באמצעות טכניקה למינציה לבצע Confocal מיקרוסקופית של האדם בלובן העין

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו, היא לבצע מיקרוסקופיה קונפוקלית של הסקלרה האנושית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום העיניים. כגון התפלגות תאי מערכת החיסון ומצב כלי הדם אצל הבריאים, והמצבים הפתולוגיים בסקלרה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת הדמיה קונפוקלית של רקמת חיבור צפופה. מי שידגים את ההליך יהיה סטפן קרמרס, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, הכינו 96 אחוז אתנול ו- PBS בצינורות בודדים.

לאחר מכן הכינו 100 מיקרו-ליטר לדגימה של הנוגדנים העיקריים בדילול המומלץ של PBS המכיל שני אחוז BSA, ושמרו את כל התמיסות על קרח. סדרו מכשירים נקיים, כולל מלקחיים אחד עד שניים של Colibri, מספריים ישרים לניתוח, מספריים מעוקלים, אזמל מספר 10 או מיקרו נוצה של אזמל עיניים, ארבע מחטים בגודל 26 ומקלון. עטפו נייר אלומיניום סביב צלחת פוליסטירן, או הכינו צלחת פקק כדי להדביק את הרקמה.

לאחר הפקת נורה שנפתחה מלפנים על פי פרוטוקול הטקסט, הנח את הסקלרה על ספוגית כשהחלק הפתוח פונה כלפי מעלה. לאחר מכן השתמש במלקחיים קוליברי כדי להסיר את הרשתית, ואת שכבות הענבייה הפיגמנטיות מהסקלרה הפנימית עד שהסקלרה נקייה משכבות אלו. לאחר מכן, השתמש במספריים מעוקלים במידת הצורך כדי להסיר את הרשתית והענביה מהפפילה.

לאחר מכן הסר את שארית הלחמית, השרירים החוץ-ביציים וכמוסת הטנונים מהסקלרה השטחית. כעת באמצעות מלקחיים קוליבריים כדי להחזיק בעדינות את הרקמה, עם מספריים ישרים חותכים כשתי דגימות סקלרליות בגודל סנטימטר מרובע ממקומות שונים על הרקמה, תוך הימנעות מתפיסה חוזרת עם המלקחיים מה שיהפוך את האזור ללא מתאים למיקרוסקופיה קונפוקלית. מניחים את הדגימות בצינורות של 1.5 מיליליטר, מוסיפים 1.5 מיליליטר של 96 אחוז אתנול ודוגרים למשך 15 דקות כדי לתקן את הרקמה.

לאחר מכן, לאחר הסרת האתנול, השתמש ב-1.5 מיליליטר PBS כדי לשטוף את הדגימות שלוש פעמים למשך חמש דקות כל אחת תוך כדי ניעור. לאחר מכן, העבירו את הדגימות ל-1.5 מיליליטר PBS עם חמישה אחוזי BSA, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך שעתיים, מה שיגרום לנפיחות של הדגימות, כדי לסייע בלמינציה ולמנוע קשירה לא ספציפית. כאשר הדגימות התנפחו, תחת מיקרוסקופ סטריאו-דו-עיני השתמש במחטים בגודל 26 שהיו מכופפות בקצוות כדי להצמיד את הדגימות הסקלרליות האחוריות לקרום הפוליסטירן העטוף בנייר כסף, או לצלחת השעם.

לאחר מכן, כדי לרבד את דגימות העובי המלא, השתמש במלקחיים קוליברי כדי להחזיק אופקית את הקצה הקדמי של רקמת הסקלרי. בעזרת אזמל מספר 10, חותכים בזהירות שכבה דקה ככל האפשר של הסקלרה השטחית, מהשכבה הבסיסית. כדי למנוע מהרקמה להתייבש, פיפטה 50 מיקרו-ליטר PBS על השכבות.

לאחר חיתוך השכבות הניחו אותן ב-100 מיקרו-ליטר PBS בצלחת של 96 בארות, והשתמשו בטוש עמיד למים כדי לתייג הן את הכיוון והן את השכבה. המשיכו לבודד שכבות והעבירו לצלחת 96 הבאר עד שהרקמה למינציה מלאה. כדי לבצע אימונוהיסטוכימיה, הסר את המדיום מצלחת 96 הבאר על ידי החזקת הפיפטה כנגד הקיר של כל באר ושאיבת הנוזל.

לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרו-ליטר של הנוגדנים העיקריים המדוללים 1 עד 100 ב-PBS עם 2 אחוז BSA לבארות המתאימות, ודגרו בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת השתמש ב-200 עד 300 מיקרו-ליטר PBS כדי לשטוף את הדגימות על שייקר שלוש פעמים למשך חמש דקות כל אחת. במידת הצורך, השתמש בנוגדנים ראשוניים אחרים ודגר שוב למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן מוסיפים 100 מיקרו-ליטר של הנוגדנים המשניים המתאימים, מדוללים אחד עד 300 ב-PBS עם סרום עיזים של שני אחוזים, ודוגרים בחושך בטמפרטורת החדר למשך שעה עד שעתיים. לאחר הדגירה, השתמש ב-200 עד 300 מיקרו-ליטר PBS כדי לשטוף את הדגימות שוב על השייקר שלוש פעמים למשך חמש דקות כל אחת. לאחר מכן הוסף 100 מיקרו-ליטר של דילול של 1 עד 2000 של DAPI לכל באר ודגר בחושך בטמפרטורת החדר.

לפני השימוש ב-200 עד 300 מיקרו-ליטר PBS כדי לשטוף את הדגימות פעמיים. העבירו את הדגימות לשקופיות מיקרוסקופ מתחת למיקרוסקופ הסטריאו-דו-עיני כדי לוודא שהדגימה שוכבת שטוחה על השקופית, והוסיפו טיפה אחת עד שתיים של מדיום הרכבה פלואורסצנטי. לאחר מכן הניחו כיסוי כיסוי מעל והשתמשו בלק שקוף כדי לאטום את הקצוות.

יש לאחסן בחושך בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר או להיבדק ישירות על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. כדי לאמת את עובי הדגימות, קח ערימות z מכיוון שהעובי שונה בקו המשווה ומאחור בהתאם למיקום הסקלרלי. תמונות אלה מראות את הרשת המגוונת של מקלעת כלי הדם בסקלרה אנושית למינציה שמקורה באפיסקלרה הקדמית והאחורית.

כלי הדם חיוביים ל-CD31 כפי שמוצג בירוק. באיור זה מומחשים תאים חיסוניים חיוביים ל-LYVE1 של האפיסקלרה, והקשר שלהם לכלי הדם החיוביים CD31. סדרת z-stack צולמה בהגדלה של פי 10 כדי לבחון את היחסים התלת מימדיים של כלי דם ותאי חיסון.

כפי שמוצג כאן ניתן לנתח גם את השרירים החוץ-עיניים הסגורים בתוך הסקלרה לנוכחות כלי דם או תאי חיסון, באמצעות הסמנים CD31 ו-LYVE1 בהתאמה. לאחר שליטה, ניתן לבצע את טכניקת הלמינציה תוך פחות משעה אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור למנוע את התייבשות הרקמה.

אל תשכח שעבודה עם רקמה אנושית עלולה להיות מדבקת ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון אבחון מיקרוביולוגי ווירולוגי מראש.