הקלטה תאית של העצבית פעילות משולבת עם Microiontophoretic יישום של חומרי Neuroactive עכברי Awake
21 במאי 2016
אנו מציגים שיטות לבניית אלקטרודות לרישום בו זמנית של פעילות עצבית חוץ-תאית ולשחרור חומרים נוירואקטיביים מרובים בקרבת אתרי ההקלטה בעכברים ערים. טכניקה זו מאפשרת ניתוח מפורט של קלטים סינפטיים מקומיים משוערים לנוירון המעניין.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשפיע על השפעתם של קלטים סינפטיים על עיבוד עצבי באמצעות הזרקות מיקרו-יונטופורטיות של חומרים נוירו-אקטיביים בבעלי חיים ערים. שיטה זו יכולה לסייע בפירוק תפקודי מפתח במערכות חושיות, כגון תפקידם של מוליכים עצביים והשפעתם על גירויים חושיים וקידוד. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מניפולציה של קלטים סינפטיים מקומיים ל-tab וחקר של מערכות ויסות עצביות ללא השפעה של הרדמה.
למרות שפרוטוקול זה בוצע בעכברים מורסנים, ניתן להשתמש בו גם ביונקים אחרים כגון עטלפים, חולדות או חזירי ים. כדי להתחיל בהליך זה, מקמו את חוטי הטונגסטן בכלי יישור שנבנה במיוחד לצורך חיתוך. הצמידו בזהירות את הקצוות החופשיים של החוטים באמצעות סרט דבק וחתכו אותם לאורך הרצוי.
בשלב הבא, משכו את הסרט בעדינות כדי להסיר את חוטי הטונגסטן מכלי היישור, תוך וידוא שכל החוטים נשארים מחוברים לסרט. לאחר מכן, גלגלו את הסרט על ציר פליז מלוטש והדקו את החוטים בחוזקה אל הציר כדי להבטיח חיבור חשמלי תקין.
לאחר מכן, חברו את הציר למנוע בעל 5 RPM בתחנת העבודה. גישת הציר היא בזווית של 45 מעלות ביחס לפני השטח של תמיסת התאתש. לאחר מכן, טבלו שליש מהחוטים בתמיסה.
בשלב הבא, טבלו אלקטרודת מוט פחמן לאמבט התעייה כדי לסגור את המעגל. הפעילו את תחנת העבודה כך שציר הסיבוב יתחיל להסתובב, ולאחר מכן כווננו את הזרם העובר דרך האלקטרודות ותמיסת התעייה ל-250 מיליאמפר. הפסיקו את תעיית הקצוות כאשר הזרם יורד ל-200 מיליאמפר, וזאת כדי להגיע לקצוות חוטים מחודדים ודקים מאוד.
כעת, הכניסו תיל אל תוך קפילרית מזכוכית בורוסיליקט שקצבה התחתונה חסומה בחימר פיסול. אחזקו את הפיפטה באמצעות סליל חימום ובוכנה תלויה. קבעו את התיל המכוסה בזכוכית על גבי זכוכית כיסוי לפני הנחתו תחת המיקרוסקופ.
כוון את הראש והבא את חרוז הבורקס למצב פוקוס. לאחר מכן, חמם את החרוז עד להמסה חלקית. לאחר מכן, הכנס כ-10 עד 15 מיקרון מקצה התיל וכבה את פוטנציומטרי ההסחמה.
בעוד שהחרוז מתקרר, הסר את הזכוכית מקצה האלקטרודה כדי לחשוף את הטנגסטן. כדי לקבל קצה באורך של כ-15 מילימטרים, הגדר את הפולר (polar) לפרמטרים המתאימים. משוך את הקפילריה כדי לקבל שתי פיפטות עם קצה מבודד.
מקם פיפטת-מוט על עלית בעזרת חימר פיסול ושבור את קצהה באמצעות מספריים עדינים, פינצטה או הצד השטוח של סכין מנתחים. כוונן מעט את הזווית בין האלקטרודה לבין ה-multi-barrel כדי להשיג חיבור טוב יותר ומבנה דק יותר. תחת המיקרוסקופ, יישר בזהירות את אלקטרודת הטונגסטן מעל קצה ה-multi-barrel.
לאחר היישור, הורידו את האלקטרודה עד שהיא תיגע ברב-קנה (multi-barrel). התאימו אותה לחריץ שבין שני הקנים העליונים, ולאחר מכן החליקו את קצה האלקטרודה עד שיבלוט כ-15 עד 20 micrometers מהקצה של הרב-קנה. כעת מרחו טיפה קטנה של דבק המתקשח באור על התנגסטן ועל מכלול הרב-קנה, במרחק של כ-5 millimeters מקצותיהם.
יש למנוע מהדבק להגיע לקצוות כדי להימנע מחסימה של התעלות הרב-חביתיות, ולהקשות את הדבק באמצעות נורת LED של אור כחול. כעת, יש להניח את בעל החיים המורדם על שמיכת חימום כדי לשמור על טמפרטורה של 38 °C ולייצב את ראשו של בעל החיים במסגרת סטריאוטקסית באמצעות שני מוטות אוזניים ומוט נשיכה. לאחר מכן, יש למרוח ג'ל אופתלמי להגנה על העיניים. בשלב הבא, גלחו את קרקפת הראש ומרחו פובידון יוד לחיטוי העור. באמצעות סכין מנתחים, בצעו חתך לאורך קו האמצע כדי לחשוף את הגולגולת, והסיטו את הפריאוסטיום המכסה את העצם הפריאטלית ואת החלק הרוסטרלי יותר של עצמות העורף.
בשלב הבא, מרחו שכבה דקה של דבק המתקשה בחשיפה לאור על הגולגולת ועל בסיס מוט הראש. המתינו 10 שניות והניחו את מוט הראש מעל האזור הרוסטרלי של עצמות הפריאטליות לאורך קו האמצע. השתמשו במקור אור כחול כדי להקשות את הדבק במשך 20 שניות להשגת חוזק הידבקות יעיל.
לאחר מכן, קדחו שני חורים מסביב ומאחורי בסיס עמוד הראש באמצעות מקדח קטן. מקמו בורג שעון בכל חור שנקדח כדי שישמש כנקודת מגע נוספת בין הגולגולת לבמה עבור הראש. סובבו את הברגים פעם אחת וחצי כדי להבטיח התאמה הדוקה, ובדקו בעזרת פינצטה שהם אינם רופפים.
לאחר מכן, הכניסו את קצה חוט ההארקה מסף לחור השלישי וודאו שהוא בא במגע עם הדורה. מרחו טיפה קטנה של דבק cyanoacrylate עמיד למים כדי לקבע את החוט לגולגולת. לאחר מכן, מרחו קומפוזיט להקשיה באמצעות אור כדי לחזק את החיבור של מוט הראש לגולגולת, על ידי כיסוי בסיס מוט הראש, החלק התחתון של חוט הכסף והברגים.
הקפידו לא להתרחב מעבר ל-lambda כדי לאפשר גישה במהלך ההקלטה, והקשיחו את התרכובת באמצעות מקור אור כחול. לאחר מכן, הגדילו את השריר בחלק האחורי של הצוואר ליד נקודת ההיחשור שלו בגולגולת. באמצעות טרפין קטן, קדחו חלון עגול ממש מתחת לתפר ה-lambda ולצד קו האמצע כדי לחשוף את ה-inferior colliculus.
בפרוצדורה זו, הניחו את גוף בעל החיים בתוך מחזיק (restrainer) מותאם אישית עם ריפוד ספוג. קבעו את מוט הראש למחזיק המחובר למסגרת הסטריאוטקסית. זהו זמן מתאים למתן תגמול נוזלי לבעל החיים.
בשלב הבא, כסו את גוף בעל החיים בשמיכת כותנה והדקו אותה בצורה רפויה באמצעות חצי-גליל פלסטיק וסרט דבק. השתמשו במזרק עם קצה גמיש כדי למלא את הצינורות בתרופות הנבחרות. באמצעות המיקרו-מניפולטור, מקמו את האלקטרודה הרב-צינורית על המחזיק שלה.
בשלב הבא, הכניסו תיל כסף שאינו מצופה לתוך כל גליל, כך שקצה אחד יבוא במגע עם התמיסה והקצה השני יהיה נגיש. לאחר מכן, חברו קצוות אלה למכשיר המיקרו-יונטופורזה. לאחר מכן, חברו את ההדק החיובי לקצה אלקטרודת הטונגסטן ואת הדק ההארקה לתיל הכסף שנוגע בקשיי ה-dura.
בשלב הבא, העבירו את האלקטרודה רב-החמיות עד שהקצה יבוא במגע עם פני השטח של המוח. מרחו סליין סטרילי חמים כדי למנוע התייבשות של רקמת המוח. בנקודה זו, החילו זרם שימור כדי למנוע דליפת תרופה מקצה החמיה בזמן החיפוש אחר פעילות של יחידה בודדת.
הקליטו פעילות עצבית והגשה יוניטופורטית של גבזין (gabazine). מוצגת כאן שטח תגובת התדר של ארבעה נוירונים שהוקלטו בקוליקולוס התחתון (inferior colliculus) לפני ובמהלך הזרקה מיקרו-יוניטופורטית של גבזין. האיקסים השחורים מציינים את התדרים שנבחרו להיות מוצגים כצלילים נדירים וחזרתיים.
כאן מוצגות היסטוגרמות זמן פרי-סטימולוס מצטברות של התגובה העצבית לכל התדרים והעצמות שהוצגו כדי לבנות את תחום התגובה לפני ובמהלך ההזרקה של gabazine. הפסים השחורים מציינים את משך הצליל. כאן מוצגות רסטר-נקודות (dot rasters) של תגובת הפריקה לזוג תדרים שהוצגו כגירוי נדיר באדום וכגירוי חזרתי בכחול, לפני ובמהלך היישום של gabazine.
הרקע המוצל מציין את משך הגירוי. רשומות נקודות אלו מראות את התגובות כאשר ההסתברויות היחסיות של תדרי הפארה (parafrequencies) הוחלפו. גרף זה מציג את תגובות נוירון בודד לשבעה זוגות של תדרים שהוצגו כצליל נדיר וכצליל חוזר לפני ובמהלך יישום של גבזין (gabazine).
גרף זה מציג את מדדי ה-SSA של התגובה העצבית לצלילים נדירים וחזרתיים שנמדדו לפני ובמהלך יישום של gabazine. לאחר רכישת מיומנות, הפרוצדורה המתוארת מאפשרת התאמה של הפרמטרים הספציפיים בהתאם למבנה העצבי ולסוג הנוירון הנבדק. בעת ניסיונות להקליט בעלי חיים תחת קיבוע ראש, קריטי לזכור כי זמני ההקלטה נקבעים ומוגבלים על ידי רמת ההביאה של בעל החיים, אך יתרון חשוב הוא שניתן לבצע מספר הקלטות באותו בעל חיים לאורך מספר ימים, ובכך לצמצם את מספר בעלי החיים שבשימוש.
על ידי ביצוע מיקרו-יונטופורזה באמצעות אלקטרודות מסוג piggy back, ניתן לשלב פרוצדורות נוספות, כגון הזרקת טרנזיסטורים עצביים, כדי לענות על שאלות נוספות כמו מקור הקלטים ויעד ההקרנה של נוירונים בתוך אתר ההקלטה. נושא קריטי בעבודה עם בעלי חיים ערים הוא רווחתם, לכן לעולם אל תחריגו את זמן ההשבה המאושר בפרוטוקול שלכם, ונא נטרו באופן רציף כדי לבדוק כל סימן לאי-נוחות. אם יופיעו סימנים כאלה, עליכם להפסיק את ההקלטה באופן מיידי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה למניפולציה של קלטים סינפטיים בעכברים ערים באמצעות הזרקות מיקרו-יונטופורטיות של חומרים נוירו-אקטיביים. טכניקה זו מאפשרת ניתוח מפורט של קלטים סינפטיים מקומיים והשפעותיהם על עיבוד נוירונלי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצבים
- אלקטרופיזיולוגיה
- נוירופרמקולוגיה
רקע
- הבנת קלטים סינפטיים היא קריטית להבנת העיבוד העצבי.
- מיקרו-יוניטופורזה מאפשרת הולכה מקומית של חומרים נוירו-אקטיביים.
- ביצוע ניסויים בבעלי חיים ערים מונע את ההשפעות המבלבלות של הרדמה.
- שיטה זו ניתנת ליישום במגוון מיני יונקים.
מטרת המחקר
- לחקירת תפקידם של מוליכים עצביים בעיבוד חושי.
- לניתוח האינטראקציה של חומרים נוירו-אקטיביים על גירויים חושיים.
- להעמקת ההבנה של מערכות מודולטוריות נוירונליות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בניית אלקטרודות להקלטה בו-זמנית ושחרור חומרים.
- הזרקות מיקרו-יונטופורטיות בעכברים ערים.
- שימוש בחוטי טונגסטן לייצור אלקטרודות.
- כלי יישור בהתאמה אישית לחיתוך מדויק של אלקטרודות.
תוצאות עיקריות
- הושגה מניפולציה מוצלחת של קלטים סינפטיים מקומיים.
- ניתוח מפורט של תפקידי מוליכים עצביים בעיבוד חושי.
- הוכחת היתכנות במודלים ממליאים שונים.
- ספק תובנות לגבי מודולציה נוירונלית ללא הרדמה.
מסקנות
- שיטה זו מציעה כלי רב עוצמה לחקר דינמיקה סינפטית.
- היא משפרת את הבנתנו לגבי אינטראקציות בין מוליכים עצביים.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב למינים ולהקשרים אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
שיטה זו מאפשרת מניפולציה מדויקת של קלטים סינפטיים מקומיים בבעלי חיים ערים, ובכך מספקת יתרון מכריע על פני גישות מערכתיות או כאלה המושפעות מהרדמה לצורך הפחתת סיכונים בתיקוף מטרות (target validation) בתהליך גילוי תרופות למדעי העצבים. על ידי בידוד תפקודי הקולטנים למוליכים עצביים in vivo, היא תומכת בהבנה מכניסטית של מסלולי עיבוד תחושתי ומגבירה את הביטחון החזוי בהיפותזות לגבי מטרות בשלבים מוקדמים. הטכניקה רלוונטית במיוחד למטרות במערכת השמיעה והמערכות התחושתיות, שבהן גורמים מבלבלים הנובעים מהרדמה עלולים להסתיר תגובות נוירופיזיולוגיות אמיתיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי בידוד התרומה של קולטנים ספציפיים למוליכים עצביים (למשל, GABAA) לעיבוד נוירונלי בבעלי חיים ערים ומתנהגים.
- ערך תפעולי: מספק תיקוף פונקציונלי של המטרה בדיוק מרחבי, ובכך מפחית עמימות מכניסטית במחקרי מודולציה סינפטית.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח באמצעות אספקת תוצאות כמותיות וספציפיות לקולטן, המשקפות דינמיקה של מעגלים טבעיים ללא השפעות של חומרי הרדמה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מייצר מערכות ביולוגיות מתוּקפות (גבעולי העורג המ IFC בעכבר ער) עם יכולת הקלטה יציבה של יחידה בודדת לצורך סריקת תרכובות בהמשך התהליך.
- פלט כמותי: מספק נקודות קצה נוירופיזיולוגיות מדידות, כולל הסטות של אזור התגובה לתדר ומדדי הסתגלות ספציפיים לגירוי.
- שחזוריות: מאפשר מספר מפגשי הקלטה לכל חיה, ובכך תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה ובהערכה אורכית של המעורבות עם המטרה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: ניתן ליישום ישיר בהפרעות עיבוד שמיעתי ובליקויי סינון חושי (sensory gating) שבהם מעורבת מודולציה GABAergic.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני על ידי שימור המצב העצבי המולד וההקשר המעגלי.
- קידום מותאם סיכון: מקל על קבלת החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) על בסיס מעורבות המטרה בתנאים פיזיולוגיים רלוונטיים במצב ערות.
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזת המטרה ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ובמיוחד עבור מטרות של נוירומודולטורים ומוליכים עצביים הדורשות תיקוף במעגלים שלמים ועירים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי אפשור מניפולציה סיבתית של קלטים סינפטיים להפרדת תרומות ספציפיות לקולטנים בקידוד חושי.
- סריקה: מספקת תכשירים מוכנים לבדיקה עם תוצאות אלקטרופיזיולוגיות כמותיות המתאימות לאפיון השפעת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת נתונים ספאטיו-טמפורליים ברזולוציה גבוהה (היסטוגרמות זמן פרי-סטימולוס, רסטרים של נקודות, מדדי SSA) לצורך ניתוח תנאים השוואתי.
- מחקר תרגומי: שומרת על רציפות משלב הגילוי ועד לעבודה פרה-קלינית על ידי מניעת שיבוש של עיבוד עצבי טבעי על ידי חומרי הרדמה.
- שימוש חוזר ארגוני: תכנון האלקטרודות ניתן להתאמה למבנים עצביים ולסוגי נוירונים שונים, מה שמאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה במערכות חושיות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי חשיפת תפקידיהם של מוליכים עצביים טבעיים בעיבוד חושי ללא משתנים מתערבים של חומרי הרדמה.
- ערך תפעולי: מאפשר הולכה מיקרו-יונטופורטית סטנדרטית ו可שחזרת וביצועה של אלקטרופיזיולוגיה סימולטנית בהכנות של בעלי חיים ערים.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות של go/no-go על ידי הפחתת סיכון ביולוגי בשלב מאוחר הנובע מהנחות שגויות לגבי מנגנון המטרה.
- השפעה על תיק המטרות: תומך בתיעדוף של מטרות מותאם סיכון, המבוסס על תוצאות תפקודיות מאוששות וספציפיות למנגנון.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות באלקטרופיזיולוגיה, ייצור מיקרו-אלקטרודות ועבודה עם בעלי חיים ערים.
- תלוי במכשור מדויק, כולל מיקרו-מניפולטורים, תחנות תעשייה (etching) ומכשירי מיקרו-יונטופורזה.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית לבניית אלקטרודות, הליכים כירורגיים ותהליכי ניתוח נתונים.
- התאמה בין מערכות מודלים שונות דורשת התאמה של גיאומטריית האלקטרודה ואתרי השתלה בהתאם למבנה העצבי המטרה.
- מגבלה מעשית: משך ההקלטה מוגבל על ידי הרגלת בעל החיים (~3 שעות למפגש), אם כי מספר מפגשים לבעל חיים אחד הם אפשריים.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פרמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:54
Tungsten Electrodes
3:03
Multibarrel Glass Pipette Manufacturing
4:26
Surgery and Headpost Implantation
6:49
Electrophysiological Recording and Microiontophoresis
8:26
Results: Effect of the Blockade of the GABAA-receptors on the Spectral and Temporal Response Properties as well as the Repetitive and Rare Sounds
9:58
Conclusion
