במבחנה פירוק של וירוס שפעת capsids ידי צנטריפוגה שיפוע

המטרה הכוללת של צנטריפוגה זו של שיפוע מהירות היא לנתח קפסידים של נגיף שפעת A בתנאים המחקים את הסביבה האנדוציטית שבה נתקלים נגיפים נכנסים במהלך כניסת התא. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי האופן שבו קפסידים של נגיף שפעת A מתפרקים במהלך כניסת התאים, כגון ההשפעה הספציפית של pH חומצי קל על יציבות הקפסיד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת ניתוח כמותי של תהליך הסרת הציפוי של נגיף השפעת A בתנאי ניסוי מוגדרים.

מלבד מתן תובנות לגבי אופן תחילת הסרת הציפוי של נגיף שפעת A, ניתן ליישם שיטה זו גם על מחקר נגיפי מעטפת אחרים עם מנגנוני הסרת ציפוי קשורים. מי שידגים את ההליך יהיה פיראט נבלוגלו, סטודנט לשעבר מהמעבדה שלי. לאחר הכנת מאגרי מלאי וריאגנטים על פי פרוטוקול הטקסט, עבור כל מצב pH לבדיקה, הכינו תערובת מאסטר של מאגר חומרי ניקוי על ידי ערבוב תשעה מיליליטר של נתרן כלורי מולארי אחד, שישה מיליליטר של 10% NP40, 2.4 מיליליטר של מלאי מעכב פרוטאז 25X ותשעה מיליליטר מים מזוקקים כפולים.

לאחר מכן עבור כל מצב pH, צינור 4.4 מיליליטר מהמאסטר מערבב לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. עבור ערכי pH מעל 5.8, הוסף 0.6 מיליליטר מתמיסת המלאי 500 מילי-מולר Tris המותאמת ל-pH לצינור. עבור ערכי pH 5.8 ומטה, הוסף 0.6 מיליליטר מתמיסת מלאי MES 500 מילי-מולר מותאמת pH בהתאמה.

הכינו חמישה מיליליטר של תמיסת חיץ, המכילה 300 מילי-מולארי נתרן כלורי, מעכב פרוטאז 2X, 60 מילי-טריס מולר, מותאם ל-pH 7.4, ומים מזוקקים כפולים. זה ישמש כמאגר שיפוע הבקרה ללא חומרי ניקוי. לאחר מכן, הוסף חמישה מיליליטר ממלאי הגליצרול של 50% לחמישה מיליליטר של תערובות החיץ המכילות חומרי ניקוי וללא חומרי ניקוי, וכתוצאה מכך שש תמיסות שונות של 25% גליצרול.

השתמש ברצועות pH כדי לאמת את ערכי ה-pH. הכן תמיסת גליצרול של 15% על ידי ערבוב יחס של שלושה עד שבע של מלאי גליצרול של 50% עם מים מזוקקים. בעזרת מזרק של חמישה מיליליטר ומחט, הוסף שלושה מיליליטר של תמיסת גליצרול 15% לשישה צינורות צנטריפוגה אולטרה-קלירים.

שטפו את המחט במים מזוקקים כפול לאחר כל שלב. השתמש במזרק של חמישה מיליליטר ובמחט ארוכה כדי להזריק בזהירות 3.4 מיליליטר של תמיסת גליצרול 25% מתחת לשכבת הגליצרול של 15%, תוך הקפדה לא לערבב את שתי השכבות. ממשק בין שתי השכבות נראה בבירור.

חזור על פעולה זו עבור כל ששת התנאים כדי לבדוק עם תמיסות הגליצרול המותאמות ל-pH המתאימות. לאחר מכן, בארון בטיחות ביולוגית Class II, השתמש במיליליטר אחד של נוזל אלנטואי מובהר ומדולל, המכיל נגיף שפעת A, כדי לכסות בעדינות את שיפועי הגליצרול. העבירו צינורות לדלי רוטור, אזנו צינורות מנוגדים והניחו אותם בזהירות לתוך רוטור אולטרה-צנטריפוגה SW-41 מקורר מראש.

צנטריפוגה ב-2100 סל"ד ו-12 מעלות צלזיוס למשך 150 דקות. לאחר הצנטריפוגה, השתמש בפיפטה פסטר נקייה ובשואב כדי להסיר בזהירות את שתי שכבות הגליצרול. לאחר מכן, עם 40 מיליליטר של מאגר דגימת LDS שאינו מפחית פי 1, השעו מחדש את הגלולה לחלוטין על ידי פיפטינג למעלה ולמטה לפני העברת הדגימה לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

כדי לבצע SDS-PAGE, יש לחמם את כל הדגימות בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. טען 20 מיקרוליטר מהכדורים המומסים על מיני-ג'ל Bis-Tris שיפוע טרומי והפעל ב-200 וולט למשך שעה במאגר ריצה של 1X MOPS SDS. דגרו את הג'ל בתמיסת קיבוע למשך שעה.

יש לשטוף פעם עד פעמיים במים, ולהכתים למשך הלילה בכלי תרבית תאים בגודל 15 ס"מ עם נפח מספיק של תמיסת Coomassie קולואידית תוך ניעור עדין בטמפרטורת החדר. יש להרתיע את הג'ל במים מזוקקים פעמיים, ולהחליף את הנוזל כל 15 עד 20 דקות עד שרקע הג'ל מתבהר. אחסן את הג'ל במים מזוקקים כפולים בארבע מעלות צלזיוס עד שהוא נסרק לכימות הרצועה.

לבסוף, סרוק את הג'ל ברזולוציה גבוהה והשתמש בתוכנה מותאמת אישית זמינה מסחרית לכימות עוצמות פס החלבון. הפחיתו את אות הרקע מאזור קרוב לרצועות המתאימות ונרמלו את הערכים לערכי הבקרה ללא חומרי ניקוי. בניסוי זה, X31 שמקורו בנוזל אלנטואי מובהר עבר צנטריפוגה בשיפוע מהירות ברמות pH בין 7.4 ל-5.0 ונותח על ידי SDS-PAGE.

ללא חומר ניקוי הקיים בשיפוע, ויריונים שלמים מגולגלים כפי שמשתקף על ידי הדפוס האופייני של רצועות, המייצגים HA, NP ו-M1 בג'ל המוכתם בקומאסי. עם הוספת NP40 לשכבת הגליצרול התחתונה, המעטפת הנגיפית, כולל HA, NA ו-M2, הומסה, והליבה הנגיפית לבדה שקעה לתוך הגלולה במהלך אולטרה-צנטריפוגה. החל מ-pH מתחת ל-6.5, M1 הולך לאיבוד בהדרגה משבר הגלולה, ומגיע למינימום בין pH 5.8 ל-pH 5.4.

מתחת ל-pH 5.8, vRNPs נותקו וכך אבדו מהגלולה. מרצועות החלבון שנותחו, התגלו שני ספי pH מובהקים לפירוק שכבת M1 ודיסוציאציה של צרורות vRNP, כולל pH 6.5 ו-pH 5.8, בהתאמה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שבהתאם לזן המסוים של נגיף השפעת A או המוטציה, ניתן להבחין בתכונות פירוק שונות.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיקרוסקופ אלקטרונים על מנת לקבל תובנות נוספות כמו המבנה של קפסידים מבודדים של נגיף השפעת.