זיהוי סימולטני של הפעלת ג-Fos מאתרים זכו דופמין Mesolimbic ו Mesocortical בעקבות סוכר נאיבי בליעת שומן אצל חולדות
24 באוגוסט 2016
מטרת מחקר זה היא לזהות רשתות מוח מופצות הקשורות גמול על ידי התוויית טכניקת immunohistological אמינה באמצעות הפעלת C-FOS הסלולר למדוד לשינוים סימולטניים מסלולי דופאמין ואתרי מסוף לאחר בליעת רומן של שומן וסוכר בחולדות.
המטרה הכוללת של פרוטוקול ניסיוני זה היא לקבוע אם ה-VTA, ואזורי ההקרנה המזוטלנצפטיים העיקריים שלו יציגו קואורדינטות והפעלת c-Fos בו זמנית לאחר צריכה חדשה של תמיסות שמן תירס, גלוקוז, פרוקטוז או סכרין. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה, כגון מוטיבציה, ולזהות אם אתרי מוח מרובים מופעלים באופן מתואם בתגובה לגירויים טעימים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משלבת את המבחנים ההתנהגותיים המבוססים, טכניקות ההפעלה התאיות והניתוחים הסטטיסטיים.
כדי להקים את המנגנון, השתמש בצינור צנטריפוגה מכויל עם פקק שודד, ובצינור לגימת מתכת בזווית של 45 מעלות כדי לספק מדידה מדויקת של התמיסה המוצגת לחולדה. אבטח אותו לכלוב הביתי על ידי קפיץ מתכת מתוח, וכדי לאפשר נראות של הכיול. שלושה עד חמישה ימים לפני האימון, הגבילו את מנות המזון לחולדה כדי להפחית את משקל גופה ל-85% ממשקלה המקורי, על מנת להגביר את המוטיבציה לצרוך את התמיסה.
בינתיים, ספקו 10 מיליליטר של תמיסת טרום אימון, עם 0.2% סכרין, לבעל החיים למשך ארבעה ימים, במשך מפגש של שעה, כדי למקסם את ההסתברות שהחולדה תדגום את תמיסת הבדיקה הבאה עם חביון קצר. שקלו את הצינור לפני ואחרי כל מפגש כדי לקבל את מדידת הצריכה. לאחר מכן, בצע בדיקת קליטה ביום החמישי על תת-קבוצות המקבלות אחד מששת הפתרונות.
ודא שהחולדות מדגימות פתרון עם חביון קצר, והוצא את הנבדקים מהמחקר אם דרישה זו לא מתקיימת. להכנת הרקמה, לאחר הקרבת החיה, הסר את המוח מהגולגולת במהירות. השתמש ב-rongeurs כדי לפצח בזהירות ולהסיר את העצם מהמוח, החל מאחור לחזית.
עבדו באזור שמתחת למוח הקטן, וודאו שהרונג'ורים נמצאים בין העצם לפיה מאטר קרום המוח. לאחר הסרת החלק העליון והצדדים של הגולגולת, השתמשו במרית קטנה כדי להרים את המוח מבסיסו, וחתכו את עצבי הגולגולת במספריים קטנים. לאחר מכן, קבעו את המוח בתמיסת 4% פרפורמלדהיד למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.
למחרת, הניחו את המוח בתמיסת הסוכרוז בטמפרטורת החדר, עד שהוא מתייצב בתחתית המיכל. לאחר מכן, הסר את נורת הריח. לאחר מכן, הסר את המוח הקטן ואת הפונים.
לאחר מכן, הרכיבו את המוח בצורה קורונלית, כאשר החלק הזנבי קבוע לשלב המיקרוטום, וחתכו קטעי עטרה של 40 מירומטרים. בהליך זה, יש לטפל בחלקים בחמישה מיליליטר של 5% סרום עיזים רגיל, ו-0.2% טריטון x-100 ב-PBS, למשך שעה. לאחר מכן, דגרו את החלקים המטופלים בנוגדנים ראשוניים בארבע מעלות צלזיוס למשך 36 שעות, בבארות המכילות מיליליטר אחד של PBS.
לאחר 36 שעות יש לשטוף את החלקים שלוש פעמים עם חמישה מיליליטר PBS למשך 10 דקות בכל פעם. לאחר מכן, דגרו את החלקים עם נוגדן משני בטמפרטורת החדר למשך שעתיים, בבארות המכילות מיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן, שטפו את החלקים שלוש פעמים בחמישה מיליליטר PBS למשך 10 דקות בכל פעם.
לאחר מכן, דגרו את החלקים השטופים למשך שעתיים בתערובת פרוקסידאז חזרת אבידין הזמינה מסחרית. לאחר שעתיים יש לשטוף את החלקים שלוש פעמים בחמישה מיליליטר PBS, למשך עשר דקות בכל פעם. לאחר מכן, הגיבו את החלקים עם DAB בנוכחות מי חמצן, למשך חמש עד עשר דקות.
לאחר מכן, סמן פעמיים את מקטעי ה-VTA על ידי דגירה עם נוגדן טירוזין הידרוקסילאז, בחמישה מיליטרים של PBS, למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת יש לשטוף את החלקים שלוש פעמים בחמישה מיליליטר PBS, למשך עשר דקות בכל פעם. לאחר מכן, דגרו את החלקים עם נוגדן משני בחמישה מיליליטר PBS, בטמפרטורת החדר, למשך שעתיים.
לאחר שעתיים יש לשטוף את החלקים שלוש פעמים בחמישה מיליליטר PBS, למשך עשר דקות בכל פעם. כדי לדמיין את הנוגדן באמצעות קומפלקס נוגדן פרוקסידאז משני, הגיבו אותו בשילוב של DAB, ותמיסת ניקל גופרתי של 0.3%, למשך חמש עד עשר דקות. ספור את התאים על ידי לחיצה כפולה על סמל התוכנה.
עבור לשורת התפריטים, לחץ על רכישה ולאחר מכן על תמונה חיה. לאחר מכן, הביאו את אזור העניין למיקוד ולחצו על המסך כדי ליצור נקודת התייחסות. לאחר מכן, עבור אל סרגל הכלים של הרשת ולחץ על הצג רשת והשתמש בתוויות רשת.
מתאר את אזור העניין בעזרת עקבות שנקבעו מראש. לאחר מכן, ספור את כל התאים בכל אזור עניין, ובחר פלוס בסרגל הצד השמאלי כדי לרשום ספירות של תאי c-Fos. שקול תא חיובי ל-c-Fos כאשר נצפה עיגול אדום-כהה מוגדר.
חזור על תהליך זה עבור כל אתר, וודא שהאמינות בין המדרגים של שני המדרגים הלא מיודעים עבור כל קטע בכל אזור עניין, תמיד עולה על 0.8. לאחר מכן, ספרו את הנוירונים החיוביים c-Fos באזורי העניין. תאר אם קיימת תגובתיות חיסונית c-Fos בתאים חיוביים ל-TH ו-TH שליליים ב-VTA.
תמונה זו מראה כי צריכת השומן או הסוכר מגבירה באופן דיפרנציאלי את הפעלת c-Fos בכל האמיגדלה, כמו גם בתת-אזורי האמיגדלה הבסיסית והמרכזית-קורטיקו-מדיאלית. בתמונה זו, הפעלת אמיגדלה c-Fos בפועל נצפתה בבעלי חיים שנחשפו לצריכת שמן תירס, גלוקוז וכן פרוקטוז. הפעלת C-Fos ב-VTA נצפתה גם בבעלי חיים שנחשפו לשמן תירס ומים.
חיצים שחורים מציינים את התאים החיוביים המייצגים, בעלי התווית הכפולה, TH c-Fos, בעוד שחיצים אפורים מציינים את התאים המייצגים c-Fos בלבד. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלושה עד ארבעה שבועות, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעקוב אחר מתודולוגיה, אחסון וספירה מדויקים.
תודה על הצפייה, ובהצלחה בניסויים שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה נועד לזהות רשתות מוחיות הקשורות לתגמול באמצעות שימוש בטכניקה אימונוהיסטולוגית למדידת הפעלה של c-fos במסלולי דופמין לאחר בליעה של שומן וסוכר בחולדות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- מדעי ההתנהגות
- נוירוביולוגיה
רקע
- הבנת תפקידו של הדופמין בעיבוד תגמול.
- חקירת ההשפעות של גירויים טעימים על הפעלת המוח.
- שימוש ב-c-fos כסמן להפעלה נוירונלית.
- בחינת הקשר בין תזונה למוטיבציה בחולדות.
מטרת המחקר
- לקביעת הפעלת c-fos ב-VTA ובאזורי ההקרנה שלו.
- להערכת ההפעלה המתואמת של מספר אתרים במוח.
- לבדיקת ההשפעות של תמיסות סוכר ושומן שונות על הפעילות המוחית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בדיקות התנהגותיות להערכת מוטיבציה.
- טכניקות אימונוהיסטולוגיות למדידת הש activates של c-fos.
- ניתוחים סטטיסטיים להערכת דפוסי הפעלה של המוח.
- הכנת תמיסות לצריכה על ידי חולדות.
תוצאות עיקריות
- הפעלת c-fos סימולטנית שנצפתה בתגובה לצריכת מזון חדש.
- זיהוי דפוסי הפעלה נבדלים במסלולי דופמין.
- ראיות להפעלה מתואמת של אתרים מוחיים בתגובה לגירויים טעימים.
- מוטיבציה מוגברת המהווה קורלציה לצריכת מזון לאחר הגבלה במשקל.
מסקנות
- המחקר מספק תובנות לגבי המנגנונים הנוירוביולוגיים של תגמול.
- הממצאים עשויים להנחות מחקרים עתידיים על מוטיבציה והשפעות תזונתיות.
- שילוב של טכניקות התנהגותיות ותאיות משפר את ההבנה של תפקודי המוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
זיהוי סימולטני של הפעלת c-Fos לאורך המסלולים הדופמינרגיים המזולמביים והמזוקורטיקליים מאפשר מיפוי מדויק של תגובות עצביות מפוזרות לצריכת רכיבים תזונתיים מעוררי תיאבון. גישה זו מחזקת את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות למנגנונים נוירוביולוגיים הקשורים לתגמול, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS). קריאות כמותיות ממספר אתרים בשיטה זו מקלות על מיון יעיל של פורטפוליו ומבטיחות המשכיות תרגומית עבור תוכניות מחקר נוירופסיכיאטריות ומטבוליות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של הפעלה עצבית מתואמת בתגובה לגירויי תזונה מוגדרים.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבהרת המעורבות התפקודית של מסלולי דופמין.
- מספק ראיות כמותיות למעורבות של רשת מפוזרת בעיבוד תגמול.
- מסייע בביסוס ביטחון חיזוי לגבי היפותזות מנגנוניות עבור מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
סריקה ופיתוח בדיקה
- מקיים פרופילי הפעלה מתוקתקים של אזורי מוח לצורך סריקת תרכובות בהמשך התהליך.
- מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור של תגובה חיסונית ל-c-Fos במספר אתרים.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה ובהשוואתיות בין מחקרים עבור נקודות קצה של הפעלה עצבית.
- מאפשר הערכה מהימנה של התערבויות מועמדות על מעגלי תגמול.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מקשר דפוסי הפעלה עצבית עם פנוטיפים התנהגותיים רלוונטיים למחלה במודלים של מכרסמים.
- מספק רצף ממיפוי מסלולים בשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- מסייע בקבלת החלטות מותאמות סיכון לגבי קידום אינדיקציות נוירופסיכיאטריות ומטבוליות.
- מחזק אסטרטגיות של ביומרקרים טרנסלציונליים על ידי קישור הפעלה תאית לתוצאות פונקציונליות.
שילוב זרימת עבודה ומסלול עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף שבין השלב הגילוי לשלב הפרה-קלניקה על ידי אפשור מיפוי של הפעלה עצבית המונחה-השערה, ובכך היא תומכת הן בתיקוף מטרות והן בפיתוח סמנים ביולוגיים תרגומיים.
- ביולוגיה של הגילוי: מכמת הפעלה מתואמת של c-Fos כדי להבהיר את מעורבות המסלול ולהפחית סיכונים בהשערות מנגנוניות.
- סריקה: מספק מדדי הפעלה סטנדרטיים וניתנים לשחזור לצורך פיתוח בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליזה: מספק ספירות תאים כמותיות ומדדי מהימנות בין בוחנים להשוואה סטטיסטית חסונה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין חתימות של הפעלה עצבית לפנוטיפים התנהגותיים, ובכך תומך בהתאמה של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה ניתנת להרחבה ולשימוש חוזר למיפוי תגובות עצביות מפוזרות במודלים ובהתערבויות מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של בדיקות הפעלה עצבית מרובות-אתרים לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של המשך או הפסקה (go/no-go) וניהול פורטפוליו יעיל מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום תוכניות למחלות מטבוליות ולמערכת העצבים המרכזית (CNS).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בנורו-אנטומיה, אימונוהיסטוכימיה וניתוח תמונות כמותי.
- מחייב גישה למיכשור התנהגותי מכויל, למיקרוטומים ולתוכנות דימיג.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדרית בין בוחנים והערכת מהימנות עבור ספירת תאים.
- ניתן להתאמה למודלים שונים של מכרסמים ולגירויים תזונתיים שונים באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- תלוי בטיפול מדויק ברקמה ובתיקוף של הנוגדנים כדי להשיג תוצאות הניתנות לשחזור.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:54
Testing Apparatus and Intake Procedures
2:06
Tissue Preparation
3:22
c-fos Staining Procedure
5:29
Determination of c-fos Immunoreactive Counts
6:45
Results: Actual Amygdala and Ventral Tegmental Area c-fox Activation Following Fats and Sugars
7:35
Conclusion
