דיפרנציאציה של פרפור cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים שימוש Grem2 אנטגוניסט BMP

המטרה הכוללת של פרוטוקול התמיינות זה היא ליצור אוכלוסיות הומוגניות של קרדיומיוציטים פרוזדורים בתרבית. כך ששיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר התפתחות הלב ומחלות לב כגון הפרעות קצב פרוזדורים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם בכך שהיא מייצרת תרביות הומוגניות של קרדיומיוציטים פרוזדורים במבחנה וכי ניתן לעשות זאת באימון מינימלי.

עד ארבעה ימים לפני הקמת תאי הגזע העובריים של העכבר, או תרביות mESC, מקודדים צלחות רקמה בגודל 10 סנטימטר עם 5 מיליליטר של תמיסת ג'לטין של 0.2% כל אחת, בשש צלחות באר עם 1 מיליליטר ג'לטין לבאר במכסה מנוע מעוקר של תרבית רקמה. ביום התרבות, הסר את תמיסת הג'לטין הנוספת, והוסף 10 מיליליטר בינוני לאחת המנות המצופות ג'לטין בגודל 10 סנטימטרים. לאחר מכן, השתמש בקריוטונג כדי לסובב בעדינות בקבוקון של 1 כפול 10 עד 6 mESC באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד שנשאר רק גביש קרח קטן במרכז הבקבוקון.

יבש את הבקבוקון עם מגבון חד פעמי נטול מוך ועקר אותו עם 70% אתנול. לאחר מכן הניחו את הבקבוקון במכסה המנוע של תרבית הרקמה והשתמשו בפיפטה P1000 כדי להוסיף את ה-ESC למנה. הנח את התאים באינקובטור תרבית תאים לח של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני, והזיז בעדינות את הצלחת מלפנים לאחור ומצד לצד כדי לפזר את התאים באופן שווה.

בסוף הדגירה, השתמש במיקרוסקופ שדה בהיר כדי לאשר את חיבור התא. ייצפו כמה פסולת ותאים מתים. החלף את המדיום ב -10 מיליליטר של מדיום mESC טרי, והחזיר את התאים לחממה.

כאשר התרבית היא 60 עד 70% מתכנסת, יש לשטוף את הצלחת עם 5 מיליליטר DPBS סטרילי ללא מגנזיום וסידן, ולדגור את התאים ב -2 מיליליטר טריפסין EDTA ב -37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. בזמן הדגירה, שאפו את תמיסת הג'לטין העודפת ממנה חדשה אחת של 10 סנטימטר לכל תרבית מעבר, והוסיפו 10 מיליליטר מדיום לכל צלחת. לאחר מכן אוספים את התאים המנותקים על ידי צנטריפוגה בצינור של 15 מיליליטר, ומשעים מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר של מדיום mESC.

בהתאם ליחס הפיצול הרצוי, הוסף 0.5 עד 1 מיליליטר של תרחיף תאים לכל צלחת של 10 סנטימטר והחזיר את התאים לחממה, תוך חלוקה עדינה של התאים בכל מנה כפי שהודגם זה עתה. כאשר התאים המועברים הם 70% מתלכדים, נתק אותם עם טריפסין EDTA כפי שהודגם זה עתה, ולאחר מכן השהה מחדש את התרחיף של תא בודד ב-5 מיליליטר של גוף עוברי או מדיום EB. ספרו את ה-mESC ולאחר מכן דללו אותם בנפח המתאים של מדיום EB לריכוז סופי של 2.5 כפול 10 לתאים השלישיים למיליליטר.

לאחר מכן, הוסף 2 מיליליטר PBS לתחתית צלחת פטרי חיידקית סטרילית אחת בגודל 10 סנטימטר לכל תרבית טיפה תלויה, והעביר את תרחיף ה-EB לאגן תמיסה סטרילי. כעת, הסר את המכסה מאחד הכלים המוכנים והשתמש בפיפטה רב ערוצית, המצוידת בשישה טיפות, כדי להפקיד בזהירות 60 טיפות של 20 מיקרוליטר של מתלה EB על המשטח הפנימי. הניחו בעדינות את המכסה בחזרה על הצלחת, הקפידו לא לעקור את הטיפות התלויות ולהניח את הכלים בחממת תרבית התאים למשך יומיים.

כדי לשטוף את ה-EB, הסר בזהירות את המכסה מתרבית הטיפות התלויה והטה אותו בזווית של 45 מעלות. לאחר מכן, בעזרת פיפטה סרולוגית של 5 מיליליטר המכילה מדיום EB בטמפרטורת החדר, שטפו בעדינות את ה-EB לבריכה בתחתית המכסה. בדוק בזהירות את המכסה לאיתור EB's דבוקים למשטח, ולאחר מכן העביר את ה-EB לצלחת פטרי לא מצופה בגודל 6 סנטימטרים.

החזירו את ה-EB לאינקובטור תרבית הרקמה למשך יומיים נוספים, ובדקו את הצלחות מדי יום עבור צבירת EB והצמדה. לפני ציפוי ה-EB, החלף את תמיסת ציפוי הג'לטין העודפת בכל באר של צלחת שש הבארות המוכנה, ב-2 מיליליטר של מדיום טיפול Grem2 טרי בטמפרטורת החדר. לאחר מכן השתמש בפיפטה P1000 המוגדרת ל-100 מיקרוליטר כדי להעביר 30 EB לכל באר, ולאחר מכן החזר את הצלחת לחממה למשך הלילה, תוך פיזור אחיד של התאים בתנועה עדינה כפי שהודגם.

לאחר שה-EB נצמד לתחתית הבארות, החלף את מדיום ה-Grem2 כל יומיים עד ליום ה-10. לאחר מכן, האכילו את התאים במדיום EB טרי כל יומיים כדי לשמור על תרבית תאים בריאה. לפני תרבית הטיפה התלויה שלהם, תאי הגזע הפלוריפוטנטיים צריכים להיות קומפקטיים וללא התמיינות ספונטנית.

אם נצפתה התמיינות ספונטנית, אין להשתמש בתאים בתרביות הטיפות התלויות. EB איכותי נוצר בדרך כלל בצורה הטובה ביותר בתוך טיפות תלויות במרווחים שווים ומעוגלים היטב. ביום השני של ההתמיינות, ה-EB אמור להיות גלוי לעין בלתי, כסידורים כדוריים של תאי גזע מתמיינים בקצות הטיפות התלויות.

ביום הרביעי, EB מעוצב היטב צריך להיות צף חופשי והומוגני בגודלו ובצורתו. לאחר הציפוי, ה-EB ישתטח כאשר התאים נודדים החוצה מה-EB אל פני השטח של לוחית תרבית הרקמה, כפי שנצפה כאן בימי ההתמיינות 8 ו-10. בבארות בקרה שאינן מטופלות, כתמים קטנים ומתכווצים לאט נצפים כבר ביום השישי ומאוחר יותר ביום התשיעי.

בעוד שבבארות שטופלו ב-Grem2, כתמים גדולים עם קצב התכווצות מהיר יחסית נפוצים. ניתוח RT-QPCR של ביטוי גנים בתאים הממוינים חושף בדרך כלל רמות גבוהות של גנים מבניים ורגולטוריים לבביים בתרביות שטופלו ב-Grem2. אם נעשה שימוש בקו תאי הגרעין אלפא-MHC DsRed, התפוקה המוגברת של קרדיומיוציטים נצפית כמספר גבוה יותר של גרעינים המסומנים ב-DsRed בבארות שטופלו ב-Grem2.

הטיפול ב-Grem2 גם מטה את ההתמיינות לכיוון פנוטיפ דמוי פרוזדורים, כפי שאושר על ידי מדידות RT-QPCR ו-Patch Clamp של משך פוטנציאל הפעולה התאית. לאחר השליטה, ניתן לטפל בתאי הגזע הממיינים עם Grem2 תוך 60 דקות בלבד ותאי חרוזים נצפים בדרך כלל כבר ביום השביעי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להוסיף באופן עקבי את Grem2 ביום הרביעי לאחר ביטוי השיא של סמני קיבה כגון ברכיורי.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אלקטרופיזיולוגיה ו-QPCR כדי להבין את המאפיינים התפקודיים והמולקולריים של התאים שנוצרו. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לייצר קרדיומיוציטים פרוזדוריים מ-ESC של עכברים, באמצעות Grem2.