Name: במבחנה פירוק של וירוס שפעת capsids ידי צנטריפוגה שיפוע (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: למדו ניתוח פירוק capsids של וירוס שפעת A באמצעות צנטריפוגה שיפוע בתנאי pH חומציים קלים. שיטה זו מאפשרת חקר כמותי של תהליך הפתיחה הוויראלי ומנגנוני הכניסה לתא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים יוהיי Yamauchi ורוברטה מנצ&#39;יני לספק לנו חומרים כימיים. מעבדת AH נתמכה על ידי רשתות ההדרכה הראשוניות מארי קירי (ITN), מועצת המחקר האירופית (ERC), ועל ידי הקרן הלאומית למדע השויצרי (Sinergia).

1. הכנת חוצצים ופתרונות במלאי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ MNT (20 MES מ&quot;מ, 30 מ&quot;מ טריס ו 100 mM NaCl) על ידי המסת 470 מ&quot;ג טריס Hydrochloride, 390 מ&quot;ג מימה MES ו 580 מ&quot;ג NaCl ב 80 מ&quot;ל DDH 2 O. התאם את חיץ pH 7.4 ולהביא אותו לנפח סופי של 100 מ&quot;ל עם DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שלושה פתרונות זהים של 500 חיץ מ&quot;מ MES על ידי המסת מימה MES 9.76 גרם 80 מ&quot;ל DH 2 O כל אחד. התאם את מאגרי 5.8 pH, 5.4, ו -5.0, בהתאמה, על ידי titrating עם NaOH המרוכז. תביאו כל חיץ לנפח סופי של 100 מ&quot;ל עם DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שני פתרונות זהים של 500 מ&quot;מ טריס חיץ ידי המסת 7.88 גרם טריס הידרוכלוריד ב 80 מ&quot;ל DH 2 O כל ולהתאים את ה- pH ל 7.4 ו -6.4, בהתאמה, על ידי titrating עם מרוכזת HCI. תביאו למאגר לנפח סופי של 100 מ&quot;ל עם DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון גליצרול 50% ב DH 2 O ומערבבים היטב עד glycארול הוא מעורב homogenously. סנן את הפתרון באמצעות יחידת מסנן Steritop (0.22 מיקרומטר גודל נקבובי) לתוך בקבוק זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 10% פתרון NP-40 ו 1 M NaCl ב DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 25x מעכב פרוטאז מרוכז על ידי המסת שתי טבליות ב 4 מ&quot;ל DDH 2 O. </li></ol> 2. הכנת מעברי צבע גליצרול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 5 מיליליטר לערבב חומרי ניקוי החיץ מאסטר (300 mM NaCl, 2% NP-40, 2x מרוכז מעכבי פרוטאז) פתרון עבור כל תנאי pH לבדוק (pH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4, ו -5.0). לשם כך, לערבב 9 מ&quot;ל של 1 M NaCl, 6 מ&quot;ל של 10% NP-40, 2.4 מ&quot;ל של המניה מעכב פרוטאז 25x, ו- 9 מ&quot;ל DDH 2 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל pH מצב pipet 4.4 מ&quot;ל של מיקס מאסטר לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ערכי ה- pH מעל 5.8 להוסיף 0.6 מ&quot;ל של פתרון המניות בהתאמה מותאם pH 500 מ&quot;מ טריס אל הצינור. עבור 5.8 pH והתחתון להוסיף 0.6 מ&quot;ל של פתרון המניות pH המותאמת בהתאמה 500 מ&quot;מ MES. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 5מ&quot;ל של תמיסת מאגר המכיל 300 mM NaCl, מעכבי פרוטאז 2x, 60 מ&quot;מ טריס מותאם pH 7.4 ו DDH 2 O. זה ישמש חיץ שיפוע מלא חומר ניקוי חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך, עדין לכוונן את ה- pH של פתרונות pH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4, ו -5.0 ידי הוספת פתרונות HCI או NaOH מרוכז, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של המניה גליצרול 50% עד 5 מ&quot;ל של המכילים חומרי ניקוי וחומרי ניקוי ללא תערובות חיץ וכתוצאה מכך שישה פתרונות גליצרול שונים 25%. בדוק את ערכי ה- pH באמצעות רצועות אינדיקטור pH. הערה: במידה pH נמדד שונה באופן משמעותי מן הערך הרצוי, הפתרונות המתאימים צריכים להיות מוכנים שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון גליצרול 15% על ידי ערבוב 50% מניות גליצרול עם DH 2 O ב 3: יחס 7. </li></ol> 3. ultracentrifugation של IAV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 פתרון גליצרול מ&quot;ל 15% לתוך צינורות צנטריפוגה אולטרה ברור (13.2 מ&quot;ל, 14 מ&quot;מ x 89 מ&quot;מ) באמצעות מזרק 5 מ&quot;ל ו לביתDLE (21 G, 9 ס&quot;מ). אין להשאיר טיפות על הקיר הפנימי של הצינור, שכן הדבר עלול להפריע את היושרה של השיפוע. חזור על פעולה זו עבור סכום כולל של שישה צינורות צנטריפוגה, אחד עבור כל אחד מחמשת התנאים pH לבדוק ואחד למדגם שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום 3.4 מ&quot;ל 25% פתרון גליצרול מתחת לשכבת גליצרול 15% באמצעות מזרק 5 מ&quot;ל ו מחט ארוכה. יש להיזהר שלא לערבב את שתי השכבות. חזור על פעולה זו עבור כל ששת התנאים לבדוק עם פתרונות גליצרול pH המותאמת בהתאמה. הערה: עבודת בארון biosafety בכיתה השנייה על הצעדים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות כיסוי הדרגתי גליצרול עם 30 μl בהירים נוזל allantoic המכיל IAV (X31, H3N2) מדולל 1 מיליליטר חיץ MNT (מקביל סביב 20-30 מיקרוגרם של חלבון נגיפי הכולל) עבור כל צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתרה מנוגדים צינורות ומניחים אותם לתוך הרוטור ultracentrifugation SW41. צנטריפוגה עבור 150 דקות, ב 55,000 XG, ו -12 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, בזהירותלהסיר את supernatant, כלומר, הן שכבות גליצרול באמצעות פיפטה פסטר נקייה וכן aspirator. Resuspend גלולה ב 40 μl (1x) חיץ מדגם LDS הלא צמצום. חשוב pipet מעלה ומטה מספר פעמים כדי לפזר את הגלולה לחלוטין. מעבירים את המדגם לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge. </li></ol> 4. SDS-PAGE של גלולה שברים ו Coomassie מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחמם את כל הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בשלב זה הדגימות ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס עד שהם מנותחים על ידי SDS-PAGE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 20 μl של כדורי מומס על שיפוע מראש יצוק (4-12%) Bis-טריס ג&#39;ל מיני ולהפעיל עבור שעה 1 ב 200 V ב 1x מגבים SDS הפעלת המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון קיבעון עם 40% מתנול 10% קרחוני חומצה אצטית DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ג&#39;ל בתמיסה קיבעון עבור שעה 1 ו להכתים לילה בצלחת תרבית תאים 15 ס&quot;מ עם נפח מספיק של פתרון Coomassie קולואידים בעוד בעדינותרועד בטמפרטורת החדר. הערה: חשוב לסגור את המנה על מנת למנוע אידוי של הפתרון המכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Destain הג&#39;ל DDH 2 O. החזר את DDH 2 O כל 15-20 דקות עד שרקע ג&#39;ל מתבהר. אחסן את הג&#39;ל DDH 2 O על 4 מעלות צלזיוס עד שהוא נסרק כימות הלהקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את הג&#39;ל על ברזולוציה גבוהה ולהשתמש תוכנה זמינה או מחוייט מסחרית עבור כימות של עוצמות להקת חלבון. הפחת את אות רקע מאזור קרוב להקות בהתאמה לנרמל את הערכים הללו ל דגימות בקרת חומר הניקוי ללא (ב- pH 7.4). </li></ol>

<ol><li>Taubenberger, J. K., Kash, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+Virus+Evolution%2C+Host+Adaptation%2C+and+Pandemic+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+host+%26+microbe%22%5BJournal%5D)">Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation.</a> Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).</li>
<li>Skehel, J. J., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+binding+and+membrane+fusion+in+virus+entry%3A+the+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin.</a> Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).</li>
<li>de Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+influenza+a+virus+endocytic+routes+reveals+macropinocytosis+as+an+alternative+entry+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway.</a> PLoS pathogens. 7 (3), e1001329(2011).</li>
<li>Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+entry+pathway+of+influenza+virus+in+a+canine+kidney+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line.</a> J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).</li>
<li>Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mechanism+of+influenza+virus+entry+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells.</a> J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).</li>
<li>Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+endocytic+machinery+around+individual+influenza+viruses+during+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry.</a> Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).</li>
<li>Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+virus+entry+via+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Dissecting virus entry via endocytosis.</a> J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).</li>
<li>Yoshimura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+Cell+Entry+Mechanism+of+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus.</a> Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).</li>
<li>White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-fusion+activity+of+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Membrane-fusion activity of influenza virus.</a> Embo Journal. 1 (2), 217-222 (1982).</li>
<li>Martin, K., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+transport+of+influenza+virus+ribonucleoproteins%3A+The+viral+matrix+protein+%28M1%29+promotes+export+and+inhibits+import%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import.</a> Cell. 67 (1), 117-130 (1991).</li>
<li>Palese, P., Shaw, M. L. Chapter 47. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalese%2C+P+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1690 (2006).</li>
<li>Chou, Y. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+Different+Influenza+Viral+RNA+Segments+in+the+Cytoplasm+before+Viral+Budding+as+Shown+by+Single-molecule+Sensitivity+FISH+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis.</a> PLoS Pathog. 9 (5), e1003358(2013).</li>
<li>Martin, K., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+incoming+influenza+virus+nucleocapsids+into+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus.</a> Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).</li>
<li>Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+M1+protein+and+low+pH+on+nuclear+transport+of+influenza+virus+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins.</a> Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-Controlled+Two-Step+Uncoating+of+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus.</a> Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).</li>
<li>Stauffer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+priming+by+acidic+pH+and+high+K%2B+is+required+for+efficient+uncoating+of+influenza+A+virus+cores+after+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration.</a> Journal of Virology. , (2014).</li>
<li>Zhirnov, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+of+matrix+protein+M1%2FM+from+virions+occurs+at+different+pH+for+orthomyxo-+and+paramyxoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses.</a> Virology. 176 (1), 274-279 (1990).</li>
<li>Banerjee, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus+uses+the+aggresome+processing+machinery+for+host+cell+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry.</a> Science. 346 (6208), 473-477 (2014).</li>
<li>Huotari, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cullin-3+regulates+late+endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cullin-3 regulates late endosome maturation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).</li>
<li>Yamauchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+Deacetylase+8+Is+Required+for+Centrosome+Cohesion+and+Influenza+A+Virus+Entry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry.</a> PLoS Pathog. 7 (10), e1002316(2011).</li>
<li>Bachmayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Solubilization+of+Hemagglutinin+and+Neuraminidase+from+Influenza+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses.</a> Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).</li>
<li>Reginster, M., Nermut, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Characterization+of+Influenza+Virus+Cores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores.</a> Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).</li>
<li>Nermut, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+Investigation+on+the+Fine+Structure+of+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus.</a> Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).</li>
<li>Schulze, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+influenza+virus%3A+II.+A+model+based+on+the+morphology+and+composition+of+subviral+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles.</a> Virology. 47 (1), 181-196 (1972).</li>
<li>Candiano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+silver%3A+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).</li>
<li>Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+virus+uncoating%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of virus uncoating.</a> Trends in microbiology. 2 (2), 52-56 (1994).</li>
<li>Yamauchi, Y., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+entry+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Virus entry at a glance.</a> Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).</li>
<li>Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disassembly+of+Influenza+C+Viruses%2C+Distinct+from+That+of+Influenza+A+and+B+Viruses+Requires+Neutral-Alkaline+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH.</a> Virology. 200 (1), 284-291 (1994).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

capsids ויראלי הם קומפלקסים macromolecular metastable. בעוד הרכבה של virions מחייבת encapsidation ועיבוי של הגנום הווירוס, ייזום של הסיבוב הבא של זיהום תלוי פירוק מבנה קפסיד קומפקטי זו. וירוסים התפתחו לנצל מנגנונים תאיים שונים כדי לשלוט על מחזור הציפוי-uncoating, כולל קולטני תאים, מלווה, אנזימים פרוטאוליטים, כוחות פיסיים הניתנים על ידי חלבונים מנועים או helicases וכן pH ומתגים יוניים 26,27. כאן, אנו מתארים גישה במבחנה מבוססת על צנטריפוגה שיפוע גליצרול כדי לבדוק...

וירוס שפעת A (IAV) הוא וירוס אפוף ושייך למשפחת Orthomyxoviridae. הגנים שלו מקודדים על גנום RNA מפולח, שלילי-השכל חד-גדילים. אצל בני אדם, IAV גורם זיהומים בדרכי נשימה, אשר מתרחשים התפרצויות מגיפה עונתיות ונושאת פוטנציאל המגיפות העולמיות 1. עם קשירת שאריות חומצת sialic על תא מארח המשטח 2, IAV מופנם על ידי אנדוציטוזה clathrin התלוי מסלולים עצמאיים-clathrin 3-8. המילייה חומצי (pH &lt;5.5) ב vacuoles endocytic מפעילה שינוי קונפורמציה מרכזי hemagglutinin גליקופרוטאין ספייק IAV (HA), שתוצאתה היתוך של נגיפי ואת endosomal מאוחר קרום 9. לאחר קפסיד IAV (כאן המכונה גם ויראלי &quot;הליבה&quot;) ברח מן endosomes מאוחר (LES), הוא ללא ציפוי ב cytosol ואחריו התחבורה של ribonucleoproteins ויראלי (vRNPs) לתוך הגרעין - O את האתרf וירוס שכפול שעתוק 10-13. לפני הפעלת חומצה של HA בנגיף חווה ירידה הדרגתית pH במערכת endocytic, אשר מספרים ראשוניים הליבה עבור פירוקו לאחר 14-16. בחודש זה &quot;הטרמה&quot; צעד של תעלות יונים M2 בקרום ויראלי לתווך זרם של פרוטונים ו- K +10,14,16. השינוי בריכוז יוני בפנים הווירוס מפריע האינטראקציות להצטבר על ידי חלבון מטריקס ויראלי M1 ואת צרור השמונה vRNP, ומקל IAV uncoating בציטופלסמה הבא קרום היתוך 10,14-17. ניתוח ישיר וכמותיים של הצעד יחול כבר הקשה על ידי העובדה endosomes קשה לגשת באופן ניסיוני. תהליך הכניסה, יתר על כן, מאוד לא סינכרוני. בנוסף, מבחני סוף נקודות, כגון qRT-PCR של מדידות infectivity או רנ&quot;א נגיפי שוחרר, אינם מספקים תמונה מפורטת על מצב ביוכימי של capsi ויראליד בכל צעד נתון כניסה. בעוד ההפרעות של endosomes ידי siRNA או טיפול תרופתי תרם משמעותית להבנת כניסה IAV 18-20, כיוונון עדין קשה ונוטים תופעות לוואי נוקבים בתוכנית התבגרות אנדוזום תחת פיקוח הדוק. כדי למנוע בעיות אלה, יש לנו התאמנו שפותח בעבר בפרוטוקול במבחנה מבוסס על שימוש צנטריפוגה שיפוע מהיר 17. בניגוד לניסיונות אחרים 21,22, 23,24, שהתבססו בעיקר על שילובים של מחשוף פרוטאוליטים וטיפול חומר ניקוי ואחריו ניתוח EM, גישה זו אפשרה להם תוצאה לכימות בקלות. צנטריפוגה דרך שכבות צבע שונות מאפשרת החלקיקים לסדימנטציה להיחשף ומגיבים עם שינוי תנאים באופן מבוקר. בפרוטוקול שהוצג, IAV נגזר נוזל allantoic בהיר או חלקיקים נגיפיים מטוהרים שקועים גליצרול דו שכבתישיפוע שבו השכבה התחתונה מכילה את הלא יוניים חומר ניקוי NP-40 (איור 1). כמו הנגיף חודר את השכבה השנייה, המכיל חומר ניקוי, המעטפה שומנים ויראלי גליקופרוטאינים המעטפה הם solubilized בעדינות והשאיר אחריו. הליבה, מורכב משמונה צרור vRNP ומוקף שכבת מטריקס, משקע כמבנה יציב לתוך השבר הגלול. חלבונים הליבה ויראלי, כגון M1 ו- nucleoprotein הקשורים vRNP (NP), יכול להיות מזוהים את הכדור על ידי SDS-PAGE ו Coomassie מכתים. בפרט, תוך ניצול של ג&#39;ל שיפוע הזמין המסחרי מכתימה עם קולואידים רגישות הגבוהה Coomassie 25, מאפשר דיוק וזיהוי גבוהים של כמויות קטנות אפילו של חלבוני ליבה קשורה ויראלי. זו מגדירה את הבסיס לבדוק האם תנאים שונים כגון pH, ריכוז מלח, וגורם uncoating המשוערת יש השפעות על התנהגות השקיעה של רכיבי ליבת הליבה stabil<html> ity. למטרה זו, רק את השכבה התחתונה, המכיל חומר ניקוי שיפוע גליצרול היא שונה על ידי החדרת הגורם או מצב עניינים. הטכניקה כבר יקרה במיוחד בחקירת ההשפעה שונה ערכי pH וריכוז מלח על שלמות ליבת IAV 16. פעולות ביניים של uncoating IAV יכול להיות במעקב דיסוציאציה כולל של שכבת מטריקס ב- pH חומצי קל (&lt;6.5) ואחריו דיסוציאציה vRNP ב- pH 5.5 והתחתון 16,17 (איור 1). השלב האחרון היה עוד יותר משופר על ידי נוכחות של גבוה K + ריכוז בשכבת גליצרול, המשקף בסביבה endocytic מאוחר 16. לכן, כמו הווירוס ואת הליבה משקעים דרך השיפוע שחווה בסביבה משתנית שתנאים מחקו ב endosomes. התוצאה היתה פירוק הדרגתי של הליבה ויראלי במבחנה, המשלימה התוצאות הנגזרות מבחני ביולוגיה של התא. t &quot;&gt; השיטה המוצגת כאן אפשרה מהר וניתוח לשחזור ביותר של IAV (X31 ו- A / WSN / 33) ואת IBV (B / Lee / 40) uncoating מופעלות על ידי pH חומצי והגדלת K +16,17 וכן פירוק ליבות paramyxovirus בחשיפה pH בסיסי 17. זה מתקבל על הדעת כי ניתן להתאים את הגישה וירוסים אפוף אחרים כדי להשיג תובנות את התכונות הביוכימיות של המבנה קפסיד ויראלי ופירוק קפסיד במהלך ערך בתא.

<table><tbody><tr><td>cOmplete&trade;, טבליות מעכבי פרוטאז ללא EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11873580001</td><td>ניתן לאחסן את תמיסת המלאי בטמפרטורה של 2 עד 8 מעלות; C למשך 1 עד 2</td></tr><tr><td>שבועות חומצה אצטית קרחונית</td><td>Merck Millipore</td><td>100063</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול נטול מים BioChemica</td><td>AppliChem</td><td>A1123</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>Merck Millipore</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>מחט הזרקה ארוכה (21&nbsp; G, 9 ס"מ, משופע או קהה)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>Merck Millipore</td><td></td> 106009-NP-40 <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td>זמין כעת מסחרית כ-IGEPAL&reg; CA-630</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% מיני ג'ל ביס-טריס, 10&nbsp; בארות, 1.0 מ"מ</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS מאגר דגימה (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS מאגר ריצה (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>רצועות מחוון pH, pH 4.0-7.0</td><td>Merck Millipore</td><td>109542</td><td></td></tr><tr><td>QC Colloidal Coomassie Stain</td><td>BIO RAD</td><td>1610803</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלוריד</td><td>Merck Millipore</td><td>106406</td><td></td></tr><tr><td>סודיוםהידרוקסיד</td><td>Merck Millipore</td><td>106498</td><td></td></tr><tr><td>יחידת מסנן Steritop</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Ti, סט רוטור אולטרה-צנטריפוגה</td><td>Beckman Coulter</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>Thinwall, צינורות צנטריפוגה אולטרה-ברורים, 13.2&nbsp; מ"ל, 14 מ"מ x 89 מ"מ</td><td>בקמן קולטר</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>טריס הידרוכלוריד&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1087</td><td></td></tr><tr><td>X31 נגיף שפעת A (H3N2), נוזל אלנטואי שגדל בביצים, מובהר</td><td>Virapur</td><td></td><td>הופשר טרי ב-4 מעלות; ג</td></tr></tbody></table>

במבחנה פירוק של וירוס שפעת capsids ידי צנטריפוגה שיפוע

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

תהליכים מולקולריים המופעלים על ידי חומצה שולטים מקרוב בכניסת התאים של נגיפים רבים הנכנסים דרך המערכת האנדוציטית. במקרה של נגיף שפעת A (IAV), היתוך הנגיף עם הממברנה האנדוזומלית כמו גם הפירוק שלאחר מכן של הקפסיד הנגיפי, הנקרא ללא ציפוי, נשלט על ידי התנאים היוניים בתוך השלפוחיות האנדוציטיות. קשה לחקור את השלבים המוקדמים במחזור החיים של הנגיף מכיוון שלא ניתן לגשת ישירות לאנדוזומים באופן ניסיוני, מה שיוצר את הצורך בגישה חוץ גופית. כאן אנו מתארים שיטה המבוססת על צנטריפוגה בשיפוע מהירות של ויריונים מטוהרים באמצעות שיפוע גליצרול דו-שכבתי, המאפשר ניתוח של ליבת ה-IAV ויציבותה. השיפוע מכיל חומר ניקוי לא יוני (NP-40) בשכבה התחתונה שלו כדי להסיר את הממברנה הנגיפית על ידי המסה כאשר הנגיף משקע לכיוון הקרקעית. ב-pH ניטרלי, ליבות נגיפיות מגולגלות כמבנים יציבים. ניתן לזהות בבירור את מרכיבי הליבה העיקריים, חלבון מטריצה (M1) והריבונוקלאופרוטאינים הנגיפיים (vRNPs), בשבר הגלולה על ידי SDS-PAGE. הפחתת ה-pH ל-6.0 ומטה בשכבה התחתונה מסירה באופן סלקטיבי את M1 מהגלולה ואחריה שחרור של vRNPs בתנאים חומציים יותר. רצועות חלבון נגיפיות על ג'לים מוכתמים בקומאסי יכולות להיות נתונות לכימות צפוף כדי לנטר מצבי ביניים של פירוק IAV. מלבד pH, ניתן להעריך גורמים אחרים המשפיעים על יציבות הליבה הנגיפית, כגון ריכוז מלח וגורמי הסרת ציפוי נגיפיים משוערים, פשוט על ידי שינוי שכבת הגליצרול המכילה חומר ניקוי בהתאם. יחד, הטכניקה המוצגת מאפשרת ניתוח כמותי וניתן לשחזור של ציפוי ויראלי במבחנה. ניתן ליישם אותו על נגיפים עטופים אחרים שעוברים תהליכי הסרת ציפוי מורכבים.

כפי שכבר דן, יחול ב endosomes נדרש כדי להבהיר את ליבת IAV uncoating מוסמכת. Protonation של הליבה מחליש אינטראקציה של M1 ו- vRNPs (מורכב של רנ&quot;א הנגיפי, NP, ואת פולימראז המורכב PB1 / PB2 / רש&quot;פ). תהליך זה מופעל כאשר וירוס נכנס חשוף pH של 6.5 (או נמוכים) ב endosomes מוקדם (EES) וממשיך עד נתיכי הווירוס בסביבות 5.0 pH ב Les. על מנת לחקות את ה...

פירוק ליבות נגיף שפעת A במהלך כניסת הנגיף לתאי המארח הוא תהליך רב-שלבי. אנו מתארים שיטה במבחנה לניתוח השלבים המוקדמים של הסרת ציפוי נגיפי. בגישה זו, צנטריפוגה בשיפוע מהירות משמשת לניתוח ביוכימי של השלבים המתחילים הסרת ציפוי בתנאים מוגדרים.

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

המטרה הכוללת של סבב צנטריפוגציה זו במדרג מהירות היא לנתח קפסידים של נגיף השפעת A בתנאים המדמים את הסביבה האנדוציטוטית שבה נגיפים נכנסים נתקלים במהלך הכניסה לתא. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח לגבי האופן שבו קפסידים של נגיף השפעת A מתפרקים במהלך הכניסה לתא, כגון ההשפעה הספציפית של pH חומצי קלות על יציבות הקפסיד. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ניתוח כמותי של תהליך פתיחת המעטפת (uncoating) של נגיף השפעת A תחת תנאי ניסוי מוגדרים.בנוסף למתן תובנות לגבי האופן שבו מתחיל תהליך הפריקה (uncoating) של נגיף השפעת A, ניתן להחיל שיטה זו גם על חקר נגיפים מעטופים אחרים עם מנגנוני פריקה דומים. את הפרוצדורה ידגים Firat Nebloglu, סטודנט לשעבר במעבדתי. לאחר הכנת תמיסות המאגריים והריאגנטים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, עבור כל תנאי pH לבדיקה, הכינו תערובת מאסטר של באפר דטרגנט על ידי ערבוב של תשעה מיליליטר של sodium chloride בריכוז 1 Molar, שישה מיליליטר של 10%NP40, 2.4 מיליליטר של מאגר מעכב פרוטאז בריכוז 25X, ותשעה מיליליטר של מים מזוקקים פעמיים.לאחר מכן, עבור כל תנאי pH, העבירו בפיפט 4.4 milliliters של תערובת ה-master mix לשפופרת קונית של 50 milliliter. עבור ערכי pH הגבוהים מ-5.8, הוסיפו לשפופרת 0.6 milliliters של תמיסת המלאי המתאימה של Tris בריכוז 500 milliMolar שהותאמה ל-pH הרלוונט

in-vitro-disassembly-influenza-virus-capsids-gradient

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הגנום של שפעת וירוס כוללת שמונה מתחמים נפרדים של רנ"א וחלבונים, כינה מתחמי ribonucleoprotein ויראלי (vRNPs). מאמר זה מתאר את שיפוע גליצרול טיהור במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים להדמיה של שפעת vRNPs.

טיהור ויזואליזציה של שפעת מכלולים Ribonucleoprotein ויראלי

אנו מתארים את תהליך של בידוד הטוהר גבוהה ההרפס DNA nucleocapsid מן התאים הנגועים. ה-DNA הסופי שנתפסו מן הפתרון של ריכוז הטוהר גבוהה, מה שהופך אותו אידיאלי עבור סידור תפוקה גבוהה, איכות גבוהה התגובות PCR, ו transfections לייצר recombinants ויראלי חדש.

ההכנה של ה-DNA ויראלי של Nucleocapsids

Uncoating היא צעד חיוני בשלב מוקדם של מחזור HIV-1 חיים מוגדר פירוק של הקליפה capsid ואת שחרורו של המתחם ribonucleoprotein ויראלי (vRNP). כאן, אנו מדגימים טכניקות לבידוד גרעינים שלמים מן HIV-1 ו virions לכימות uncoating...

ב Uncoating במבחנה של HIV-1 ליבות

דרך פשוטה, יעילה וחזקה כדי לסנכרן את המסירה של מרכיבים נגיפיים מרובים בתאי צמח...

פשוט וחזק In vivo ו במבחנה גישה ללימוד הרכבה וירוס

נגיפי שפעת לשכפל גנום הרנ"א שלהם בשיתוף עם הכרומטין מארח תאים. כאן, אנו מציגים שיטה לטיהור שלמים מתחמי ribonucleoprotein ויראלי של הכרומטין של תאים נגועים. מטוהרים מתחמי ויראלי יכול להיות מנותח על ידי כתם הן המערבי תחל הרחבה של חלבון ותוכן RNA, בהתאמה.

זיקה טיהור של נגיף השפעת תסביכים Ribonucleoprotein של הכרומטין של תאים נגועים

Source: Stauffer, S. et al. In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the pH-dependent disassembly of influenza A virus (IAV) cores using gradient ultracentrifugation. It outlines glycerol gradient preparation, ultracentrifugation, and how different pH conditions affect IAV core disassembly.

In Vitro Disassembly of the Influenza A Virus Core Using pH-Controlled Gradient Centrifugation

Source: Stauffer, S. et al., In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the effect of pH on the solubilization of influenza A viral cores. Gel electrophoresis and protein staining reveal the progressive disassembly of the core structure under acidic conditions.

Visualizing the Effect of pH on Solubilization of the Influenza A Viral Core

הכינו שני טיפים של פיפט בעלי פיה רחבה על ידי הסרת 2-4 מ"מ מקצה של טיפ בנפח 20 µL באמצעות תער או להב סכיפה חדשים על משטח נקי.

טיהור של אינטסומים של Prototype Foamy Virus באמצעות כרומטוגרפיית הדירה של גדלים (SEC)

מקור: Yates, J. G. E., ואחרים. ייצור של נגיף מחלת ניוקאסל רקומביננטי בתרC גבוה מנוזל אלנטואיס. .J. Vis. Exp (2022)הסרטון מדגים את טהרתם וריכוזן של חלקי וירוס מנוזל אלנטואיס מזולל שנאסף מביצי תרנגולת עם עובריים נגועי וירוס. הוא מציג סדרה שלבי סינון והפרדה, הכוללים סינון עומק (depth filtration), סינון זרימה מומסית (tangential flow filtration) ואולטראצנטריפוגה במדרג צפיפות להבדיל וירוסים שלמים. הפракציה העשירה בווירוסים עוברת לאחר מכן דיאליזה להסרת מלחים שאריתיים ומרכיבי מדרג באמצעות דיפוזיה,...

טיהור נגיף מנוזל האלנטואיס של ביצי תרנגולת עם עוברים

מקור: Gao, Y., et al. יצירה והרכבה של נוקלאוקפסيدات ספציפיות לנגיף של נגיף הסינציטיומ של דרכי הנשימה. J. Vis. Exp. (2021)הסרטון מדגים הרכבה in vitro של נוקלאוקפסيدات ספציפיות לנגיף מקומפלקס מטהר של נוקלאופרוטאין-פוספופרוטאין נטול RNA, את טיהורן באמצעות כרומטוגרפיית החרגתו גודל, ואימות של RNA ויראלי באורכו המלא בתוך החלקיקים המורכבים.

שחזור וטיהור במעבדה (In Vitro) של חלקיקים דמויי נוקלאוקפסיד נגיפיים

וירוס הקשור באדנו מיוצר בתרבית תאי השעיה ומטוהר על ידי צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות יודיקסנול כפולה. צעדים כלולים כדי להגדיל את התפוקה הכוללת של הנגיף, להקטין את הסיכון של משקעים וירוס, ועוד לרכז את המוצר הסופי של הנגיף. הטיטרים הסופיים הצפויים להגיע ל-1012 חלקיקים נגיפיים / מ"ל ומתאימים לשימוש פרה-קליני in vivo .

תרבית תרחיף ייצור וטיהור של וירוס הקשור לאדנו על ידי צנטריפוגת שיפוע צפיפות יודיקסנול עבור יישומי in vivo

למדו ניתוח פירוק capsids של וירוס שפעת A באמצעות צנטריפוגה שיפוע בתנאי pH חומציים קלים. שיטה זו מאפשרת חקר כמותי של תהליך הפתיחה הוויראלי ומנגנוני הכניסה לתא.

במבחנה פירוק של וירוס שפעת capsids ידי צנטריפוגה שיפוע

גלה סרטונים נוספים