Name: באמצעות טכניקה למינציה לבצע Confocal מיקרוסקופית של האדם בלובן העין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: למדו מיקרוסקופיית קונפוקל של רקמת סקלרה אנושית באמצעות טכניקת למינציה. שיטה זו מאפשרת חקר התפלגות תאי חיסון ומצב כלי דם ברקמה צפופה, ומסייעת למחקר בעיניים בריאות ופתולוגיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

קרן המחקר הגרמנית (FOR2240 "(לימפה) אנגיוגנזה וחסינות תאית במחלות דלקתיות של העין" ל-CC ו-LMH; HE 6743/2-1 ו-HE 7643/3-1 ל-LMH; CU47/6-1 ל-CC), הסיוע הגרמני לסרטן (ל-LMH ו-CC), תוכנית GEROK אוניברסיטת קלן (ל-SLS ו-LMH), והאיחוד האירופי COST BM1302 "שילוב כוחות להתחדשות הקרנית" (ל-CC).

השימוש ברקמות אדם צריך להיות נבדקת ואושר על ידי עושה ועדות מוסדיות או שווה הערך. העבודה המתוארת כאן אושרה על ידי ועדת האתיקה המקומית והיה אישור לבדיקה מדעית. עבודה זו בוצעה על פי הצהרת הלסינקי. דגימות scleral אדם התקבלו מעיני תורמים הגלובוס (HR המקסימלי שלאחר המוות זמן 24) על עיניים בנק מחלקת עיניים, אוניברסיטת קלן, גרמניה. 1. הכנה ניסויית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 96% אתנול וזרחתי בופר (PBS) צינורות שונים. הכן את נוגדנים ראשוניים עם הדילול המומלץ של PBS המכיל אלבומין 2% שור (BSA) ולשמור את כל פתרונות על קרח. כן 100 μl לדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לנקות את כל המכשירים ולהשתמש אזמלים חדים. אחרי חזר חיתוך עם אותה הסכין, לשנות את האזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג 1-2 מלקחיים COLIBRI, מספריים לנתח מיקרו ישר, אזמל # 10או נוצה מיקרו אזמל עיניים, וארבעה 26 מחטים G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוטפים בנייר אלומיניום סביב צלחת קלקר או להשתמש צלחת הפקק כדי להדביק את הרקמה. לעבוד מתחת למיקרוסקופ סטריאו משקף. עבודה סטרילית מתחת זרימת אוויר למינרית במידת הצורך. </li></ol> 2. מכינים את בלובן העין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמד בעדינות את הנורה ולבצע ניקור ניקוב מצד corneoscleral, ולאחר מכן סובב את לִקְדוֹחַ. סובב את לִקְדוֹחַ בזהירות ובאופן שווה על פני השטח כדי לבצע חתך עגול באותה מידה. השתמש לִקְדוֹחַ 15.5 מ&quot;מ בגודל. חותך את המצורפים הנותרים עם מספריים מעוקלים. הסר את הניקור corneoscleral. זה יגרום נורה anteriorly נפתחה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את בלובן העין על מקלון עם החלק הפתוח כלפי מעלה. הסר את הרשתית עִנבִּיָה, באמצעות מלקחיים COLIBRI למשוך את שתי שכבות (הרשתית עִנבִּיָה) מן בלובן העין. אל תשאירו את עִנבִּיָה פיגמנט על בלובן העין הפנימית. השתמש במספריים מעוגלים כדי להסיר את הרשתית עִנבִּיָה מן הגבשושיות. הסר את remלחמית aining, שרירי extraocular, ו של הקפסולה שֶׁגֶם מן בלובן העין שטחית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדגם scleral בגודל הנדרש באמצעות מספריים ישרים מסוג ואת מלקחי COLIBRI. קח על 2 ס&quot;מ 2 דגימות scleral בגודל ממקומות שונים. בגלל גודלו הקטן, החזק את בלובן העין בעדינות לגזור לגודל המתאים כריבועים באמצעות מספריים ישר-סוג. ניקור corneoscleral מגדיר את השולים הקדמיים של דגימות scleral. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע חזר תופס עם מלקחי כאזור שבו רקמת התפס אינה מתאימה מיקרוסקופיה confocal מנתח. הכן את המספר הנדרש של דגימות בהתאם לסוג הניסוי (למשל קדמי לעומת בדיעבד, להשוות איור 1) ואת כמות הנוגדנים בשימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים דגימות 1.5 מ&quot;ל צינורות לשימוש מאוחר יותר. תקן דגימות 1.5 מ&quot;ל 96% אתנול במשך 15 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם שלוש פעמים בכל 5 דקותב 1.5 מ&quot;ל PBS על שייקר. אם עובד עם רקמה קפוא, לבצע שלב זה לפני ההקפאה תוך שניות ספורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש רקמה טריה. עם זאת, אם הדבר אינו אפשרי, צמד להקפיא את בלובן העין בחנקן נוזלי ולשמור אותו ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר. אם עובד עם רקמה קפוא, להפשיר לפני השימוש. הימנע פשרת מעגלים חוזרים ונשנים של הקפאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור מדגם ב PBS המכיל BSA 1.5 מ&quot;ל 5% בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות. צעד זה גורם לנפיחות של המדגם כי הוא מועיל עבור למינציה וגם מונע מחייב נוקב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגימות תפחו, להכין את ריבועי scleral ללמינציה. לעבוד מתחת למיקרוסקופ, למשל מיקרוסקופ סטריאו משקף. הצמד את דגימות scleral האחוריות הממברנה הקלקר עטוף בנייר אלומיניום או צלחת הפקק באמצעות 26 מחטי G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כופפו את הקצוות של מחטים כך שהם לא להפריע את שדה הראייה מתחת למיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למינציה samp scleral בעובי מלאles. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, החזק את קצה scleral הקדמי באמצעות מלקחיים COLIBRI. ואז לחתוך בזהירות שכבה דקה של בלובן העין שטחית באמצעות אזמל # 10, הנוצה מיקרו עיניים אזמל, או להב מרית. החזק את האזמל אופקי ולחתוך את השכבה השטחית בצורה רחבה ככל האפשר מן השכבה שמתחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח שכבת scleral דקה מכיכר scleral. שיטה זו ניתן להשוות טכניקות ניתוח סטנדרטיות להכין דש במהלך trabeculectomy וצריך לגרום שכבות עבות 30-80 מיקרומטר (השווה איור 2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למנוע התייבשות של בלובן העין על ידי הוספת כמויות קטנות של PBS לרקמה, PBS μl למשל 50 בעזרת פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את השכבות לחתוך לתוך 100 μl של PBS ב 96 את הצלחת היטב ולתייג פי הנטייה (לכיוון חצוני ומתמחה) ואת השכבה (שטחי ועמוק) למשל עם צבע עמיד למים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 2.7-2.9 עד רקמת למינציה מלאה. &lt;/ Li&gt; </ol> .3 בצע אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של הנוגדנים העיקריים הנדרשים לתוך הדילול המומלץ. הנה, למשל, השימוש CD 31 (אדם אנטי עכבר חד שבטי) נוגדני LYVE1 (אדם ארנב נגד), הוא דילול של 1: 100 ב PBS (המכיל 2% BSA) ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. כדי לשנות את המדיום בצלחת 96 באר, להחזיק פיפטה אל הקיר של הבאר ולהסיר את הנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשטוף את דגימות שלוש פעמים בכל 5 דקות עם 200-300 PBS μl על שייקר. הוספת 100 μl של נוגדנים משני המתאימים; כאן להשתמש isothiocyanate והעמסת העכבר עז נגד (FITC) וצבעים cyanine ארנב עז נגד 3 (Cy3), דגירה דגימות בטמפרטורת החדר למשך 1-2 שעות. לדלל את הנוגדנים משני 1: 300 ב PBS המכיל סרום עיזים 2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את דגימות שוב שלוש פעמים בכל 5 דקות ב 200-300 μl PBS על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מכתים הגרעין, למשל </em&gt;. 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (דילול 1: 2,000, 100 μl היטב כל דגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר), ולאחר מכן לשטוף שוב 2 פעמים ב 200-300 PBS μl על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות על גבי שקופיות מיקרוסקופ, להטביע אותם 1-2 טיפות של המדיום גובר פלורסנט, להוסיף coverslip, לאטום אותו על ידי כיסוי קצוות עם לכה שקופה, ולאחסן ב 4 ° C לשימוש מאוחר יותר או ישירות לבחון את השקופיות עם confocal מִיקרוֹסקוֹפּ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במיקרוסקופ confocal (או שווה ערך) כדי לנתח את הדגימות. השתמש ההגדלה הרצויה, הגדלה למשל 10-40X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאמת את העובי של הדגימות, למדוד עם מיקרוסקופ confocal באמצעות Z- ערימות. כמות חלקי scleral אפשרי תלויה במיקום של בלובן העין, כמו העובי שונה equatorially ו בדיעבד (השווה מבוא). </li></ol>

<ol><li>Schlereth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+lymphatic+vessel+endothelial+hyaluronan+receptor+1+%28LYVE1%29-positive+macrophages+around+blood+vessels+in+the+normal+human+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Enrichment of lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1)-positive macrophages around blood vessels in the normal human sclera.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2), 865-872 (2014).</li>
<li>Schlereth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+lymphatic+vessels+in+the+developing+human+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Absence of lymphatic vessels in the developing human sclera.</a> Exp Eye Res. 125, 203-209 (2014).</li>
<li>Hos, D., Cursiefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+vessels+in+the+development+of+tissue+and+organ+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Anat+Embryol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lymphatic vessels in the development of tissue and organ rejection.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 119-141 (2014).</li>
<li>Hos, D., Schlereth, S. L., Bock, F., Heindl, L. M., Cursiefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antilymphangiogenic+therapy+to+promote+transplant+survival+and+to+reduce+cancer+metastasis%3A+what+can+we+learn+from+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Antilymphangiogenic therapy to promote transplant survival and to reduce cancer metastasis: what can we learn from the eye.</a> Semin Cell Dev Biol. , (2014).</li>
<li>Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+privilege+as+the+result+of+local+tissue+barriers+and+immunosuppressive+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune privilege as the result of local tissue barriers and immunosuppressive microenvironments.</a> Curr Opin Immunol. 5 (3), 428-432 (1993).</li>
<li>Streilein, J. W., Niederkorn, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+anterior+chamber-associated+immune+deviation+requires+an+intact%2C+functional+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Induction of anterior chamber-associated immune deviation requires an intact, functional spleen.</a> J Exp Med. 153 (5), 1058-1067 (1981).</li>
<li>Streilein, J. W., Yamada, J., Dana, M. R., Ksander, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+chamber-associated+immune+deviation%2C+ocular+immune+privilege%2C+and+orthotopic+corneal+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Anterior chamber-associated immune deviation, ocular immune privilege, and orthotopic corneal allografts.</a> Transplant Proc. 31 (3), 1472-1475 (1999).</li>
<li>Keeley, F. W., Morin, J. D., Vesely, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+collagen+from+normal+human+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of collagen from normal human sclera.</a> Exp Eye Res. 39 (5), 533-542 (1984).</li>
<li>Lee, R. E., Davison, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+composition+and+turnover+in+ocular+tissues+of+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Collagen composition and turnover in ocular tissues of the rabbit.</a> Exp Eye Res. 32 (6), 737-745 (1981).</li>
<li>Moses, R. A., Grodzki, W. J., Starcher, B. C., Galione, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin+content+of+the+scleral+spur%2C+trabecular+mesh%2C+and+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Elastin content of the scleral spur, trabecular mesh, and sclera.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 17 (8), 817-818 (1978).</li>
<li>Foster, C. S., Sainz de la Maza, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFoster%2C+CS+%22The+sclera%22">The sclera</a>. , Springer. (2012).</li>
<li>Kiss, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Der+Blutkreislauf+des+Auges%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Der Blutkreislauf des Auges.</a> Ophthalmologica. 106, 225(1943).</li>
<li>Ashton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+study+of+Schlemm%27s+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts.+Part+I.+Aqueous+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. Part I. Aqueous veins.</a> Br J Ophthalmol. 35 (5), 291-303 (1951).</li>
<li>Ashton, N., Smith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+study+of+Schlemm%27s+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts.+III.+Arterial+relations+of+Schlemm%27s+canal%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. III. Arterial relations of Schlemm's canal.</a> Br J Ophthalmol. 37 (10), 577-586 (1953).</li>
<li>Ashton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+study+of+Schlemm%27s+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts+II.+Aqueous+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts II. Aqueous veins.</a> Br J Ophthalmol. 36 (5), 265-267 (1952).</li>
<li>Hayreh, S. S., Scott, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+iris+angiography.+II.+Disturbances+in+iris+circulation+following+strabismus+operation+on+the+various+recti%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Fluorescein iris angiography. II. Disturbances in iris circulation following strabismus operation on the various recti.</a> Arch Ophthalmol. 96 (8), 1390-1400 (1978).</li>
<li>Virdi, P. S., Hayreh, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+segment+ischemia+after+recession+of+various+recti.+An+experimental+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Anterior segment ischemia after recession of various recti. An experimental study.</a> Ophthalmology. 94 (10), 1258-1271 (1987).</li>
<li>Bron, A. J., Easty, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+angiography+of+the+globe+and+anterior+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Ophthalmol+Soc+U+K%22%5BJournal%5D)">Fluorescein angiography of the globe and anterior segment.</a> Trans Ophthalmol Soc U K. 90, 339-367 (1970).</li>
<li>Ikegami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+angiography+of+the+anterior+ocular+segment.+Part+1.+Hemodynamics+in+the+anterior+ciliary+vessels+%28author%27s+transl%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nihon+Ganka+Gakkai+Zasshi%22%5BJournal%5D)">Fluorescein angiography of the anterior ocular segment. Part 1. Hemodynamics in the anterior ciliary vessels (author's transl).</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 78 (7), 371-385 (1974).</li>
<li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LYVE-1%2C+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein%2C+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> J Cell Biol. 144 (4), 789-801 (1999).</li>
<li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries%3A+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).</li>
</ol>

המחברים לא מצהירים על גילויים כספיים. תוכן מאמר זה הוא באחריות המחברים בלבד.

למינציה בלובן העין האנושית היא שיטה לביצוע במיקרוסקופ confocal על רקמה זו. שלב קריטי בתהליך זה הוא השימוש באתנול במקום פורמלין עבור הדבקת הרקמה. מניסיוננו, תוצאות טובות יותר מתקבלות כאשר באמצעות אתנול במקום פורמלין עבור קיבעון. אזמלים בלאנט להחמיר את ההליך וכן יש להימנע. באופן דומה, עד הייבוש של בלובן העין יש להימנע, כפי שהוא מסבך את ההליך ומקטין את איכות התמונות. באשר מכתים immunohistochemical, נוגדנים אחרים מאל...

בלובן העין היא השכבה החיצונית הנוקשה המכסה את העין, העשוי רקמת חיבור צפופה. זה עוזר להגן על מבנים תוך-עיני וכדי לשמור על לחץ תוך עיני. לפיכך, בלובן העין חיוני לראייה ברורה. זהו ללא כלי הלימפה 1,2 ובכך מהווה גבול חיצוני הלימפה ללא הבינה לבין העין הפנימית ללא הלימפה 3-7. הוא גם מספק אתרים מצורפים עבור שרירי extraocular וחולק דמיון אנטומי עם גידים. מכיוון בלובן העין מורכבת בעיקר צרורות צפופות של סוג אני קולגן יש מספרים קטנים של סוגי קולגן III, IV, V, VI, VIII 8,9 ואלסטין 10,11, רקמה זו אינה קלה לשימוש עבור אימונוהיסטוכימיה. אנטומית, בלובן העין ניתן לחלק לשלוש שכבות עיקריות: (1) episclera vascularized השטחי, נמצאות מתחת הלחמית הקפסולה של שֶׁגֶם ולקראת הצדדים הבחזרה הדואר של העין מול מסלולו; (2) את stroma scleral, החלק העיקרי של בלובן העין; ו (3) את lamina fusca, המהווה שכבה דקה, פיגמנט ממוקם ישירות מעל עִנבִּיָה. הידע אנטומי שלנו על בלובן העין נובע בעיקר מן המחצית הראשונה של המאה ה -20. באותו זמן, חוקרים בדקו את האנטומיה של כלי דם בעיקר באמצעות זריקות דיו הודו 12 וכלי דם ליהוק 13-15. מאוחר יותר, זה נחקר במחקרים והאנגיוגרפית 16-19. מאז אותה תקופה, שיטות ישנות שופרו חדשים פותח אפשרו לנו להשלים את הידע האנטומי קודם. לדוגמה, זה כבר רק יותר מעשור אחד מאז היו לנו סמנים הלימפה אמין כמו-1 קולטן hyaluronan ספציפי האנדותל של כלי הדם הלימפה (LYVE1) 20 או 21 podoplanin. מיקרוסקופיה Confocal מציעה אפשרויות חדשות ללימוד התכונות אנטומיות של ti השונהssues של העין. היא מאפשרת כתמים מרובים כדי לשמש להבחנת סמנים של תאים או עבור הלוקליזציה של תאים ביחס כלי דם מבנים אנטומיים אחרים. הוא מספק סקירה כאשר המדגם הוא בגודל גדול יותר ומאפשר לנו לסרוק באמצעות מדגם כאשר בחיפוש אחר סוג תא מסוים. בעזרת טכנולוגיה Z-Stack, מיקרוסקופיה confocal יכול לשמש דגימות עד 100-200 מיקרומטר. בלובן העין שונה בעובי בין 0.3 מ&quot;מ מאחורי הוספות שרירים 1 מ&quot;מ בקוטב האחורי 11. בשל הוא עובי השקיפות שלה, בלובן העין אינו מתאים מיקרוסקופיה confocal בשיטות מסורתיות. כדי לתקן את זה, רקמות scleral היו למינציה כדי לאפשר ניתוח שלהם עם מיקרוסקופיה confocal. טכנולוגיה זו שימושית להשגת הבנה טובה יותר של שני מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים ב בלובן העין האנושית.

<table><tbody><tr><td>96% אתנול</td><td>Merck Chemicals, דרמשטדט, גרמניה</td><td>P075.4</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו דו-עיני&nbsp;</td><td>Motic, הונג קונג, סין</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>26 גרם מחטים&nbsp;</td><td>Terumo, Leuven, בלגיה</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>15.5 מ"מ trepan</td><td>Geuder, היידלברג, גרמניה</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>מס' 10 אזמל&nbsp;</td><td>Feather, pfm רפואי, אוסקה, יפן</td><td>2E+08</td><td></td></tr><tr><td>אזמל עיניים מיקרו נוצות&nbsp;</td><td>נוצה, pfm רפואי, אוסקה, יפן</td><td>מס' 7657BR</td><td></td></tr><tr><td>CD 31 נוגדן (עכבר חד שבטי אנטי אנושי)</td><td>דקו, ארה"ב</td> נוגדן <td>IR610</td><td></td></tr><tr><td>LYVE1&nbsp; (ארנב רב-שבטי אנטי אנושי)</td><td>Zytomed , גרמניה</td><td>RBK014-05</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד עכבר FITC נוגדן</td><td>Sigma Aldrich, Steinheim, גרמניה</td><td>F0257</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד ארנב Cy3 נוגדן</td><td>Dianova, גרמניה</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Goat Serum normal</td><td>Dako , גלוסטרופ, דנמרק</td><td>X090710-8</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Carl Roth GmbH, קרלסרוה, גרמניה</td><td>6335.1</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שקופיות&nbsp;</td><td>אנגלברכט, Ederm&uuml; nde, גרמניה</td><td>WC7695002</td><td></td></tr><tr><td>כיסויים 24 מ"מ x 24 מ"מ</td><td>Th. Gayer, Lohmar, גרמניה</td><td>7695026</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הרכבה פלואורסצנטי DAKO&nbsp;</td><td>DAKO, ארה"ב</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>LSM Meta 510 מיקרוסקופיה קונפוקלית&nbsp;</td><td>Carl Zeiss AG, Jena, גרמניה</td><td>n.a</td><td></td></tr></tbody></table>

באמצעות טכניקה למינציה לבצע confocal מיקרוסקופית של האדם בלובן העין

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

בלובן העין היא רקמת חיבור צפופה שמכסה ומגן על העין. זה מורכב בעיקר חבילות קולגן צפופות (סוגים אני, III, IV, V, VI, ו- VII). בשל autofluorescence, העמימות, והעובי שלה, זה לא נמצא מתאים מיקרוסקופיה confocal. גישה חלופית לזו שהוצגה כאן, אשר משתמשת בלובן העין קבוע בפורמלין מוטבע פרפין עבור אימונוהיסטוכימיה, יש אתגרים טכניים, במיוחד כאשר החימום המוקדם הרקמה לאחזור אנטיגן. מאז בלובן העין הוא דל יחסית בשני התאים וכלי, שימוש דגימות רקמה גדולות שנחקר כדי לסייע במניעת תאים המשקיפה ולהבין הלוקליזציה שלהם ביחס כלי ואתרי אנטומיים אחרים. כדי לאפשר הניתוח של דגימות רקמה גדולות תחת מיקרוסקופ confocal, טכניקת למינציה בוצעה ליצור שכבות דקיקות מן בלובן העין. בעקבות ניתוח התוצאות של כלי הדם CD31 ו hyalu אנדותל כלי הלימפהרונאן קולטן 1 (LYVE1) תאים חיוביים, לגביה אישור לבדיקה מדעית הושג, את היתרונות והמגבלות של שיטה זו הם דנו.

בניסויי הנציג בצעו כאן, ישנם יתרונות להדגמה נגזרים השימוש בטכניקת למינציה המסוימת הזה. הניסוי הראשון ממחיש את הרשת המגוונת של מקלעת כלי דם episcleral בשלוש תמונות נציג (איור 3). הכלי הן חיובי עבור CD31. הניסוי השני מראה תאים חיסוניים, בפרט LYVE1 + תאים של episclera ויחסיהם אל כלי דם חיובי CD31. הנה טכנולוגיית Z-Stack שימש ב 10X ההג...

רקמת הסקלרה האנושית היא בעיקר קולגן; לכן, היא אינה ניתנת לשימוש בקלות עבור אימונוהיסטוכימיה. כדי להשיג את המטרה של ביצוע אימונוהיסטוכימיה למיקרוסקופיה קונפוקלית של רקמת סקלרל, נעשה שימוש בטכניקת למינציה.

באמצעות טכניקה למינציה לבצע Confocal מיקרוסקופית של האדם בלובן העין


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

המטרה הכללית של מתודולוגיה זו היא לבצע מיקרוסקופיה קונפוקלית של הלבנה האנושית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מרכזיות בתחום האופתלמולוגיה, כגון התפלגות תאי מערכת החיסון ומצב כלי הדם בלבנה במצבים בריאים ובמצבים פתולוגיים.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הדמיה קונפוקלית של רקמת חיבור צפופה. את הפרוצדורה יעגים סטפן קרמרס, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, הכבירו Ethanol בריכוז 96 אחוזים ו-PBS בשפופרות נפרדות.לאחר מכן, הכינו 100 µL לכל דגימה של הנוגדנים הראשוניים בדילול המומלץ ב-PBS המכיל 2% BSA, ושמרו את כל התמיסות על קרח. הכינו מכשירים נקיים, כולל פינצטות Colibri אחת עד שתיים, מספרי מיקרו-דיסקציה ישרים, מספריים מעוקלים, סכין מנתחים מספר 10 או סכין מיקרו-נוצה אופתלמית, ארבעה מחטים בכיל 26, ומקלון. עטפו רדיד אלומיניום סביב פלטת פוליסטירן, או הכינו פלטת שעם להצמדת הרקמה.לאחר הפקת נורה עם פתיחה קדמית בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הניחו את ה-Sclera על מקלון כאשר החלק הפתוח פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, השתמשו בפינצטת colibri כדי להסיר את הרשתית ואת שכבות הענבייה הפיגמנטיות מהסקלרה הפנימית, עד שהסקלרה תהיה נקייה משכבות אלו. לאחר מכן, השתמשו במספריים קמורים במידת הצורך כדי להסיר את הרשתית והענבייה מהפפילה.לאחר מכן, הסר את שארית הלבבית (conjunctiva), את השרירים חוץ-מסביביים ואת קפסולת טנון (tenons capsule) מהסקלרה השטחית. כעת, בעזרת פינצטת קוליברי (colibri forceps) לאחיזה עדינה של הרקמה, גזור בעזרת מספריים ישרים דגימות סקלרה בגודל של כשני סנטימטר רבוע ממיקומים שונים ברקמה, תוך הימנעות מאחיזה חוזרת בפינצטה, שכן הדבר יהפוך את האזור לבלתי מתאים למיקרוסקופיה קונפוקלית. העבר את הדגימות לאنبובות בנפח 1.5 milliliter, הוסף 1.5 milliliters של ethanol בריכוז 96%, והדגר למשך 15 דקות לצורך קיבוע הרקמה.לאחר הסרת האתנול, השתמש ב-1.5 milliliters של PBS לשטיפת הדגימות שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם תוך כדי ניעור. לאחר מכן, העבר את הדגימות ל-1.5 milliliters של PBS עם 5% BSA, והדגש בטמפרטורת החדר למשך שעתיים כדי להשריות נפח (swelling) של הדגימות, מה שיסייע בלמינציה וימנע קישור לא ספציפי. כאשר הדגימות התנפחו, השתמש תחת מיקרוסקופ סטריאו-בינוקולרי במחטים בכיליבר 26 שקצוותיהן כופפו, כדי לקבע את דגימות הסקלרה האחורית לממברנת פוליסטירן עטופה ברפאל, או ללוח שעם.כדי לבצע למינציה לדגימות בעובי מלא, השתמשו בפינצטות colibri כדי להחזיק אופקית את הקצה הקדמי של רקמת הלובן (sclera). בעזרת סכין מנתחים מספר 10, חתכו בזהירות שכבה דקה ככל האפשר של הלובן השטחי מהשכבה שמתחתיה. כדי למנוע את התייבשות הרקמה, טפטפו באמצעות פיפטה 50 µL של PBS על השכבות.לאחר חיתוך השכבות, הנח אותן ב-100 µL של PBS בתוך פלטה בעלת 96 בארות, והשתמש בטוש עמיד למים כדי לסמן הן את הכיוון והן את השכבה. המשך לבודד שכבות ולהעבירן לפלטה בעלת 96 בארות עד להשלמת למינציה מלאה של הרקמה. כדי לבצע אימונוהיסטוכימיה, הסר את המצע מהפלטה בעלת 96 הבארות על ידי הצמדת הפיפטה לדופן כל בארה ושאיבת הנוזל.לאחר מכן, הוסיפו לבארים המתאימות 100 µL של נוגדנים ראשוניים בדילול של 1:100 ב-PBS עם 2% BSA, והדגרירו בטמפרטורה של 4 °C למשך לילה. למחרת, השתמשו ב-200 עד 300 µL של PBS כדי לשטוף את הדגימות על ניעור (shaker) שלוש פעמים, למשך חמש דקות בכל פעם. במידת הצורך, השתמשו בנוגדן ראשוני אחר והדגרירו שוב למשך לילה ב-4 °C.לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של הנוגדנים המשניים המתאימים, המדוללים ביחס של 1:300 ב-PBS עם 2% סרום עיזים, והדגירו בחושך בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת עד שעתיים. לאחר ההדגרה, השתמשו ב-200 עד 300 µL של PBS כדי לשטוף שוב את הדגימות על השייקר שלוש פעמים, למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן, הוסיפו לכל באר 100 µL של DAPI בדילול של 1:2000 והדגירו בחושך בטמפרטורת החדר.ראשית, השתמשו ב-200 עד 300 µL של PBS לשטיפת הדגימות פעמיים. העבירו את הדגימות למסלוליות מיקרוסקופ תחת מיקרוסקופ סטריאו-בינוקולרי כדי לוודא שהדגימה מונחת בצורה שטוחה על המסלולית, והוסיפו טיפה אחת עד שתיים של תמיסת קיבוע פלואורסצנטית. לאחר מכן, הניחו כיסוי זכוכית מעל והשתמשו בלק שקוף לאטימה של השוליים.שמרו בחושך בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר או בחנו ישירות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. כדי לאמת את עובי הדגימות, בצעו z-stacks, שכן העובי משתנה בין האזור המשתורי לאזור האחורי, בהתאם למיקום בסקלרה. תמונות אלו מראות את הרשת המגוונת של רשת כלי הדם בסקלרה אנושית שכבתית, שהופקה מהאפיסקלרה הקדמית והאחורית.כלי הדם חיוביים ל-CD31 כפי שמוצג בירוק. באיור זה מוצגים תאי חיסון חיוביים ל-LYVE1 של האפיסקלרה (episclera) והקשר בינם לבין כלי הדם החיוביים ל-CD31. סדרת ה-z-stack צולמה בהגדלה של 10x כדי לבחון את היחסים התלת-ממדיים בין כלי הדם לתאי החיסון.כפי שמוצג כאן, ניתן לנתח גם את השרירים החוץ-עיניים העטופים בתוך הלמיטרה (sclera) כדי לבדוק נוכחות של כלי דם או תאי מערכת החיסון, באמצעות הסמנים CD31 ו-LYVE1 בהתאמה. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע את טכניקת הלמינציה בפחות משעה אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור למנוע מהרקמה להתייבש.אל תשכחו שעבודה עם רקמות אנושיות עלולה להיות מדבקת, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות מראש, כגון אבחונים מיקרוביולוגיים ווירוסולוגיים.

using-laminating-technique-to-perform-confocal-microscopy-human

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

פרוטוקול זה מתאר שיטות להערכת cross-linking כימי בסקלרה ארנב באמצעות הדור השני הרמונית הדמיה ודיפרנציאלי סריקה calorimetry.

השני דור הרמונית אותות ב הארנב בסקלרה ככלי להערכה של רקמות טיפולית cross-linking של קוצר ראייה (TXL)

מחקר זה מציג עבור הרקמה הפיך ניקוי, immunostaining, תלת-ממד עיבוד וניתוח רשתות כלי דם השליה האנושית הדגימות villi גודל 1-2 מ מ3פרוטוקול.

תלת מימדי עיבוד וניתוח של Immunolabeled, מובהר היפרדות villous חלקית וסקולרית הרשתות האנושיות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להמחיש תאים חיסוניים בתוך מטריצה תלת מימדי (3D) קולגן באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות. פרוטוקול זה מרחיב כיצד לעקוב אחר נדידת תאים ב- 3D. פרוטוקול זה יכול להיות מועסק עבור סוגים אחרים של תאים השעיה מטריקס תלת-ממד.

מיקרוסקופ אור גיליונות עבור ויזואליזציה תלת מימדי של תאים חיסוניים אנושי

המטרה של הפרוטוקול היא להציג האורך intravital מעקב בזמן אמת אחר thymocytes על-ידי סריקת מיקרוסקופ ב שתלים הרתי בתא הקדמי של העין עכבר לייזר. את השקיפות של הקרנית, אמוניה השתל מאפשר הקלטה ברציפות קדמון תא גיוס ויציאה T-cell בוגרת.

בזמן אמת In Vivo המעקב של Thymocytes בתא הקדמי של העין על ידי סריקת מיקרוסקופ לייזר

פרוטוקול שהוצג כאן מאפשרת אפיון ריאות ביות של לימפוציטים אנושיים הראשי תחת תנאים דלקתיים ויוו. יכול להיות עם תמונה, לכמת על-ידי קרינה פלואורסצנטית אור גיליונות מיקרוסקופיה של רקמת הריאה כימית שנוקה ריאתי חדירה של תאים חיסוניים האנושי הועבר adoptively במודל של עכברים של דלקת אלרגית.

הדמיה של לימפוציטים אנושיים יונת ריאות ב ניסיוני במודל Vivo של דלקת אלרגית בהתבסס על מיקרוסקופ אור גיליונות מתקדמות

המטרה של פרוטוקול זה היא להראות כיצד להשתמש במיקרוסקופיה של יריעות האור כדי להמחיש באופן זמני את הדינמיקה של קולטן פני השטח בתאים חיים. כאן קולטני תא T על CD4+ תאי t הראשי מוצגים.

דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג

להלן הפרוטוקול של טכניקת קונפוקל, המשלבת מיקרוסקופיה של כוח קונפוקלי ואטומי לפלטפורמת מכשיר יחיד. Conpokal מספק תא זהה, אותו אזור, ליד הדמיה קונפוקאלית בו זמנית אפיון מכני של דגימות ביולוגיות חיות.

ליד סריקת לייזר בו זמנית מיקרוסקופיה קונפוקל וכוח אטומי (Conpokal) על תאים חיים

מטרת פרוטוקול זה היא לאפיין מודל חדשני של ניוון עצבי גלאוקומטי המבוסס על צריבה תרמית של 360° של מקלעת כלי הדם הלימבלית, הגורמת ליתר לחץ דם עיני תת-חריף.

צריבה במעגל מלא של מקלעת כלי הדם הלימבלית לגלאוקומה הנגרמת בניתוח במכרסמים

הפרוטוקול מספק שיטה מפורטת של הדמיה עצבית בפרוסת המוח באמצעות שיטת ניקוי רקמות, ScaleSF. הפרוטוקול כולל הכנת רקמות מוח, הבהרת רקמות, טיפול בפרוסות מנוקות והדמיית מיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית של מבנים עצביים מרמות מזוסקופיות למיקרוסקופיות.

שיטת ניקוי רקמות להדמיה עצבית מסולמות מזוסקופיים למיקרוסקופיים

הפרוטוקולים הנוכחיים מתארים הדמיה חדשה של הר שלם להדמיית מבנים היקפיים בעדשת העין עם שיטות לכימות תמונה. פרוטוקולים אלה יכולים לשמש במחקרים כדי להבין טוב יותר את הקשר בין מבנים מיקרוסקולריים של עדשה לבין התפתחות/תפקוד עדשה.

הדמיה של תושבת שלמה כדי להמחיש ולכמת את מבנה העדשה ההיקפית, המורפולוגיה של התא והארגון

למדו מיקרוסקופיית קונפוקל של רקמת סקלרה אנושית באמצעות טכניקת למינציה. שיטה זו מאפשרת חקר התפלגות תאי חיסון ומצב כלי דם ברקמה צפופה, ומסייעת למחקר בעיניים בריאות ופתולוגיות.

באמצעות טכניקה למינציה לבצע Confocal מיקרוסקופית של האדם בלובן העין

גלה סרטונים נוספים