הקמת סרטן גזע תא תרבויות מן האדם הקונבנציונלי אוסטאוסרקומה

המטרה הכוללת של מאמר זה היא לבודד תאי גזע סרטניים מקו תאים סופי המתקבל מאוסטאוסרקומות אנושיות. היתרון העיקרי של עבודה זו הוא להראות בבירור לאחרים בתחום האונקולוגיה כיצד לבודד, במבחנה, תאי גזע סרטניים. לאחר מכן ניתן להשתמש בתאים אלה למחקר טיפולים נגד אוסטאוסרקומה וגידולים מוצקים אחרים.

בדרך כלל, אנשים חדשים בעניין זה יתקשו אם הם לא ידעו כיצד לבודד את מושבות הסרקומה. הדגמה ויזואלית של זה היא קריטית, מכיוון ששלב הבידוד קשה למימוש ולהבנה. הרעיון לטכניקה הזו עלה לנו לראשונה, כשקראנו על החיבור על היווצרות הכדור.

מתוארת על ידי גבס ומשתפי פעולה. ידגימו את ההליך ד"ר גאיה פלמיני, דוקטורנטית, וד"ר רוברטו זונפראטי, טכנאי מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, הכינו את כל מדיום התרבות הדרוש.

מאגרי עיכול ופתרונות אחרים שיידרשו להליך. לאחר מכן, קבע קו תאים סופי של אוסטאוסרקומה, על ידי בידוד אוסטאוסרקומה ממחט מאושרת או ביופסיה כירורגית. ותת-תרבית של התאים המתקבלים כמתואר במאמר הטקסט הנלווה.

לאחר הקמת תרבית תאי האוסטאוסרקומה, והצלחת קרובה למפגש. הסר את המדיום על ידי שאיפה, ונסה את התאים כדי לשחרר אותם מהצלחת. העבירו את התאים לצינור טרי והעבירו בעדינות את תרחיף התאים למעלה ולמטה על מנת לפזר גושי תאים.

לאחר מכן, אספו עשרה מיקרו-ליטר של תרחיף התאים, והעבירו אותו לתא המוציטומטר. הנח את תא ההמוציטומטר מתחת למיקרוסקופ ניגודיות פאזה וחשב את ריכוז התאים בתרחיף. לאחר מכן, הוסף 280,000 תאים ל-35 מיליליטר של מצע גידול סרקוספירה, המכיל מתוצלולוז, וערבב בעדינות את התמיסה באמצעות פיפטה, כדי לפזר גושים.

העבירו חמישה מיליליטר מתערובת התאים לכל באר של שש צלחות חיבור נמוכות במיוחד. לאחר הציפוי, השתמש במיקרוסקופ הפוך כדי לראות כיצד התאים נראים ואם הם מבודדים היטב. דגרו את התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, חמישה אחוזים של פחמן דו חמצני.

כל שלושה ימים, הוסף אלכוהולטים טריים של בטא FGF ו- EGF לכל באר כדי לרענן את ריכוז גורמי הגדילה. בחן את התקדמות בדיקת הסרקוספירה על ידי התבוננות בתאים מתחת למיקרוסקופ ב-7, 14, 20, 21 ו-28 ימים. כאשר אתם מתבוננים בנוכחותם של סרקוספירות שחורות גדולות, שנמצאות כולן יחד במרכז הבאר, הפסיקו את התרבות והתחילו בתהליך השממה.

כשהגיע הזמן לבודד את הסרקוספירה, השתמש בפיפטה סטרילית של 1,000 מיקרוליטר כדי להעביר את המדיום המכיל את הסרקוספירה למזרק עם מחזיק מסנן קרום סטרילי. לאחר הסרת המדיום המכיל את הסרקוספירה, הוסיפו לבאר חמישה מיליליטר של מדיום גידול ושטפו אותו בוודאות. ואסוף את כל הכדורים שנותרו.

לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ כדי לאשר אם כל הסרקוספרות שוחזרו. אם לא, יש לשטוף את הבאר שוב עד להשלמת איסוף הכדורים. לאחר מכן, סנן את המתלה דרך מחזיק מסנן הממברנה על ידי כוח הכבידה על מנת לא לפגוע בכדורים ולוודא שאף סרקוספרה לא עוברת דרך המסנן.

במהלך תהליך זה, הסר בועות אוויר בעדינות באמצעות פיפטת מרעה מזכוכית סטרילית. לאחר סינון כל הסרקוספרות, שטפו את יחידת הסינון על ידי הוספת עשרה מיליליטר של מצע גידול ישירות למזרק והניחו לו לסנן ללא לחץ כדי לוודא לחסל תאים בודדים. לאחר סינון השעיית הסרקוספירה, יש צורך להשליך את מסנן הנוזל ולשים לב ברצינות להתאוששות הסרקוספירות הסבוכות במסנן הרשת.

בשלב זה, קח חלק מיחידת המסנן והסר אותה מהמזרק. ומניחים אותו בצלחת פטרי של 100 מילימטר. הסר את מסנן הרשת ממחזיק מסנן הממברנה באמצעות זוג פינצטה סטרילית.

והעבירו את המסנן לצלחת פטרי חדשה בגודל 60 מילימטר. לאחר מכן, שטפו את מסנן הרשת על ידי ניעורו בעדינות. תוך הוספת חמישה מיליליטר של מצע גידול, על מנת לשחרר את הסרקוספירות מסבך הממברנה.

לאחר מכן, הניחו את הממברנה בבאר ואשרו על ידי תצפית מיקרוסקופית כי אין יותר כדורים סבוכים בקרום. שטפו שוב את הממברנה ואז בדקו שוב את הממברנה מתחת למיקרוסקופ אם עדיין יש כדורים סבוכים בקרום. כאשר לא נותרו עוד כדורים בקרום, דגרו אותם במדיום גידול כדי לגדל את הסרקוספירות לשכבה אחת.

עקוב אחר צמיחת תאי הגזע של סרטן האוסטאוסרקומה, המתקבלים מהסרקוספירה. עד שהתאים מגיעים לכ-90% מפגש, בצלחת פטרי של 60 מילימטר. בנוסף לפרוטוקולים העומדים הרבים שנמצאו במאמר זה, שיטות להערכת יכולת ההתמיינות, פעילות ALDH, ציטומטריית זרימה, אימונופלורסנציה וניתוח RTPCR, כלולות בפירוט בפרוטוקול הטקסט הנלווה.

דגימות אוסטאוסרקומה מתקבלות על ידי שאיבת מחט או חתך יתר כירורגי. ואם מטפלים כראוי, לוקח כחודש עד שהתרביות העיקריות יגיעו למפגש בצלחת פטרי של 100 מילימטר. לאחר ההתרחבות, התאים מצופים בשש לוחות חיבור נמוכים במיוחד, כדי להתחיל את בדיקת הסרקוספירה.

צלחת זו שומרת על התאים במצב תלוי, ומונעת את היצמדות השכבות. לאחר שבעה ימים נצפות כמה מושבות כדוריות קטנות המוקפות בתאים בודדים. ואחרי 28 יום נצפים כמה סרקוספרות גדולות.

ברגע שהמושבות הכדוריות מבודדות, ניתן להרחיב תאים סרטניים דמויי גזע מהסרקוספרות הבודדות על ידי הנחתם על לוחות חיבור רגילים. הכתמים האימונופלורסנטיים, הראו את תאי הגזע המזנכימליים כמו פנוטיפ שכן התאים המורחבים היו חיוביים ל-CD44 עבור CD105, וחיוביים במידה בינונית עבור Stro-1. RTPCR, גם הראה באופן חיובי את הפנוטיפ של תאי גזע עובריים על ידי ביטוי של שלושה גנים של סמני תאי גזע עובריים.

Nanog, 3/4 באוקטובר ו-Sox2. והגן CD133, סמן לתאי גזע של סרטן אוסטאוסרקומה. טכניקת הבידוד המפורטת שהצגנו בסרטון זה, תסלול את הדרך לחוקרים אחרים לחקור תאי גזע סרטניים על ידי כך שתראה להם כיצד להבין ולשחזר את השלבים הקריטיים ביותר של בדיקת היווצרות הכדור.

בדיקות מותאמות אלה הן טכניקה טובה לבידוד תאי גזע סרטניים, ולחקר הביולוגיה שלהם. חומר זה, עם התאמות נוספות, עשוי לשמש גם לבידוד תאי גזע סרטניים מקווי תאים סרטניים סופיים אחרים. מתקבל על ידי ביופסיות של גידולים מוצקים.

לסיכום, בידוד תאי גזע סרטניים ממספר סוגי גידולים, יאפשר לחקור את הביולוגיה שלהם. עם המטרה הסופית של מציאת מטרות מולקולריות ופיתוח טיפולים אנטי-סרטניים ספציפיים מאוד המכוונים נגד תת-קבוצות תאיות מסוימות.