מיקוד Associated Biofilm

המטרה הכללית של הליך זה היא לגדל באופן פשוט וניתן לשחזור ביופילמים חיידקיים בפורמט של פלטת 96 בארות על פינים המחוברים למכסה, לצורך בדיקת רגישות לאנטיביוטיקה באמצעות צבע חיוניות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הגילוי והפיתוח של אנטיביוטיקה, על ידי בחינת פעילויות על תאים הקשורים לביופיلمين, המייצגים לרוב טוב יותר מצבים של זיהום in vivo. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת לאתגר בקלות ביופילמים שנוצרו מראש במערך בדיקה תלת-שלבי במצע, ולקבוע עיכוב באמצעות צבע חיוניות נפוץ.

ראשית, גדלו תרבית של אורגניזם המייצר ביופילם במצע עשיר בחומרים מזינים. זרקו את זן ה-Staphylococcus aureus Newman מתוך גליצרין למערכת של 10 milliliters של מצע Muller-Hinton. בצעו את כל העבודה הכרוכה בטיפול ב-S.aureus עם כפפות ובתוך קבينة בטיחות ביולוגית.

דגרו למשך 16 שעות ב-37 °C במנערה סיבובית. העבירו את נפח התרבית המחושב לפסולת צנטריפוגה, והשקיעו את התאים על ידי סבב של דקה אחת ב-10,000 Gs. להכנת תכשיר ההIsInoculum לביופילם, שאבו את מצע הגידול המשומש ותלו את משקע התאים ב-20 milliliters של CRPMI. באמצעות פיפט רב-ערוצי של 200 microliter, הוסיפו 125 microliters של תכשיר ה-inoculum ממאגר של 25 milliliter לכל באר בשורות A עד G של הפלטה התחתונה.

מלאו 125 µL של מצע CRPMI סטרילי בכל באער בשורה H כביקורת סטריליות. קחו את מכסה הפינים והחזיקו אותו מעל תחתית הפלטה כאשר הפינים פונים כלפי מטה. יישרו בזהירות את הפינים הבודדים עם הבאערים התואמים להם.

הימנעו ממגע פיזי בין הפלטה לבין הפינים. לאחר היישור, הורידו את המכסה בזהירות. אטמו את המכסה לפלטה באמצעות סרט פאראפין כדי למנוע התאיידות, והניחו אותה בתוך שקית פלסטיק ניתנת לאטימה, תוך כדי סגירה הדוקה.

שמרו על נפח אוויר נמוך ככל האפשר בתוך השקית כדי למזער אידוי. דגרו את הפלטה ללא ניעור בטמפרטורה של 37 °C למשך 48 שעות, באינקובטור עם 5% Carbon Dioxide. ביום אתגר הביופילם, קחו פלטה חדשה של 96 בארות והוסיפו 100 µL של CRPMI, שהגיע לטמפרטורת החדר, לכל בארה בשורות B עד H. דללו עד ארבעה תרכובות בדיקה בנפרד, ב-1.0 mL של CRPMI, לריכוז סופי כפול (2x) מהריכוז הרצוי.

הוסיפו 200 µL של תרכובת 1 לבארים A1-A3. הוסיפו 200 µL של תרכובת 2 לבארים A4-A6. הוסיפו 200 µL של תרכובת 3 לבארים A7-A9, ו-200 µL של תרכובת 4 לבארים A10-A12. בצעו דילול סדרתי של תרכובות הבדיקה באמצעות פיפט רב-ערוצי.

התחילו בהעברה של 100 µL משורה A לשורה B, וערבבו. באופן זה, המשיכו להעביר 100 µL מבאר לבאר. ערבבו לאחר כל העברה, והפסיקו בשורה F. לאחר הערבוב, השליכו 100 µL משורה F לכלי פסולת.

אין להעביר נוזל כלשהו לשורות G ו-H. לבסוף, הוסף 100 µL של CRPMI לכל באער בלוח באמצעות פיפט רב-ערוצי, כדי להביא את הנפח הסופי ל-200 µL. הוסף 200 µL של phosphate-buffered saline ללוח 96 באערים סטרילי וחדש, בעל באערים במידות זהיות לאלו של לוח ייזום הביופילם. לאחר מכן, הסר את שקיות הפלסטיק ואת סרט הפרפין מלוח ייזום הביופילם שעבר אינקובציה.

הרמו את המכסה ישירות כלפי מעלה, תוך הימנעות ממגע בין הפינים לתחתית המגש, שכן הדבר עלול לפגוע בביופילם. שמרו את החלק התחתון לצורך ניתוח OD600 בהמשך. שטפו תאי פלנקטון על ידי הנחת מכסה הפינים על המגש המכיל PBS.

טבול את הפינים למשך חמישה שניות. הרם אותם מתוך ה-PBS, וטבול אותם פעם נוספת, תוך הקפדה שלא להקיש עם הפינים בדפנות הבארים. הנח את מכסה הפינים השטוף לתוך לוח האתגר.

הימנעו ממגע מיותר בין הפינים לבין תחתית הפלטה, שכן הדבר יפגע בביופילם ויוביל לתוצאות לא עקביות. אטמו את הפלטה באמצעות סרט פראפין, והניחו אותה בתוך שקית פלסטיק הניתנת לאטימה כפי שנעשה קודם לכן. דגרו את הפלטה, ללא ניעור, למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 °C, בתוך אינקובטור עם 5% Carbon Dioxide.

העבירו את התחתית של פלטת ייזום הביופילם ותלו את החיידקים בכל באר באמצעות פיפט רב-ערוצי. מדדו את ה-OD600 באמצעות קורא מיקרו-פלטה מתאים, כדי לוודא שחלה צמיחה בכל הבארים למעט בבקרת הסטריליות בשורה H. השתמשו בקורא פלטות המצויד בתא דגירה ומסוגל לבצע קריאות פלואורסצנציה קינטיות לצורך זיהוי המרת רזאזורין (resazurin). הגדירו מדידת פלואורסצנציה קינטית למשך 24 שעות, תוך שימוש באורך גל עירור של 530 nanometer ואורך גל פליטה של 590 nanometer.

הגדירו את טמפרטורת התא ל-37 °C, וקבעו קריאה של הפלטה בכל 20 דקות. הגדירו את קורא הפלטות למדידה מהחלק התחתון של הפלטה בהתאם להוראות היצרן. הכינו את הפלטה לשטיפה על ידי הוספה של 200 µL של PBS לכל באער בפלטה סטרילית בעלת 96 באערים באמצעות פיפט רב-ערוצי.

לאחר מכן, הכין מצע להתאוששות ביופילם על ידי הוספת 400 µL של תמיסת מקור resazurin בריכוז 0.8 mg/mL ל-20 mL של מצע CRPMI, עד לריכוז סופי של 16 µg/mL של resazurin. לאחר מכן, הוסף 150 µL של מצע להתאוששות ביופילם לכל באר בלוח 96 באריים חדש באמצעות פיפט רב-ערוצי. העבר את לוח האתגר מהאינקובטור לקלחת בטיחות ביולוגית, והסר בזהירות את השקית פלסטיק ואת סרט האיטום.

הסר את מכסה הפינים (peg lid) מלוח האתגר, ושטוף תאי פלנקטון ב-PBS כפי שנעשה קודם לכן, תוך שמירת תחתית לוח האתגר לצורך אנליזת OD600 בהמשך. לאחר השטיפה, הנח את מכסה הפינים לתוך תחתית הלוח המכילה את מדיום השחזור של הביופילם. עטוף את דפנות הלוח בסרט פאראפין, תוך הקפדה שלא לחסום את התחתית של בארות ההיקף.

מיד לאחר עטיפת הפלטה, הנח אותה בקורא הפלטות והתחל קריאה קינטית לאורך תקופה של 24 שעות, על ידי הפעלת פרוטוקול הקינטיקה של ה-resazurin שהוגדר מראש. כדי לכמת את הצמיחה של תאים פלנקטוניים שעשויים או לא להיווצר במהלך האתגר, קרא את ה-OD600 של כל תחתית פלטת האתגר באמצעות קורא מיקרו-פלטות. מוצג כאן דוגמה למבנה של פלטת אתגר, המשתמשת בשני דילוולים מלאים כדי לתתר את ריכוזי התרכובות.

ביופילמים גדוליים טופלו בנאוקופרואין (neocuproine) או בקומפלקס הנחושת שלו. קריאות OD600 של תחתית פלטת האתגר לאחר 24 שעות גילתה כי קומפלקס הנחושת של נאוקופרואין, אך לא נאוקופרואין לבדו, מנע שחרור וצמיחה עוקבת של תאים חיוניים מביופילמים שטופלו בריכוזים של 1.25 micromolar ומעלה. הביופילמים התואמים נבחנו לאחר מכן באמצעות בדיקת רזאזורין (resazurin assay).

בדיקה חזותית לאחר 24 שעות מאפשרת קבלת תשובה מהירה של "כן" או "לא" כאשר מריצים מספר פלטות במקביל. Resazurin הופך לוורוד בבארים עם ביופילמים חיוניים, אך נשאר כחול כאשר הביופילם הושמד. קריאה קינטית של המרת resazurin יכולה לחשוף השפעות תלויות-ריכוז על חיוניות הביופילם, כפי שמוצג כאן עם gentamicin.

העיכוב התלוי-ריכוז בתחילת המרת הצבע מעיד על ירידה בחיוניות הביופילם. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להימנע מההטבקה של הפינים (pegs) לדפנות הבארות.