בידוד ובידול של תאי גזע נגזר שומן מרקמות שומן תת עורי בשר חזירים

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד תאי גזע ממקור שומני מרקמות שומן לבן תת-עורי של חזיר, וזאת כדי להעריך את יכולתם להתמיין לאדיפוציטים מזנכימליים, אוסטאוציטים וכונדרוציטים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במחקר על השמנה. היא מהווה כלי יעיל לחשיפת המנגנונים המולקולריים המעורבים בוויסות התפתחות רקמת השומן.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לאסוף מספר רב של תאים סטרוווסקולריים, מה שמאפשר ניתוח מעמיק של ביולוגיה ודיפרנציאציה של אדיפוציטים. חשיבותה של טכניקה זו היא למחקר בתרפיה בתאי גזע, שכן תאי גזע המופקים מרקמת שומן של חזיר מראים מולטיפוטנציה ליכולת טרנס-דיפרנציאציה לקווי תאים מרובים. התחל במיקום הגור חזיר בעמדה הפוכה (prone) על שולחן ניתוחים נקי.

גלחו את כל הפרווה לאורך קו האמצע מהצוואר ועד הזנב, וקרצפו את העור הגבי ה-dorsal עם Povidone iodine בריכוז 7.5% שלוש פעמים. לאחר הקרצוף השלישי, השאירו את היוד על פני העור למשך כ-10 דקות. לאחר מכן, רססו את העור ב-70% ethanol.

השתמשו ברפידות גזה ספוגות באתנול כדי לנגב את העור בכיוון אחד להסרת החומר המחטא, עד שלא ייראה צבע ניכר. לאחר מכן, בצעו חתך מאזור הצוואר ומטה לכיוון הרגל. לאחר מכן, בעודכם מחזיקים את השומן והעור בעזרת פינצטה, השתמשו בסקלפל כדי להפריד את שכבת השומן הגבית של החזיר מרקמות השומן התת-עוריות ואת שכבת העור הסמוכה מהשרירים.

טבול מיד את רקמת העור והשומן בכלי כימי (beaker) סטרילי בנפח 200-milliliter, המכיל DMEM ללא סרום בטמפרטורה של 37-degrees Celsius, ורסס את החלק החיצוני של הכלי ב-70%ethanol. לאחר מכן, הנח את הכלי בתוך מבת תרביות תחת זרימה למינרית והנח לצדו כיסוי רב-שכבתי סטרילי מנייר אלומיניום בגודל 40 על 30-centimeter. העבר את הרקמה אל על נייר האלומיניום, כאשר העור פונה כלפי מטה.

השתמשו בפינצטה ובמספריים כדי להסיר את שאריות רקמת השריר מרקמת השומן. חתכו את השומן לחתיכות ריבועיות בגודל 7 על 7 סנטימטרים, ולאחר מכן העבירו את חתיכות השומן לכלי חמד (beaker) סטרילי חדש בנפח 200 מיליליטר המכיל DMEM ללא סרום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כעת, הניחו מחזיק פרוסות מותאם אישית, המצויד בלהב חיתוך מפלדת פחמן, על נייר האלומיניום המכסה, והניחו את אחת מחתיכות השומן עלו המכשיר כאשר שכבת השומן פונה כלפי מטה.

חתכו את השומן לפרוסות בעובי של כ-1 מילימטר, קרוב ככל האפשר לעור אך ללא חיתוך שלו. לאחר מכן, השתמשו במספריים כדי לקצוץ את חתיכות הרקמה השומנית לדוגמאות קטנות ככל האפשר, והוסיפו אותן לבקבוק ארלנמאייר של 250 מיליליטר המכיל תוכה לעיכול מסוננת המועשרת בקולגנאז. דגרו את הבקבוק עם ערבול למשך 90 דקות ב-45 RPM, במנער אורביטלי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

כאשר תווך העיכול הופך למישחה, ללא גושי רקמה משמעותיים, יש לעצור את העיכול על ידי הוספת נפח שווה של תווך תרבית המכיל DMEM F-12 עם 10%FBS. כדי לאסוף את התאי הגזע המופקים מרקמת שומן של חזיר, סננו את תרחיף רקמת השומן המעובדת דרך שכבה אחת של שיפון אל תוך בקבוק סרולוגי סטרילי בנפח 250 מיליליטר, תוך שימוש בפינצטה ללחיצה על מרכז השיפון כדי להנחות ולסייע למעבר של החומר המעובד. סחטו וסובבו את השיפון באמצעות הפינצטה כדי להשלים את המעבר, והעבירו את התווך לארבעה מבחנות צנטריפוגה קוניות בנפח 50 מיליליטר.

אספו את התאים הסטרומליים-וסקולריים באמצעות סרטיפוגציה. לאחר מכן, שפכו את על-המשקע מבלי להפריע למשקעים כדי להסיר את רובה של שכבת השומן העליונה המכילה את האדיפוציטים הבוגרים. לאחר מכן, השעיקו שוב את המשקעים ב-10 milliliters של DMEM באמצעות פיפטור וניעור עדין.

סבבו שוב את התאים במערכת צנטריפוגה ותלו את המשקעים מחדש ב-10 milliliters של ACK lysis buffer. לאחר שבע דקות בטמפרטורת החדר, עצרו את ליזיס כדוריות הדם האדומות על ידי הוספה של 10 milliliters של DMEM לכל מבנה, תוך ניעור עדין של המבחנות לערבוב. לאחר מכן, סבבב את התאים שוב במערכת צנטריפוגה.

שטוף את התאים פעמיים נוספות עם 10 milliliters של DMEM ולאחר מכן איסוף את העל-נוזלים (supernatants) דרך מסננת של 100-micron לתוך מבחנה קונית אחת של 50-milliliter. בצע פיפטינג עדין של תרחיף התאים מספר פעמים כדי להפיץ את התאים באופן שווה, וספור את התאים בשיטת Trypan Blue exclusion. לבסוף, זרע את התאי הגזע המופקים מרקמת שומן של חזיר בצפיפות של 6 × 10⁴ לסנטימטר רבוע בתוך מכל תרבית בגודל המתאים עם מצע גידול תאים.

דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2, כדי להקל על היווצרות שכבה אחת (monolayer). המורפולוגיה של תאי גזע מהרקמה השומנית של חזיר שהופקו מהfrakציה הסטרומלית-וסקולרית דומה לזו של תאי גזע מהרקמה השומנית של עכבר או אדם, עם מורפולוגיה דמוית סיבים המתרחבת וניכרת 24 שעות לאחר הזריעה. תאי הגזע מהרקמה השומנית של החזיר מגיעים למצב של התמזגות (confluency) בתוך 72 שעות, ובנקודה זו הם מוכנים להבחנה לאדיפוציטים או להבחנה אחרת מסוג מזנכימלי.

תאים אלו מראים גם פוטנציאל אדיפוגני חזק לאחר השראה כימית, ואדיפוקיטים בוגרים ניתנים לצפייה לאחר תשעת ימי דיפרנציאציה, כאשר למעל 90% מתאי הגזע המופקים מרקמת שומן של חזיר נצפתה דיפרנציאציה אדיפוגנית. סממנים שטח של תאי גזע מזנכימליים, כולל CD 29, CD 44, CD 90 ו-MHC 1, מובעים בריכוז גבוה בתאי הגזע המופקים מרקמת שומן של חזיר, בעוד ש-CD 4a, CD 31, CD 45 ו-MHC II כמעט ואינם ניתנים לגילוי, מה שמוכיח כי תאי גזע אלו המופקים מרקמת שומן של חזיר מראים מאפיינים מסוג מזנכימלי ללא זיהום משמעותי של תאי גזע אנדותליים או המטופויטיים. יתר על כן, ניתן לזהות את תאי הגזע המופקים מרקמת שומן של חזיר לאחר דיפרנציאציה כאדיפוקיטים, אוסטאוקיטים או קונדרוציטים, באמצעות שימוש בצבעים ספציפיים לצביעת רקמות, מה שמוכיח כי תאים אלו המופקים מהfrakציה הסטרומלית-וסקולרית שומרים על מולטיפוטנציאליות האופיינית לפרוגניטורים מסוג מזנכימלי.

במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להקפיד על טכניקה אספטית תקינה לתרביות תאים ולבצע את כל השלבים במהירות המרבית, כדי למקסם את חיוניות התאים. לאחר רכישת מיומנות בשיטה, ניתן לאסוף תאים משני עד שלושה חזירים בתוך שש שעות, במידה והטכניקה מבוצעת כהלכה.

טכניקה סטנדרטית זו סללה את הדרך עבור חוקרי השמנה בתחום הסוכרת לבחון את המתגים המולקולריים, כגון גורמי שעתוק השולטים בהבחנה של אדיפוציטים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה בידיכם הבנה טובה של השלבים לבידוד תאי גזע ממקור שומני של חזירים, ולהערכת יכולתן הרב-גונית של תאים אלה להבחין לאדיפוציטים, אוסטאוציטים וכונדרוציטים.