Name: לימוד Wnt איתות במהלך דפוסים של איירווייס ניצוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: חקור את תפקיד מסלול האיתות Wnt בפיתוח דרכי הנשימה העליונות באמצעות עכברי דגימה גנטית. שיטות הצביעה מאפשרות ניתוח מפורט של דפוסי רקמת הנשימה והתמיינות תאים בפיתוח עוברי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים את עזרתו של מייק Muntifering ומאט Kofron עם הדמיה confocal וגייל Macke לנהלים היסטולוגית. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות-NHLBI (K01HL115447 כדי DS).

בעלי חיים שוכנו בתנאים הפתוגן חינם. עכברים שטופלו על פי הפרוטוקולים שאושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים CCHMC ועדת שימוש (סינסינטי, אוהיו ארה&quot;ב). עכברים מנוצלים ברחבי המחקרים הללו נשמרו רקע מעורב. 1. הר שלם X-galactosidase מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים הנשי בהריון E11.5 כדי E14.5, משאיפת CO 2. מניחים חיות בתא 2 CO, לחייב את החדר עם CO 2. לשמור על חיות בתא עבור מינימום של 5 דק &#39;. ישם שיטה משנית של המתת חסד על ידי נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באזור הבטן נקי עם אתנול (EtOH) 70% ולבצע laparotomy עם חתך קו האמצע בטן אחת. לנצל מספריים כירורגיות דפוס סטנדרטי (ישר מסורית) מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד קרני הרחם באמצעות מלקחיים ומספריים בסדר ומכניסים מיד רקמות בצלחת פטרי המכילות מקורר פתרון PBS. לשמור על רקמות על הקרח עד הליךלבידוד של עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד עובר מן קרן רחם. לנתח רקמת ריאה קנה נשימה עוברית באמצעות מיקרוסקופ לנתח. לנצל מלקחי טיפ נאים ומספריים להחזיק לנקב את רקמת רחם concepti משחרר את העוברים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר הנותרים ממברנות עובריים. עם להבי סיוע של מחט לחתוך ראש עובר וחלק גוף תחתון מתחת לסרעפת. אתר כבד כציון דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הבידוד של אזור החזה של העובר, להמשיך להסיר צדדים לרוחב קיר גוף, עמוד השדרה ולהבי מחט באמצעות לב. תשמור על עצמך תוך הסרת הלב כדי למנוע פציעת רקמות קנו נשימה. לבסוף, בזהירות, להפריד בין הוושט מקנה הנשימה על ידי משיכת הוושט עם סיוע של להבי מחט. לשמור על רקמה בתמיסת PBS על קרח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום רקמת 4 מיליליטר בורג בקבוקוני כובע באמצעות טפטפות זכוכית או העברה. תקן רקמת הריאה קנה הנשימה paraformaldehyde 4% (PFA) ב PBS למשך 30 דקות. לאחר קיבוע,לשטוף רקמה עם PBS. בעוד שטיפה, להכין פתרון מכתים X-gal (להוסיף 5 מ&quot;מ K 3 Fe (CN) 6, (100 μl 0.5 M לני&quot;ע) 5 מ&quot;מ K 4 Fe (CN) 6 (100 μl 0.5 M המניות) 2 מ&quot;מ MgCl 2, ( 20 μl 1 M לני&quot;ע) 0.01% NaDOC (50 המניות μl 2%), 0.02% NP 4 O (100 μl 2% מניות), 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל X-gal (500 μl של 20 מ&quot;ג / ml המלאי) ו 9.13 מ&quot;ל של מים מזוקקים להביא לנפח סופי של 10 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל PBS הנותרים ומוסיפים 2 מ&quot;ל של תמיסת מכתים X-gal בקבוקון זכוכית. מניחים צלוחיות במגש על שייקר. כתם רקמות 1 עד 2 שעות בתמיסה מכתימה X-gal. דגירת הרקמה בתמיסת X-gal במשך 4 שעות לעיבוד והטבעה נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את התגובה על ידי רקמות כביסה ב-PBS sulfoxide דימתיל 3%. יש לשטוף ב- PBS, 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד לשטוף ולאחסן באתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו צלחות פטרי עם פתרון 1% agarose / PBS. אפשר agarose כדי לחזק. באמצעות טפטפות העברת זכוכית, למקם את הרקמה על שיתוף agaroseצלחות ated מלאים פתרון PBS. לצלם mounts כל באמצעות מיקרוסקופ לנתח. בחר מסנן מתאים brightfield. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבחין טוב יותר את האתרים של דגימות תהליך מכתים X-gal להטבעת פרפין חתך. דגימות מקום קלטות מסך בסדר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעבד דגימות להטבעת פרפין ושימוש במעבד אוטומטי להגדיר מחזור קצר כדלקמן: שישה שינויים של אלכוהול: שינוי ראשון 5 דקות ו -3 דקות לכל שינוי נותר. שלושה שינויים של קסילן: 5 שינוי הראשון דקות ו -3 דקות הבאים שני שינויים. השלבים הקודמים מבוצעים על 30 מעלות צלזיוס. לבסוף, לבצע שלושה שינויים של פרפין ב 62 ° C: 25 דקות, 8 דקות ו -5 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות אוריינט להטבעה עם הרקמה שוכבת על הקרקעית של הטבעת סירה. בזהירות להוסיף פרפין למלא את סירת ההטבעה. מגניב מיד על צלחת קרה של הטבעת תחנה עד מתמצק פרפין. סור בלוק מן הטבעת סירה. באמצעות microtome, ליצור 6 מיקרומטר sections. סעיפי הר בשקופיות-pretreated ומגלשות יבשות על סט חם שקופית על 42 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופים מחליקים לילה בתנור ב 56 ºC. מניח שקופיות מתלות. Deparaffinize מחליק עם שלושה שינויים של 100% קסילן, 10 דקות כל אחד. השתמש מכתים מנות מלאות 200 מ&quot;ל של קסילן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננותם שקופיות באמצעות סדרת EtOH מדורגים (100%, 70%, 50% ו -30%, 1 דקות לכל שלב) כדי PBS לפני counterstaining עם אדום מהיר גרעיני במשך 10 עד 30 שניות. יש לשטוף שקופיות עם ברז מים שלוש פעמים במשך 5 דקות בכל פעם כדי להסיר עודפים של Red הגרעיני המהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשי שקופיות בסדרת EtOH מדורגת (50%, 70% ו -100% EtOH) לפני הכביסה בשלושה שינויים של קסילן (20 מטבלים כל שינוי) ומכסים מחליקים עם תקשורת הרכבה מבוססת קסילן. </li></ol> 2. לקטינים מכתימים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח רקמת הריאה E13.5 ו E14.5 קנה הנשימה כמתואר בשלבים 1.1 כדי 1.4. באמצעות טפטפות העברת זכוכית רקמות מקום בקבוקונים מתברג. תקן רקמת הריאה קנה הנשימה עם 2 מ&quot;ל של2% פתרון PFA לילה ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר קיבוע, לשטוף דגימות PBS שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין חיץ חסימה, בדרך כלל נפח סופי של 10 מיליליטר של תמיסה. להוסיף 0.1 גרם של BSA (1%) ל -8 מ&quot;ל של PBS. אפשר BSA לפזר. להוסיף 0.2 מ&quot;ל של סרום עיזים (2%) 0.03ml של טריטון X-100 (0.3%). תביאו נפח סופי 10 מ&quot;ל עם PBS. דגימות בלוק עבור שעה 1 ב 0.5 מ&quot;ל של חיץ חסימת בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חוצץ חסימה בעזרת פיפטה העביר ולהחליף עם פתרון לקטינים המורכב של 50 מיקרוגרם / μl של לקטינים, 10% בסרום עיזים PBS. השתמש 250 μl של פתרון לקטינים לדגימה. דגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. הקפד לכסות את בקבוקון זכוכית המכיל רקמות ברדיד אלומיניום. לאחר הדגרה עם פתרון לקטינים, לשטוף דגימות PBS שלוש פעמים במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> explants מקום בצלחות פטרי מצופה agarose המכילים מספיק PBS לכסות דגימות. לצלם mounts כולו באמצעות מיקרוסקופ לנתח קרינה. בחר את appropמסנן riate לזהות קרינה. לקטינים PNA בדרך כלל מצמידים GFP. </li></ol> 3. הר שלם Immunofluorescence מכתים מיקרוסקופית Confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד רקמת ריאה קנה נשימה, להעביר 4 ​​מיליליטר בקבוקוני כובע זכוכית בורג ולתקן לילה PFA 4%. רקמת E11.5 יכולה להיות קבועה 2% PFA. חנות מתנול 100%. דוגמאות ניתן לאחסן עד מספר חודשים ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מתנול באמצעות פיפטה העברת permeabilize דגימות באמצעות האקונומיקה של דנט (4 חלקים מתנול, 1 חלק DMSO ו 1 חלק 30% H 2 O 2) עבור 2 שעות. רקמת סודה בסדרה של מתנול מדורגים מדולל PBS כדלקמן: 100 מתנול%, 75% מתנול, 50% מתנול, 25% מתנול, 100% PBS. דגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר במהלך כל שלב של הידרציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת הבלוק מגיב חסימת 0.5% בדילול מלא PBS (ראה חומרים לפרטים נוספים) למשך שעות בטמפרטורת חדר עם תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל נוגדן עיקרי חסימהפתרון (Sox9 1: 100, 1 Nkx2.1: 200, 1 αSMA: 250) דגירה דגימות לילה בשעה 4 ° C.. לשטוף דגימות עם PBS חמש פעמים בטמפרטורת החדר. בצע כל שטיפה במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל נוגדנים משני ביחס של 1: דילול 500 בתמיסת חסימת 0.5%. בחר בקפידה נוגדנים משני למנוע מחייב בין נוגדנים משני. דגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס בחדר חשוך. לשטוף דגימות שלוש פעמים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. מייבשי דגימות בסדרה של מתנול מדורגת מדולל PBS כדלקמן: מתנול 25%, 50% מתנול 75% מתנול, מתנול 100%, 10 דקות כל אחד צעד. הערה: ודא כי דגימות להישאר מכוסה בנייר אלומיניום ולצמצם את החשיפה לאור. רקמות כעת ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות עד להצטלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות העברה מחוייט צלחות הבמה, להסיר מתנול וברור עם כ 200 μl של פתרון ברור של מוריי 19,20 (2 חלקים בנזיל בנזואט, 1 חלק בנזיל אלכוהול) מיד BEFהדמית עפרות. לצלם באמצעות מיקרוסקופ confocal. לעבד ולנתח תמונה באמצעות תוכנת הדמיה. </li></ol> התפשטות תאים 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק עכברי E11.5 בהריון תוך peritoneally עם תמיסה של BrdU בריכוז של 100 מיקרוגרם BrdU / גרם של משקל גוף. הקורבן נקבה כמתואר בסעיף 1 של הפרוטוקול ולבודד העוברים E12.5 או E13.5. שימוש להבי סכין, ראשי בלו החלק התחתון של הגוף מתחת חלל בית החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים רקמות החזה ב 4 מ&quot;ל בורג בקבוקונים כובע ולתקן ב 1 מ&quot;ל של 4% PFA לילה. לשטוף דגימות עם PBS פעמים במשך 5 דקות ו מייבשות דגימות באמצעות סדרת אתנול מדוללת מים מזוקקים אתנול 70% כדלקמן: 30%, 50% ו -70% אתנול, במשך 5 דקות כל אחד צעד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום דגימות קלטות מסך בגודל בינוני. תהליך רקמה והטבעה פרפין באמצעות מעבד אוטומטי. הגדרת מחזור כדלקמן: שישה שינויים של אלכוהול במשך 8 דקות כל אחד, שלושה שינויים של קסילן במשך 6 דקות כל אחד, שלושה גhanges של פרפין, במשך 25 דקות, 9 דקות ו -8 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע פרפין המכוונת את הרקמה המיקום הרצוי כדי ליצור 6 רוחבי מיקרומטר או סעיפים האורך כמפורט בסעיפים מקום בסעיף 1. בשקופיות ולאפשר רקמות לדבוק להחליק על הסט חם השקופית על 42 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות אופות, על צדם, הלילה בתנור ב 56 ° C. מניח שקופיות מתלות פלסטיק. שקופיות דה-paraffinize ידי טבילה שלושה שינויים של 100% קסילן, 10 דקות לכל שינוי. השתמש 200 מ&quot;ל של קסילן להטביע שקופיות לחלוטין. רעננותם שקופיות באמצעות סדרת EtOH מדורגת (100%, 70%, 50% ו -30%, 5 דקות לכל שלב עם תסיסה) כדי PBS (5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע אחזור אנטיגן באמצעות 10 מ&quot;מ חיץ ציטראט, pH 6. כדי להכין 100 מ&quot;ל של תערובת חיץ ציטראט 18 מ&quot;ל של 0.1 מ חומצת לימון monohydrated ו -82 מ&quot;ל של 0.1 מ &#39;נתרן ציטרט. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום דגימות בצנצנות coplin פלסטיק מלא פתרון יחזור אנטיגן ומיקרוגל עבור 6.5 דקות בהספק גבוה. להוסיף דיסtilled מים בצנצנת coplin כדי לפצות על חיץ לחמם ציטראט-התאדה בהספק 40% במשך 6 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו צנצנת coplin לראש עם מים, לחמם שוב בהספק 40% במשך 6 דקות. פעמי מיקרוגל עשויים להשתנות בהתאם מיקרוגל בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר שקופיות להתקרר במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר לפני שקופיות כביסה במים מזוקקים במשך 1 דקות, ואחריו PBS במשך 5 דקות. לאחר PBS לשטוף, מגלשות בלוק עבור שעה 2 בתמיסה המכילה חוסם TBS (2.425 גרם של בסיס טריס ו 8.765 גרם של NaCl מדולל 1 ליטר של מים מזוקקים) 10% בסרום חמור 1% BSA. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נוגדנים עיקריים מדוללי חסימת הפתרון (TBS המכיל סרום 10% חמורים 1% BSA). BrdU (סמן מיטוזה), Nkx2.1 (אפיתל דרכי הנשימה), Sox9 (תאים יהיה להצמיח סחוס) ו αSMA (תאי שריר חלק). דגירת שקופיות הלילה, ב 4 מעלות צלזיוס. השתמש בשיטת כיסוי כדי לשמר נוגדנים. החל 180 μl של נוגדני אטם ולאחר מכן לצרף שקופית כאילו כיסוי להחליקפינג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק אטם ידי טבילת שקופיות לתוך מים מזוקקים. לאחר הסרת האטם, לשטוף נוגדן ראשוני מאוגד על ידי ביצוע שש 5 שטיפות דקות עם כפות המכילות 0.1% Tween-20. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שקופיות עם נוגדנים משני מדולל חסימת פתרון בדילול של 1: 200, 1 שעות בטמפרטורת החדר. בחר נוגדנים משני בזהירות כדי למנוע רצויים מחייב ביניהם. סור נוגדנים משני מאוגד על ידי ביצוע שלושה חמישה שוטף דקות עם כפות המכילות Tween 0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות 0.1 בסיס M טריס פעמים במשך 5 דקות ולאחר מכן 0.05 בסיס M טריס פעמים במשך 5 דקות. שקופיות ניתן להשאיר 0.05 מ &#39;טריס בסיס תוך coversliping באמצעות התקשורת הרכבה עם או בלי DAPI (1.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל). שקופיות חנות בתיקיית שקופיות ב 4 ° C ולהגן מפני אור על ידי כיסוי תיקייה עם רדיד אלומיניום. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיין מכתים ולצלם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי. רוזן שכותרתו תאי תאים הכוללים לכל שדה מצולם20X ו 40X לקבוע יחסים של מתרבי תאים לתאים כוללים. </li></ol>

<ol><li>Maeda, Y., Dave, V., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of lung morphogenesis.</a> Physiol Rev. 87, 219-244 (2007).</li>
<li>Morrisey, E. E., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+for+the+first+breath%3A+genetic+and+cellular+mechanisms+in+lung+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development.</a> Dev Cell. 18, 8-23 (2010).</li>
<li>Fausett, S. R., Klingensmith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+the+foregut+tube%3A+developmental+origins+of+the+trachea+and+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of the foregut tube: developmental origins of the trachea and esophagus.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 184-202 (2012).</li>
<li>Goss, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt2%2F2b+and+beta-catenin+signaling+are+necessary+and+sufficient+to+specify+lung+progenitors+in+the+foregut%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt2/2b and beta-catenin signaling are necessary and sufficient to specify lung progenitors in the foregut.</a> Dev Cell. 17, 290-298 (2009).</li>
<li>Harris-Johnson, K. S., Domyan, E. T., Vezina, C. M., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Catenin+promotes+respiratory+progenitor+identity+in+mouse+foregut%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">beta-Catenin promotes respiratory progenitor identity in mouse foregut.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16287-16292 (2009).</li>
<li>Cornett, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wntless+is+required+for+peripheral+lung+differentiation+and+pulmonary+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wntless is required for peripheral lung differentiation and pulmonary vascular development.</a> Dev Biol. 379, 38-52 (2013).</li>
<li>Snowball, J., Ambalavanan, M., Whitsett, J., Sinner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BEndodermal+Wnt+signaling+is+required+for+tracheal+cartilage+formation%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">34;Endodermal Wnt signaling is required for tracheal cartilage formation&#34;.</a> Dev Biol. , (2015).</li>
<li>Shannon, J. M., Hyatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+interactions+in+the+developing+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal interactions in the developing lung.</a> Annu Rev Physiol. 66, 625-645 (2004).</li>
<li>Shannon, J. M., Nielsen, L. D., Gebb, S. A., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchyme+specifies+epithelial+differentiation+in+reciprocal+recombinants+of+embryonic+lung+and+trachea%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Mesenchyme specifies epithelial differentiation in reciprocal recombinants of embryonic lung and trachea.</a> Dev Dyn. 212, 482-494 (1998).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+regulates+Shh+and+Fgf10+signaling+during+lung+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt5a regulates Shh and Fgf10 signaling during lung development.</a> Dev Biol. 287, 86-97 (2005).</li>
<li>Loscertales, M., Mikels, A. J., Hu, J. K., Donahoe, P. K., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+pulmonary+Wnt5a+directs+airway+and+vascular+tubulogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Chick pulmonary Wnt5a directs airway and vascular tubulogenesis.</a> Development. 135, 1365-1376 (2008).</li>
<li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+FGF-WNT+gene+regulatory+network+controls+lung+mesenchyme+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">An FGF-WNT gene regulatory network controls lung mesenchyme development.</a> Dev Biol. 319, 426-436 (2008).</li>
<li>Shu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+acts+upstream+of+N-myc%2C+BMP4%2C+and+FGF+signaling+to+regulate+proximal-distal+patterning+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling acts upstream of N-myc, BMP4, and FGF signaling to regulate proximal-distal patterning in the lung.</a> Dev Biol. 283, 226-239 (2005).</li>
<li>Bretholz, A., Morrisey, R., Hoffman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+OpdA+in+rat+models+of+organic+phosphorus+%28OP%29+poisoning%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">The use of OpdA in rat models of organic phosphorus (OP) poisoning.</a> Toxicology. 257, (2009).</li>
<li>Goss, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt2+signaling+is+necessary+and+sufficient+to+activate+the+airway+smooth+muscle+program+in+the+lung+by+regulating+myocardin%2FMrtf-B+and+Fgf10+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt2 signaling is necessary and sufficient to activate the airway smooth muscle program in the lung by regulating myocardin/Mrtf-B and Fgf10 expression.</a> Dev Biol. 356, 541-552 (2011).</li>
<li>Mucenski, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Catenin+is+required+for+specification+of+proximal%2Fdistal+cell+fate+during+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">beta-Catenin is required for specification of proximal/distal cell fate during lung morphogenesis.</a> J Biol Chem. 278, 40231-40238 (2003).</li>
<li>Hyatt, B. A., Shangguan, X., Shannon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-10+induces+SP-C+and+Bmp4+and+regulates+proximal-distal+patterning+in+embryonic+tracheal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">FGF-10 induces SP-C and Bmp4 and regulates proximal-distal patterning in embryonic tracheal epithelium.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L1116-L1126 (2004).</li>
<li>Del Moral, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-A+signaling+through+Flk-1+is+a+critical+facilitator+of+early+embryonic+lung+epithelial+to+endothelial+crosstalk+and+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis.</a> Dev Biol. 290, 177-188 (2006).</li>
<li>Ott, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy+in+large+insect+brains%3A+zinc-formaldehyde+fixation+improves+synapsin+immunostaining+and+preservation+of+morphology+in+whole-mounts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy in large insect brains: zinc-formaldehyde fixation improves synapsin immunostaining and preservation of morphology in whole-mounts.</a> J Neurosci Methods. 172, 220-230 (2008).</li>
<li>Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-reconstruction+of+blood+vessels+by+ultramicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy.</a> Organogenesis. 5, 145-148 (2009).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Sox9+by+Sonic+Hedgehog+%28Shh%29+is+essential+for+patterning+and+formation+of+tracheal+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Regulation of Sox9 by Sonic Hedgehog (Shh) is essential for patterning and formation of tracheal cartilage.</a> Dev Dyn. 239, 514-526 (2010).</li>
<li>Elluru, R. G., Thompson, F., Reece, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+18+gives+growth+and+directional+cues+to+airway+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 18 gives growth and directional cues to airway cartilage.</a> Laryngoscope. 119, 1153-1165 (2009).</li>
<li>Ahnfelt-Ronne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+three-dimensional+reconstruction+of+protein+expression+patterns+in+intact+mouse+and+chicken+embryos+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An improved method for three-dimensional reconstruction of protein expression patterns in intact mouse and chicken embryos and organs.</a> J Histochem Cytochem. 55, 925-930 (2007).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li>
<li>Gillotte, D. M., Fox, P. L., Mjaatvedt, C. H., Hoffman, S., Capehart, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+method+for+analysis+of+chondrogenesis+in+limb+mesenchyme+from+individual+transgenic+%28hdf%29+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">An in vitro method for analysis of chondrogenesis in limb mesenchyme from individual transgenic (hdf) embryos.</a> Methods Cell Sci. 25, 97-104 (2003).</li>
<li>Cohen, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+regulates+smooth+muscle+precursor+development+in+the+mouse+lung+via+a+tenascin+C%2FPDGFR+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling regulates smooth muscle precursor development in the mouse lung via a tenascin C/PDGFR pathway.</a> J Clin Invest. 119, 2538-2549 (2009).</li>
<li>Boucherat, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+functional+redundancy+between+Hoxa5+and+Hoxb5+paralog+genes+during+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Partial functional redundancy between Hoxa5 and Hoxb5 paralog genes during lung morphogenesis.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L817-L830 (2013).</li>
</ol>

&quot;החוקרים אין לי מה לחשוף.&quot;

אירועים שבבסיס morphogenesis של דרכי הנשימה אינם מובנים לחלוטין, במיוחד את ההליכים הנדרשים דפוסים של דרכי הנשימה ניצוח. מחקרים קודמים השתמשו בטכניקות vivo לשעבר שבו explants בפיתוח מתורבת על שלבי נוזלי אוויר או מוטבע matrigel 21,22. מחקרים אלה הראו כיצד גורמי גדילה להשפיע על הדפוסים של קנה הנשימה בפיתוח ויצירת סחוס קנה נשימה. מגבלה המחקרים הללו היא כי הארכיטקטורה של רקמות אינו מתוחזק כראוי ולכן, הם לא יכולים ממש לשחזר את in vivo תהליך chondrogenesis. <...

פיתוח דרך נשימה הוא שיזם עוברי היום 9 (E9) עם הופעתו של תאים חיוביים Nkx2.1 ב endodermal גחון 1,2 במעי קדמי. הפרדת צינור ושט-קנה נשימה תפתור ידי E11.5 כשהצינורות ניתן להבחין כישויות נפרדות, כל אחת מוקף mesenchymal רקמות 3. איתות Wnt ממלא תפקיד מרכזי במפרט של דרכי הנשימה כמו מחיקת Wnt2 ו Wnt2b, שהביעו mesenchyme ומחיקה של β-קטנין splanchnic מן האפיתל הנשימה endodermal תגרום agenesis ריאות 4,5. המחקרים הקודמים שלנו נקבע כי מחיקה של WLS, הפרשה בתיווך רצפטור המטען של כל הליגנדים Wnt, מתוצאות בדרכי הנשימה endodermal ב hypoplasia ריאות, פגמים בהתפתחות כלי דם ריאתי דפוסים mis של mesenchyme קנה הנשימה 6,7. נתונים אלה תומכים בחשיבות של הקרו אפיתל mesenchymalss לדבר התמיינות תאים מפרט, כפי שהוא גם הוכח במחקרים אחרים 8,9. המחקר של השלבים המוקדמים ביותר של התפתחות הריאות מסתמך על גנטיים, במבחנה טכניקות vivo לשעבר כי אפשרו לנו להבין מנגנונים טובים יותר נהיגה זהות הנשימה 10-16. תרבויות ריאות explant כולו על שלבי נוזלי אוויר כבר נוצלו נרחב כדי לחקור את ההשפעות של גורמי גדילה בשלבים המוקדמים של ריאתי הסתעפות morphogenesis 10,17,18. אמנם שיטה זו משמשת ההודעה של שינויים מורפולוגיים, כגון המורפוגנזה הסתעפות, אפנון ביטוי גנים, היא מוגבלת ללימוד בשלבים המוקדמים של תהליך התפתחותי, כמו התרבות עצמה אינה תומכת בפיתוח כלי הדם 17. פיתוח של סחוס קנה נשימה דורש פעמי דגירה כבר שעשויה להיות לא תואמים עם טכניקת תרבות זו. כדי analyzדואר התפקיד של איתות Wnt במהלך היווצרות בדרכי נשימה, מתאמנים בטכניקות מקובלות כדי לענות על הצרכים של המחקרים העובריים שלנו. יש לנו שונה כרכים, פעמים מכתימות, רכיבת עיבוד להטבעת פרפין ועיתוי לסליקה של רקמות קנו נשימה וריאות. המטרה העיקרית של אופטימיזציה של הטכניקות המתוארות במחקר הנוכחי הייתה לנתח את השלבים המוקדמים של פיתוח קנה הנשימה אצל עכברים המתרחשים מ E11 ל E14.5. שימוש Axin2LacZ קו העכברים כתב לנו האתרים לקביעה מדויקת של פעילות Wnt / β-קטנין ב mesenchyme קנה הנשימה מתפתח. גם אנחנו צריכים להתאים לקטינים ההליך מכתים עבור רקמות קנה הנשימה הר שלם. לפיכך, הצלחנו לחזות condensations mesenchymal ולחזות אתרים שבהם chondrogenesis יתקיים. הכתמה של הר שלם וחתכים של רקמה עוברית שהתקבלה בעכברי WlsShhCre, בשילוב עם שיטות מיקרוסקופיה מתקדמות, אפשרה לנו לחשוף את התפקיד של הליגנדים Wnt המיוצרים על ידי traהאפיתל Cheal ב דפוסים קנה הנשימה.

<table><tbody><tr><td>אנטי סוקס9 אב.</td><td>Millipore</td><td>AB5535</td><td>1:400 , ארנב</td></tr><tr><td>אנטי סוקס9 ab.</td><td>סנטה קרוז</td><td>Sc-20095</td><td>1:50, ארנב</td></tr><tr><td>אנטי שריר חלק אקטין ab.</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td>1:2k, עכבר</td></tr><tr><td>Anti NKX2.1 ab.</td><td>Seven Hills</td><td>n/a</td><td>1:100, שרקן ניסיונות</td></tr><tr><td>Anti NKX2.1 ab.</td><td>שבע גבעות</td><td>n/a</td><td>1:400, עכבר</td></tr><tr><td>אנטי ברדו ab.</td><td>Abcam</td><td>AB1893</td><td>1:200, כבשים</td></tr><tr><td>אנטי ברדו ab.</td><td>סנטה קרוז</td><td>SC-32323</td><td>1:4k,</td></tr><tr><td>עכבר PNA לקטין</td><td>סיגמא</td><td>L 7381</td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים משניים</td><td>טכנולוגיות</td><td></td> חיים <td>אלקסה פלואור בדיקות מולקולריות</td></tr><tr><td>K3Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>P8131</td><td></td></tr><tr><td>K4Fe(CN)6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaDOC</td><td>Life Technologies</td><td>89905</td><td></td></tr><tr><td>NP4O</td><td>Life Technologies</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Sigma</td><td>A-3157</td><td></td></tr><tr><td>מותג פישר סופר-פרוסט פלוס</td><td>פישר</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>PFA (16%)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי</td><td>Sigma</td><td>11K413</td><td></td></tr><tr><td>מגיב חוסם</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>רכיב ערכת TSA #2&nbsp; &nbsp; &nbsp; ( T20932)</td></tr><tr><td>BrDu</td><td>Sigma</td><td>B5002-5g</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield הרכבה בינונית</td><td>מעבדות וקטור</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>קלטות Tissue-loc Histoscreen</td><td>Fisher</td><td>C-0250-GR</td><td></td></tr><tr><td>קלטות ביופסיה</td><td>Premiere</td><td>BC0109</td><td>זמין בצבעים שונים</td></tr><tr><td>גרעיני מהיר אדום&nbsp; קרנכטרוט 0.1%</td> <td>סיגמא</td><td>N3020</td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון</td><td>סיגמא</td><td>C1909-500G</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט טריביסיק דיהידראט</td><td>סיגמא</td><td>S4641-1 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>טריזמה הידרוכלוריד</td><td>סיגמא</td><td>T5941-500G</td><td></td></tr><tr><td>קסילן</td><td>פארמקו-AAPER</td><td>399000000</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>פארמקו-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>סכיני מיקרו</td><td>FST</td><td>10318-14</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 מצופה קרמיקה</td><td>FST</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5CO</td><td>FST</td><td>11295-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Thermo / Shandon Excelsior ES</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2135</td><td></td></tr><tr><td>Nikon i90</td><td>מיקרוסקופ שדה רחב של ניקון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NikonA1Rsi</td> מיקרוסקופיה קונפוקלית <td>של ניקון</td><td></td><td>. הגדרות: מצלמת NikonA1 plus, סורק: Galvano, גלאי: DU4. תוכנית אופטיקה Apo lambda 10X. אופנה: קונפוקל לייזר פלואורסצנטי בשדה רחב.&nbsp;</td></tr><tr><td>Leica MS 16 FA</td><td>Leica</td><td></td><td>פלואורסצנטי מיקרוסקופ ניתוח</td></tr><tr><td>Zeiss Zeiss</td><td></td><td></td><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי</td></tr><tr><td>Leica Application</td><td></td><td></td><td>Suite Leica תוכנת הדמיה</td></tr><tr><td>NIS</td><td>Nikon</td><td></td><td>תוכנת הדמיה</td></tr><tr><td>IMARIS</td><td>Bitplane</td><td></td><td>הדמיה תוכנה</td></tr></tbody></table>

לימוד wnt איתות במהלך דפוסים של איירווייס ניצוח

Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Wnt מסלולי איתות ממלאים תפקידים קריטיים במהלך התפתחות דרכי הנשימה. נדרשת הגדרת מנגנונים מדויקים של התמיינות ומורפוגנזה הנשלטים על ידי איתות Wnt כדי להבין כיצד רקמות מעוצבות במהלך התפתחות תקינה. ידע זה הוא קריטי גם לקביעת האטיולוגיה של מומים מולדים כגון היפופלזיה של הריאות וטרכאוברונכומלציה. ניתוח השלבים המוקדמים ביותר של התפתחות דרכי הנשימה מציב אתגרים, שכן כמות הרקמה המוגבלת מונעת ביצוע של פרוטוקולים סטנדרטיים המתאימים יותר למחקרים לאחר הלידה. במאמר זה, אנו דנים במתודולוגיות לחקר התמיינות והתפשטות תאים בדרכי הנשימה. אנו מתארים טכניקות כגון צביעה שלמה, עיבוד הרקמה למיקרוסקופיה קונפוקלית ואימונופלואורסצנציה בקטעי פרפין המיושמים להתפתחות ריאות קנה הנשימה. אנו דנים גם במתודולוגיות לחקר התמיינות מזנכימה קנה הנשימה, בפרט היווצרות סחוס. גישות וטכניקות שנדונו במאמר הנוכחי עוקפות את מגבלת החומר תוך כדי עבודה עם רקמה עוברית, ומאפשרות הבנה טובה יותר של תהליך הדפוס של פיתוח דרכי נשימה מוליכות.

Wnt / פעילות β-קטנין מכתים ההר שלם Lac-Z זוהה רקמות קנו נשימה וריאות של עוברים מבודדים כתב Axin2 Lac -Z עכברי 11. אתרים של מכתים לציין פעילות Wnt / β-catenin. ניתוח סעיפים של מכתים הר שלם נקבע כי פעילות Wnt / β-קטנין נכח mesenchyme של קנה הנשימה ב mesenchyme של אזורי הפריפריה של הריאות מתפתחות. בעוברים ...

שימוש עכברי כתב מצמידים את ההר שלם וסעיף מכתים, מיקרוסקופיה מבחני vivo מקל על הניתוח של המנגנונים העומדים בבסיס הדפוסים הנורמלים של דרך הנשימה. כאן אנו מתארים כיצד טכניקות אלה תרמו ניתוח איתות Wnt במהלך התפתחות קנה נשימה.

לימוד Wnt איתות במהלך דפוסים של איירווייס ניצוח

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

המטרה הכוללת של נהלי הצביעה היא להדגים את תפקידו של מסלול האיתות Wnt בשלבים המוקדמים של התפתחות דרכי הנשימה העליונות, באמצעות רקמה עוברית ממודלים של עכברים שעברו הנדסה גנטית. שיטות אלו יכולות לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה הריאתית, כגון, למשל, כיצד נקבע הדפוס של מבני התמיכה בדרכי הנשימה המוליכות.הטכניקות שנגיש כאן יאפשרו לנו לחקור שגשוג תאים או את תהליך העיבוי המזנכימלי, שהם אירועי מפתח בהיווצרות הסחוס בקנה הנשימה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה בכמויות קטנות של רקמה. זה כולל תרביות רקמה של ריאות, וקנה נשימה שבודדו מעוברים בשלב E11.באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בפרוצדורה זו יתקשו בשל גודל הדגימה, כמו גם בשל כמות הרקמה המוגבלת הזמינה. יש להרגיש ביטחון בעבודה עם רקמות עובריות, וניתן להשיג זאת על ידי מתן תשומת לב לאורך כל השלבים ווידוא שכמות הרקמה הזמינה נשארת עקבית משלב לשלב. לאחר ביצוע הדומה לנקבה בהריון בנקודות זמן E11.5 עד E14.5, וביצוע לפרוטומיה בהתאם לפרוטוקול הכתוב, יש להשתמש בפינצטה ובמספריים עדינים כדי לבודד את קרני הרחם, ולהעביר מיד את הרקמה לצחנת פטרי המכילה תמיסת PBS מקוררת.לאחר מכן, הנח את הצלחת על קרח. כדי לבודד את העוברים מקרני הרחם, השתמש בפינצטה עדינה כדי להחזיק את רקמת הרחם. באמצעות מספריים, נקב את רקמת הרחם ואת המושג (conceptus), כדי לשחרר את העוברים.בשלב הבא, הסיר את שאריות הקרומים העובריים. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ דיסקציה ובעזרת להבי מחט, חתוך את הראש ואת החלק התחתון של הגוף, מתחת לסרעפת, ואתר את הכבד כנקודת ייחוס. השתמש בלהבי מחט כדי להסיר את הצדדים הלטראליים של דופן הגוף, את עמוד השדרה ואת הלב.יש להקפיד שלא לפגוע ברקמת הקנה. כדי לבצע דיסקציה של רקמת הקנה והריאה העוברית, הפר cuidadosamente את הוושט מהקנה באמצעות להבי מחטים למשיכת הוושט. הנח את הרקמה ב-PBS על קרח לפני השימוש בפיפטות זכוכית או פיפטות העברה להעברת הרקמה למבחנות זכוכית עם מכסה הברגה של ארבעה מילימטרים.הוסיפו 4% paraformaldehyde, או PFA, ב-PBS והדגירו ל-30 דקות. לאחר מכן, שטפו את הרקמה באמצעות PBS. לאחר הסרת ה-PBS מהדגימות, הוסיפו שני מילימטרים של תמיסת צביעה X-gal והדגירו למשך שעה עד שעתיים, או למשך ארבע שעות לצורך עיבוד והטמעה נוספים.יש לעצור את התגובה על ידי שטיפת הרקמה שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם, באמצעות 3%DMSO ב-PBS. לאחר מכן, יש לאחסן את הרקמה ב-70%ethanol. לאחר עיבוד הדגימות להטמעה בפרפין באמצעות מעבד אוטומטי בהתאם לפרוטוקול הכתוב, יש להניח את הדגימות כך שהרקמה תהיה שטוחה על תחתית סירת ההטמעה.הוסיפו בזהירות פראפין עד למילוי סירת ההטמעה, והניחו מיד על הפלטה הקרה של תחנת ההטמעה עד להתגבשות הפראפין. לאחר מכן, הוציאו את הבלוק מסירת ההטמעה, ובעזרת מיקרוטום, בצעו חיתוכים בעובי של 6 µm. לאחר מכן, העבירו את החיתוכים למשקופיות.הניחו את החתכים על מחמם שקופיות בטמפרטורה של 42 °C למשך שעה אחת. ייבשו את השקופיות בתנור בטמפרטורה של 56 °C למשך הלילה. לאחר מכן, כדי להסיר את הפרפין מהדגימות, הניחו את השקופיות המיובשות במגשים והעבירו אותן לכלי צביעה מלאים ב-200 milliliters של 100% xylene, שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם.השתמשו בסדרת אתנול מדורגת למשך דקה בכל שלב כדי להחזיר את הלחות לשקופיות. לאחר מכן, השתמשו ב-Nuclear Fast Red כדי לצבוע את הדגימות בצבע ניגוד למשך 10 עד 30 שניות. שטחו את השקופיות שלוש פעמים באמצעות מי ברז, למשך חמש דקות בכל פעם.כדי לבצע דהידרציה של השקופיות, השתמש בסדרה מדורגת של אתנול לפני שטיפת הדגימות בשלושה סבבים של xylene. לאחר מכן, השתמש בחומר עיגון מבוסס xylene ובזכוכית כיסוי כדי לעגן את הדגימות. לביצוע צביעת לקטין, לאחר קיבוע רקמת ריאה קשית והכנת תמיסת חסימה (blocking buffer) בהתאם לפרוטוקול הכתוב, העבר את הדגימות ל-0.5 milliliters של תמיסת חסימה והדגס בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.השתמש בפיפטה להעברה כדי להסיר את תמינת החסימה ולהחליפה ב-250 µL של תמיסת לקטין לכל דגימה. לאחר מכן, כסה את מבחנות הזכוכית בנייר אלומיניום, והדגס בטמפרטורה של 4 °C למשך לילה. למחרת, לאחר שטיפת הדגימות ב-PBS, הנח את הרקמות המשתילות בצלחות פטרי מצופות אגרוז המכילות מספיק PBS כדי לכסות את הדגימות.לאחר מכן, השתמשו במיקרוסקופ סטריאוסקופי פלואורסצנטי כדי לצלם את הדגימות השלמות. לצורך ביצוע צביעת אימונופלואורסצנציה לדגימות שלמות, לאחר קיבוע הדגימות לפי הפרוטוקול הכתוב, השתמשו בפיפט העברה כדי להסיר את המטנול, ולאחר מכן הוסיפו תמיסת הלבנה רכזית והדגירו את הרקמה למשך שעתיים כדי להגמיש את חדירות הדגימות. באמצעות סדרה מדורגת של מטנול, מדולל ב-PBS, בצעו רהידראציה לרקמה על ידי הדגרה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בכל שלב.לאחר חסימת הרקמה בהתאם לפרוטוקול הכתוב, יש להוסיף נוגדנים ראשוניים ותמיסות חסימה, ולהדגיר את הדגימות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר שטיפת הדגימות ב-PBS, יש להוסיף נוגדנים שניוניים בדילול של 1:500 ב-PBS, ולהדגיר בחושך בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, לאחר שטיפת הדגימות שלוש פעמים למשך 20 דקות בכל פעם ב-PBS, יש להשתמש בסדרה מדורגת של מתנול ב-PBS כדי להוסיף דהידרטציה לדגימות למשך 10 דקות בכל שלב.העבירו את הדגימות לפלטות במה (stage plates) המיוצרות בהתאמה. הסירו את המטנול. לאחר מכן, השתמשו ב-200 microliters של תמיסת השקיפות של Murray (Murray's clear solution) כדי להפוך את הדגימות לשקופות.בצעו הדמיה באופן מיידי באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. לאחר הזרקת BrdU לעכברות בהריון ביום E11.5, ובידוד העוברים ביום E12.5 או E13.5 בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמשו בלהבי סכין כדי להוציא את ראשי העוברים ואת חלקי הגוף התחתונים, מתחת לחללי בית החזה. מקמו את רקמת בית החזה בבקבוקוני הברגה בנפח ארבעה מיליליטר, והוסיפו מיליליטר אחד של 4% PFA.לאחר הטמעה, חיתוך והידרציה מחדש של הדגימות בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הנח את השקופיות בצנכני Coplin ומלא אותם בבופר ציטראט 10 millimolar, pH 6. חמם את הדגימות במיקרוגל בעוצמה גבוהה למשך שש דקות וחצי, ולאחר מכן השתמש במים מזוקקים כדי להשלים את בופר הציטראט שהתאדה וחמם שוב. לאחר קירור, שטיפה וחסימה של השקופיות בהתאם לפרוטוקול הכתוב, טפטף 180 microliters של נוגדנים ראשוניים, המדוללים בתמיסת חסימה, על אטם והצמד את השקופית כאילו מניחים זכוכית כיסוי.ביום למחרת, טבול את השקופיות במים מזוקקים כדי להסיר את האטם. לאחר מכן, השתמש ב-TBS עם 0.1% Tween 20 כדי לשטוף את השקופיות שש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר דגירה של השקופיות עם נוגדנים משניים, השתמש ב-0.1 molar Tris Base לשטיפת השקופיות פעמיים למשך חמש דקות בכל פעם, לפני שטיפה כפולה עם 05 molar Tris Base.שמרו את השקופיות ב-05 molar Tris Base בזמן הוספת מדיום קיבוע, עם או בלי DAPI, והוסיפו זכוכית כיסוי. לבסוף, השתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנציה אוטומטי כדי לצלם את הדגימות, ונתחו אותן בהתאם לפרוטוקול הכתוב. באיור זה של רקמת קנה נשימה וריאה במצב whole-mount, שבודדה מעכברי Reporter ושני עכברי lacZ, זוהה צביעת lacZ במזנכימה של קנה הנשימה ובאזורים הפריפריים של ריאות בשלבי התפתחות, מה שמעיד על פעילות של Wnt beta catenin.בניסוי זה, רקמות קנה נשימה וריאה מעוברים בשלבים E12.5 עד E14.5 נצבעו באמצעות לקטין PNA. בבעלי החיים שבקבוצת הביקורת, זוהר זוהר (fluorescence) זוהה כפסים מחזוריים במזנכימה שבה נוצר הסחוס. עם זאת, היעדר צביעה בעוברים מסוג Wntless sonic hedgehog Cree מעיד על כך שאותיות Wnt נחוצות לעיבויים מזנכימליים.ברקמת קנה נשימה שלמה של עוברי E11.5, ביטוי של SOX9 מוגבל למזנכימה כפס רצוף, בעוד שבריאה המתפתחת, SOX9 נצפה בפריפריה של אפיתל הנשימה. כפי שמוצג כאן, NKX2.1 מוגבל לאפיתל של קנה הנשימה. מניעת הפרשת ליגנדים של Wnt מהאפיתל מפחיתה את ביטוי SOX9 במזנכימה, אך אינה משפיעה על ביטוי SOX9 באפיתל הפריפרי של הריאה.צביעה של alpha smooth muscle actin מזוהה ברמות נמוכות ברקמת קנה הנשימה, אך היא נצפית בבירור בגרון ובקיבה. לבסוף, כפי שמוצג בדמות זו, סימון in vivo של רקמת קנה הנשימה עם BrdU, SOX9 ו-alpha smooth muscle actin, מדגים כי תאים הצבועים ב-SOX9 עוברים פרוליפרציה ברמה גבוהה יותר מאשר תאים הצבועים ב-alpha smooth muscle actin. דפוס הפרוליפרציה הפוך ברקמת קנה נשימה של Wntless sonic hedgehog Cree.לאחר השליטה בטכניקות אלו, ניתן לבצע את רובן בתוך יומיים אם הן מבוצעות כהלכה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור את מקור הנוגדן הראשוני בעת בחירת הנוגדן המשני. דבר זה חשוב עבור כל הצביעות האימונוהיסטוכימיות, אך הוא קריטי במיוחד כאשר משתמשים ביותר מנוגדן ראשוני אחד.בעקבות הצביעה ב-X-galactosidase, ניתן לבצע טכניקות נוספות כגון היברידיזציה in situ כדי להשיג מידע נוסף, וכן כדי לענות על שאלות נוספות, כגון האם גן מסוים שנחקר יבטא במהלך סיגנלינג של Wnt. הטכניקות המוצגות כאן יהיו שימושיות עבור חוקרים המתעניינים במנגנוני תבניות שקטים המתווכים על ידי סיגנלינג של Wnt, או כוחות סיגנלינג מרכזיים אחרים הפועלים להתפתחות. לאחר צפייה בסרטון זה, תגבירו את הבנתכם לגבי הדרך לבחון את תהליך הדיפרנציאציה במהלך התפתחות דרכי הנשימה.כמו כן, להשיג הבנה טובה יותר של תפקיד שילוט ה-Wnt בתבניתיות של דרכי הנשימה המוליכות. אין לשכוח, בעת עבודה עם פאראפורמאלדהיד ובנזיל בנזואט, לנקוט באמצעי זהירות מתאימים, כגון חבישת כפפות, הכנת תמיסות תחת מapay, וסילוק תמיסות פסולת בהתאם לחוקים ולתקנות המקומיים.

studying-wnt-signaling-during-patterning-of-conducting-airways

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

כאן אנו מתארים את זרימת העבודה לשימוש במערכת TetON להשגת ביטוי גנים ספציפי לרקמה בסנפיר הזנב המתחדש של דג הזברה הבוגר.

שימוש במערכת טיטון לחקר מולקולרי מנגנוני התחדשות דג הזברה

כתב היד כאן מספקת מערכת פשוטה של שיטות לניתוח ההפרשה ודיפוזיה של ligands מתויג fluorescently ב Xenopus. זה מספק הקשר לבדיקת היכולת של חלבונים אחרים לשנות הפצת יגנד ומאפשר ניסויים שעשויות לתת תובנה מנגנוני ויסות הדרגתיים מורפוגן.

באמצעות ניתוח של Confocal<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; לחקירת מאפננים של עירובים מורפוגן Wnt וששש

ריסים ראשוניים משפיעים על מסלולי איתות שונים. שבלול היונקים אידיאלי לבחינת איתות קוטביות תאים מישוריים (PCP). תפקוד לקוי של ריסים משפיע על צמיחת השבלול, דפוס התאים וכיוון תאי השערה, קריאות של PCP. מטרתנו היא לנתח איתות PCP בשבלול עכבר באמצעות ניתוח פנוטיפי, אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

הערכת פנוטיפים מישורים-Cell-קוטביות ב Ciliopathy עכבר Mutant שבלול

במאמר זה וידאו מפרט פשוטה במתודולוגיה vivo, שניתן להשתמש בהם כדי בשיטתיות וביעילות לאפיין מרכיבי מסלולי איתות מורכבות ורשתות רגולטוריות בעוברים חסרי חוליות רבים.

כוחה של פשטות: עובר קיפוד ים כמו<em&gt; ב Vivo</em&gt; מודלים התפתחותי לימוד Cell ל-תא קומפלקס אינטראקציות רשת איתות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להמחיש פיתוח לבבות דג זברה 4-ממדים (4-D). הדמיה 4-D, באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות קרינה פלואורסצנטית (LSFM), לוקח תמונות תלת-ממדי (3-D) לאורך זמן, לשחזר לבבות המתפתח. אנו מראים איכותית, באופן כמותי שזה גזירה מפעילה חריץ endocardial איתות במהלך הפיתוח קאמרית, המקדם trabeculation הלב.

מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה כדי ללכוד תמונות 4-מימדי של השפעות להתכוונן גזירה על הלב דג זברה המתפתח

פרוטוקול לתרבות ומניפולציה של רקמת עובר עכבר על שבב microfluidic מסופק. על ידי החלת פולסים של אפננים מסלול, מערכת זו יכולה לשמש כדי לשלוט חיצונית תנודות איתות לחקירה פונקציונלית של סמיטוגנזה עכבר.

גישה מיקרופלואידיקה לחקירה פונקציונלית של איתות תנודות השולטות בסמיטוגנזה

המחקר הנוכחי מתווה שיטה הניתנת לשחזור ומתיחה גבוהה לחקר אירועי איתות Wnt פרקריניים לא-קנוניים במבחנה.  פרוטוקול זה יושם כדי להעריך את ההשפעה של איתות Wnt5a של פרקרין בתאי הצמרת העצבית של מורין ובמיובלסטים.

מידול אותות Wnt פאראקרינים לא-קנוניים במבחנה

ההתקדמות האחרונה בפרוטוקולי התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם מאפשרת נגזרת מדורגת של סוגי תאים ספציפיים לאיברים. כאן, אנו מספקים שלבים מפורטים לתחזוקה והרחבה של תאי בסיס של דרכי הנשימה שמקורם ב-iPSC והתמיינותם לאפיתל רירית בתרביות ממשק אוויר-נוזל.

יצירת תרביות ממשק אוויר-נוזל של תאי אפיתל דרכי הנשימה מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים לשלושה סוגים של תרביות צמחי עור עובריים של עופות שניתן להשתמש בהם כדי לבחון אינטראקציות בין רקמות, סרט צילום בהילוך מהיר של הדמיה 4D (3D plus time), הפרעה גלובלית או מקומית של תפקוד מולקולרי ואפיון ביולוגיה של מערכות.

שימוש בעציצים מעור העופות לחקר תבניות רקמות ואורגנוגנזה

מאמר זה מתאר מתודולוגיה in vivo ו-in vitro לאפיון אבות התיישבות תימית על ידי ניתוח הקינטיקה של הדור, הפנוטיפ והמספרים של צאצאי תאי ה-T שלהם.

אפיון של הרתי יישוב אבות בעובר העכבר באמצעות<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני

חקור את תפקיד מסלול האיתות Wnt בפיתוח דרכי הנשימה העליונות באמצעות עכברי דגימה גנטית. שיטות הצביעה מאפשרות ניתוח מפורט של דפוסי רקמת הנשימה והתמיינות תאים בפיתוח עוברי.

לימוד Wnt איתות במהלך דפוסים של איירווייס ניצוח

גלה סרטונים נוספים