שיטה לכוון ולבודד Airway-innervating עצב סנסורי של עכברים

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לסמן ולבודד את הנוירונים של ganglion nodose בעצב הוואגוס המעצבבים את דרכי הנשימה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה הפריפריאלית, כגון: אילו תכונות מזהות קיימות לנוירונים המעצבבים את דרכי הנשימה?

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת שיטה חסונה ובעלת תפוקה גבוהה לסימון ובידוד של אוכלוסיות עצביות ספציפיות. לאחר קצירת הגנגליונים התחושתיים, שאבו 500 µL של תמיסת הפירוק של הגנגליונים מכל מבחנה, מבלי להסיק את הגנגליונים. לאחר מכן, הוסיפו 1 mL של PBS לכל דגימה, והמתינו עד שהגנגליונים ישקעו לתחתית המבחנות.

לאחר מכן, הסירו את ה-PBS והוסיפו לנוירונים מיליליטר אחד של תמיסת דיסוציאציה של גנגליונים (ganglia dissociation solution) מועשרית באנזים עיכול, ולאחר מכן הוסיפו 20 µL של Fast Blue למבחנת בקרת החיוביות. דגרו את המבחנות בטמפרטורה של 37 °C למשך הזמן המתאים, בהתאם לגיל האנזים המעכל. נערנער ונקפיץ את המבחנות קלות מדי 15 דקות, כדי להבטיח שהגנגליונים מכוסים בתמיסת העיכול.

בזמן שכיבון של תאי העצב, הוסיפו באיטיות ובזהירות 400 µl של תמיסת דחיסות 12% שהוכנה טרייה מעל 400 µl של תמיסת דחיסות 28% בתוך מבחנה אחת בנפח 1.5 ml לכל דגימה. שני שכבות מובחנות צריכות להיות גלויות, אחת כהה יותר מהשנייה. לאחר מכן, סמנו מבחנות איסוף בנפח 1.5 ml עבור המיון, כולל מבחנה אחת חיובית ל-Fast Blue ומבחנה אחת שלילית ל-Fast Blue לכל דגימת מיון.

בסיום תקופת העיכול, השליכו את אנזים העיכול ושטפו את הגנגליונה פעמיים עם 1 ml של PBS כפי שהודגם כעת. לאחר השטיפה השנייה, הוסיפו 200 µL של תמיסת דיסוציאציה של גנגליונה טרייה לכל מבחנה. לאחר מכן, בעזרת פיפט של 200 µL המכוון לנפח של 100 µL, בצעו פיפטינג של הגנגליונה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להפריד את התאים לסספנסיה של תאים בודדים, תוך הקפדה להימנע מהיווצרות בועות.

כאשר לא נראים שקיעי רקמה שלמים, החזיקו בחוזקה ביד אחת מסנן תאים של 70 מיקרון, והעבירו באמצעות פיפט את תמיסת התאים המופרדים למרכז המסנן. לאחר מכן, שטפו את מבחנת ההפרדה עם 100 microliters של תמיסת הפרדת גנגליונים טרייה כדי לאסוף תאים נוספים. סננו את תמיסת השטיפה דרך המסנן והשתמשו בקצה פיפט חדש כדי לשאוב כל שארית של תמיסה המכילה תאים מהצד התחתון של המסנן, והוסיפו אותה לסuspended תאיים.

כעת, העבירו בזהירות את כל 300 microliters של התאים כשכבה מעל מדרג הצפיפות שהוכן קודם לכן. ואספו את תאי הגנגליים באמצעות סנטריפוגה. בזמן שהתאים מסתובבים, הוסיפו 300 microliters של תמיסת ליזיס (lysis buffer) שהוכנה טרי למבחנה לאיסוף התאים החיוביים ל-Fast Blue, ו-600 microliters של תמיסת ליזיס למבחנה לאיסוף התאים השליליים, כדי להבטיח שנוזל המעטפת של המיון לא ידלל באופן משמעותי את תמיסת הליזיס.

בסיום הסנטריפוגציה, הסיר בזהירות את 700 המיקרוליטרים העליונים של התמיסה המכילה את מרבית שיירי התאים. לאחר מכן, ערבב 700 מיקרוליטרים של תמיסת דיסוציאציה של גנגליונים טרייה עם התאים שנותרו. שקיע את התאים באמצעות סנטריפוגציה והסר בזהירות את הנוזל העליון (supernatant).

לאחר מכן, השעה מחדש את התאים ב-200 עד 300 µL של תמיסת פירוק גנגליונים למיון באמצעות פיפט של 1,000 µL המכוון ל-200 µL. הנח את התאים על קרח עד שיהיו מוכנים למיון. לאחר טיהור תאי הגנגליונים באמצעות FACS, הומוגנז את הנוירונים בבופר ליזיס למשך דקה אחת תוך כדי ערבוב במערבל (vortexing).

בשלב הבא, ערבבו את התאים מספר פעמים עם נפח אחד של 70% ethanol והעבירו עד 700 microliters מהמדגם לעמודת ספין (spin column). סבבו את העמודה בצנטריפוגה למיקרו (microcentrifuge) למשך 15 שניות ב-8,000 x g והשליכו את הנוזל שעבר (flow through). לאחר שכל המדגם עבר דרך עמודת הספין, חלצו את ה-RNA לפי פרוטוקולים סטנדרטיים לטיהור RNA.

לאחר מכן, השתמש במערכת electrophoresis מיקרופלואידית כדי לבחון את איכות ה-RNA בהתאם להנחיות היצרן. בגרפים אלו מוצגים הביקורות השליליות והחיוביות של Fast Blue ששימשו לקביעת שערי המיון. ניתן כעת למיין את תאי ה-Nodose שפו一款ו וסומנו ב-Fast Blue לאוכלוסיות חיוביות ושליליות ל-Fast Blue.

יעילות המיון בשיטה זו היא 73 עד 85%, כאשר בממוצע נאספים כ-1,500 תאים או פחות חיוביים ל-Fast Blue וכ-60,000 תאים שליליים ל-Fast Blue. כפי שנראה במדגם מייצג זה, ניתן להשתמש בפיקי ה-18S וה-28S שהתקבלו באמצעות אלקטרופורזה מיקרופלואידית כדי לחשב את מספר שלמות ה-RNA (RNA integrity number) לצורך קביעת איכות ה-RNA שהופק. לאחר רכישת מיומנות בטכניקה זו, ניתן להשלימה בתוך ארבע שעות וחצי, במידה שהיא מבוצעת כראוי.

במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להתקדם בשלבים במהירות ולהשתמש בתמיסות שהוכנו טרי עבור הפקת RNA. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון תרביות של נוירונים, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון אילו תכונות פונקציונליות ייחודיות לנוירונים המעצבבים את דרכי הנשימה? לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הנוירוביולוגיה הפריפריאלית לחקור את התכונות הייחודיות של אוכלוסייה ספציפית של נוירונים המעצבבים את דרכי הנשימה בגנגליונים הנודוזים (nodose ganglia) של עצב הוואגוס.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן התיוג וההפרדה של נוירונים ספציפיים בגנגליות הנודוזוס (nodose ganglia), שניתן להשתמש בהם לאחר מכן לריצוף RNA, או לזריעה לצורך מחקרים פונקציונליים. זכרו כי עבודה עם 2-Mercaptoethanol עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון חבישת כפפות ועבודה תחת מ 빠르게 כימי, בעת שימוש בתרכובת זו.