במבחנה פירוק של וירוס שפעת capsids ידי צנטריפוגה שיפוע

המטרה הכוללת של סבב צנטריפוגציה זו במדרג מהירות היא לנתח קפסידים של נגיף השפעת A בתנאים המדמים את הסביבה האנדוציטוטית שבה נגיפים נכנסים נתקלים במהלך הכניסה לתא. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח לגבי האופן שבו קפסידים של נגיף השפעת A מתפרקים במהלך הכניסה לתא, כגון ההשפעה הספציפית של pH חומצי קלות על יציבות הקפסיד. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ניתוח כמותי של תהליך פתיחת המעטפת (uncoating) של נגיף השפעת A תחת תנאי ניסוי מוגדרים.

בנוסף למתן תובנות לגבי האופן שבו מתחיל תהליך הפריקה (uncoating) של נגיף השפעת A, ניתן להחיל שיטה זו גם על חקר נגיפים מעטופים אחרים עם מנגנוני פריקה דומים. את הפרוצדורה ידגים Firat Nebloglu, סטודנט לשעבר במעבדתי. לאחר הכנת תמיסות המאגריים והריאגנטים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, עבור כל תנאי pH לבדיקה, הכינו תערובת מאסטר של באפר דטרגנט על ידי ערבוב של תשעה מיליליטר של sodium chloride בריכוז 1 Molar, שישה מיליליטר של 10%NP40, 2.4 מיליליטר של מאגר מעכב פרוטאז בריכוז 25X, ותשעה מיליליטר של מים מזוקקים פעמיים.

לאחר מכן, עבור כל תנאי pH, העבירו בפיפט 4.4 milliliters של תערובת ה-master mix לשפופרת קונית של 50 milliliter. עבור ערכי pH הגבוהים מ-5.8, הוסיפו לשפופרת 0.6 milliliters של תמיסת המלאי המתאימה של Tris בריכוז 500 milliMolar שהותאמה ל-pH הרלוונטי. עבור ערכי pH של 5.8 ומטה, הוסיפו 0.6 milliliters של תמיסת המלאי המתאימה של MES בריכוז 500 milliMolar שהותאמה ל-pH הרלוונטי.

הכינו חמישה מיליליטר של תמיסת בופר, המכילה 300 milliMolar sodium chloride, 2X protease inhibitor, 60 milliMolar Tris, המותאם ל-pH 7.4, ומים מזוקקים פעמיים. תמיסה זו תשמש כבופר גרדיאנט ביקורת נטול דטרגנט. לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיליליטר של תמיסת מקור 50%glycerol לחמישה מיליליטר של תערובות בופר עם דטרגנט ובופר נטול דטרגנט, לקבלת שש תמיסות שונות של 25%glycerol.

השתמשו בניירות pH כדי לוודא את ערכי ה-pH. הכינו תמיסת glycerol בריכוז 15% על ידי ערבוב של מלאי glycerol בריכוז 50% עם מים מזוקקים ביחס של שלושה לשבעה. בעזרת מזרק של 5 mL ומחט, הוסיפו 3 mL של תמיסת glycerol בריכוז 15% לשש מבחנות צנטריפוגה שקופות במיוחד.

שטפו את המחט במים מזוקקים פעמיים לאחר כל שלב. השתמשו במזרק של חמישה מיליליטר ובמחט ארוכה כדי להזריק בזהירות 3.4 מיליליטר של תמיסת 25% glycerol מתחת לשכבת ה-15% glycerol, תוך הקפדה לא לערבב בין שתי השכבות. ממשק בין שתי השכבות נראה בבירור.

חזור על פעולה זו עבור כל ששת התנאים לבדיקה עם תמיסות הגליצרול המתאימות שהותאמו מבחינת pH. לאחר מכן, בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית Class II, השתמש במיליליטר אחד של נוזל אלנטואיס (allantoic fluid) מדולל ומסונן, המכיל נגיף שפעת A, כדי להניח בעדינות שכבה מעל מדרגי הגליצרול. העבר את המבחנות לדלי הרוטור, איזן בין המבחנות הנגדיות, והנח אותן בזהירות לתוך רוטור אולטרסנטריפוגה SW-41 שקולל מראש.

סבבו בצנטריפוגה במהירות 2100 rpm ובטמפרטורה של 12 degrees Celsius למשך 150 דקות. לאחר הצנטריפוגה, השתמשו בפיפט פסטור נקי ובשואב כדי להסיר בזהירות את שתי שכבות הגליצרול. לאחר מכן, השתמשו ב-40 milliliters של 1X non-reducing LDS sample buffer כדי לערבב מחדש את המשקע באופן מלא באמצעות פיפוט מעלה ומטה, לפני העברת הדגימה לשפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 milliliter.

לביצוע SDS-PAGE, חממו את כל הדגימות בטמפרטורה של 95 °C למשך 10 דקות. טענו 20 µL של המשקעים המומסים לתוך mini-gel מסוג precast gradient Bis-Tris והריצו במתח של 200 Volts למשך שעה אחת בבפר רכיצה 1X MOPS SDS. הדגירו את הג'ל בתמיסת קיבוע למשך שעה אחת.

שטפו פעם אחת או פעמיים במים, וצבעו למשך לילה בצלחת תרבית תאים של 15 סנטימטר עם נפח מספיק של תמיסת colloidal Coomassie תוך כדי ניעור עדין בטמפרטורת החדר. הסירו את הצבע מהג'ל במים מזוקקים פעמיים, תוך החלפת הנוזל מדי 15 עד 20 דקות עד שרקע הג'ל יהיה שקוף. שמרו את הג'ל במים מזוקקים פעמיים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד לסריקתו לצורך כימות הפסים.

לבסוף, סרקו את הג'ל ברזולוציה גבוהה והשתמשו בתוכנה מסחרית ייעודית לכימות עוצמות פסי החלבון. החסירו את אות הרקע מאזור סמוך לפסים הרלוונטיים ונרמלו את הערכים ביחס לערכי הביקורת ללא הדטרגנט. בניסוי זה, X31 שהופק מנוזל אלנטואיס מזוקק הוכפף לסבב צנטריפוגה במדרג מהירות (velocity gradient centrifugation) ברמות pH שבין 7.4 ל-5.0, ונותח באמצעות SDS-PAGE.

בהיעדר דטרגנט במדרג, ויריונים שלמים שוקעים למשקע, כפי שמשתקף בדפוס הפסים האופייני המייצג את HA, NP ו-M1 בג'ל שנצבע ב-Coomassie. עם הוספת NP40 לשכבת הגליצרול התחתונה, המעטפת הוויראלית, כולל HA, NA ו-M2, הומסה ורק הליבה הוויראלית שקעה למשקע במהלך אולטרה-צנטריפוגציה. החל מ-pH נמוך מ-6.5, M1 הולך ואובד מחלק המשקע, ומגיע למינימום בין pH 5.8 ל-pH 5.4.

בערכי pH נמוכים מ-5.8, ה-vRNPs התפרקו ובשל כך אבדו מהמשקע. מניתוח פסי החלבון נחשפו שני ספי pH מובחנים לפירוק שכבת ה-M1 ולדיסוציאציה של צמורי ה-vRNP, pH 6.5 ו-pH 5.8, בהתאמה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי בהתאם לזן ספציפי של נגיף השפעת A או למוטציה שלו, עשויות להופיע תכונות פירוק שונות.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית כדי להשיג תובנות נוספות, כגון מבנה של קפסידים מבודדים של נגיף השפעת.