דבק דו-צדדי, והניחו זכוכית כיסוי נוספת מעל הדגימה. לאחר מכן, מלאו את החלל שמתחת לזכוכית הכיסוי העליונה בתמיסת קיבוע כדי למנוע את התייבשות הדגימה. גלגלו בעדינות את זכוכית הכיסוי העליונה כדי להשיג את הכיוון הנכון לצפייה.

לבסוף, לפני ביצוע ניתוח התמונות, יש לאטום את שולי זכוכית הכיסוי, כולל זכוכיות הכיסוי של הגשר, באמצעות לק לציפורניים, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. מוצג כאן זוג שחלות שהופקו מנקבה בוגרת. אובריולה (ovariole) מורכבת מג'רמריום (germarium) אחד, אתר O אחד עד שניים, ובנוסף חמישה עד שבעה עוברים, כאשר כולם שוכנים בתוך תאי ביצים בדומה לפס ייצור.

לאחר קיבוע בפראלדהיד, מומלץ מאוד לבצע עיכול של השחלות בתמיסת Proteinase K בריכוז של one microgram per milliliter למשך 10 דקות. תוצאות הצביעה מראות כי עוצמת האות גבוהה משמעותית בעוברים שעברו עיכול ב-Poteinase K. הדגרה של עוברים בתמיסת חסימה מתוך ערכה של בופר מבוסס-DIG מפחיתה צביעת רקע רבה יותר מאשר הדגרה של עוברים בסרום עיזים נורמלי ובאלבומין משרת בקר (bovine serum albumin).

פעילות אנדוגנית של פראוקסידאז עלולה לגרום גם היא לצביעה של רקע גבוה. מחקרים אלו מגלים כי טבילת עוברים של כנימות במתנול יכולה לדכא את פעילות הפראוקסידאז ביעילות רבה יותר מאשר טיפול בעוברים במימן פראוקסיד. התנאים הקריטיים שנחשפו במחקר זה ניתנים ליישום לזיהוי אותים הן בתאי נבט והן בתאים סומטיים.

לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן לבצע אותה בתוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן ביצוע צביעה אימונוהיסטוכימית מוצלחת בעוברי כנימות, כולל הגברת עוצמת האות והפחתת צביעת הרקע. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לטפל בכל עובר בעדינות כדי לשמור על צורתו של העובר.

יש לזכור כי עבודה עם פראפורמלהיד (paraformaldehyde) ו-DAPI עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון ענידת כפפות, בעת ביצוע הליך זה. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע מדדים אחרים, כגון היברידיזציה במקום (in situ hybridization), על מנת לענות על שאלות נוספות, למשל האם mRNA ממוקם יחד עם מוצר החלבון שלו בתאי העובר. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה הסביבתית של חרקים, כגון כיצד נקבעים תאי הנבט, וכיצד נקבעות תאי הביצה בשלבים רבייתיים שונים בכינינים.