Name: מיקוד Associated Biofilm Staphylococcus aureus Assay רגישות בסמים בהתבסס Resazurin שימוש (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: למדו שיטה לגידול ביופילמים חיידקיים בפורמט צלחת 96-באריות לבדיקת רגישות לאנטיביוטיקה באמצעות צביעת חיות. השיטה מאפשרת הערכת תרכובות אנטי-מיקרוביאליות נגד Staphylococcus aureus בביופילמים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לשרן קופול על הסיוע הטכני. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק ה-NIH R01-AI104952 ל-FW. תמיכה נוספת ניתנה על ידי המרכז לחקר האיידס (CFAR) של אוניברסיטת אלבמה בברמינגהם (UAB), תוכנית במימון ה-NIH (P30 AI027767) שהתאפשרה על ידי מכוני ה-NIH הבאים: NIAID, NIMH, NIDA, NICHD, NHLDI, NIA.

1. Biofilm ייזום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תרבות של אורגניזם לייצר ביופילם בתווך עשיר מזין. לחסן זן aureus Staphylococcus ניומן ב 10 מ&quot;ל של מדיום מולר-הינטון ממלאי גליצרול. לבצע את כל העבודות שיש בהן טיפול S. aureus עם כפפות בתוך ארון בטיחות ביולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 16 שעות ב 37 ° C על שייקר רוטרי (100-200 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע OD 600 של התרבות באמצעות ספקטרופוטומטר ו קובט סטנדרטי (אורך מסלול: 1cm). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את נפח (V) של תרבות צריכה להכין 20 מ&quot;ל של הבידוד עם OD 600 (הבידוד) של 0.1 ב chelexed התקשורת מכון ממוריאל פארק Roswell (CRPMI) 9 באמצעות הנוסחה: [V = 20 מ&quot;ל * 0.1 / OD 600 (תרבות )] הערה: Reference 9 מספק פרטים על הכנת CRPMI. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את נפח תרבות מחושב (מלמעלה) לצינור צנטריפוגות ותאי גלולה על ידי ספינינג 1 דקות ב g 10,000 x. כדי prepaמחדש הבידוד ביופילם, לשאוב התא גלולה בינוני ו resuspend צמיחה בילה 20 מ&quot;ל CRPMI. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים הבידוד למאגר 25 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את המכסה מעל צלחת יתד 96-גם סטרילי על ידי משיכתו כלפי מעלה. הערה: יש להקפיד לא לזהם את היתדות שמוט מהמכסה. המכסה ניתן להציב במהופך על משטח נקי בתוך ארון בטיחות ביולוגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה 200 רב ערוצית μl, להוסיף 125 בידוד μl היטב בכל שורות A עד G של הצלחת התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו 125 μl סטרילי בינוני CRPMI היטב בכל שורה H כביקורת על סטריליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את-מכסה היתד והחזק אותו מעל תחתית הצלחת עם היתדות הפונות כלפי מטה. בזהירות ליישר את יתדות פרט עם הבארות שלהם. יש להימנע ממגע פיזי בין צלחת את היתדות. לאחר מיושר, להוריד את המכסה בזהירות למטה. הימנע misalignments כמו readjustments שבוצע לאחר היתדות נגע הצלחת התחתונה עשויה המשךשולטת עקרות aminate בשורה H. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את המכסה לצלחת עם הסרט פרפין כדי למנוע אידוי ומניחים בשקית ניילון סגר, איטום בחוזקה. שמור את נפח האוויר בשקית הנמוכה ככל האפשר על מנת למזער התאדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בלי ללחוץ על 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות 2 באינקובטור 5% CO. הערה: 48 שעות של צמיחה היו אופטימליות עבור ס aureus, אך ישתנו בהתבסס על האורגניזם בשימוש. הערה: למרות דגירת סטטי היא נקודת התחלה טובה כדי לייעל את assay, רועד בעדינות 150 סל&quot;ד על שייקר microplate היא וריאציה אפשרית כדי להביא להגברת היווצרות ביופילם של כמה ס aureus מבודד. </li></ol> 2. הכנת פלייט אתגר Biofilm <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום האתגר ביופילם לקחת צלחת 96-היטב טרי ולהוסיף 100 μl של CRPMI, equilibrated כדי RT, היטב כל השורות ב &#39;ח כדי למנוע תוצאות לא עקביות, לנצל צלחת 96-היטב שיכול להכיל 200 μlשל תקשורת כאשר היתדות הן בפנים, כוללות בארות עם ממדים זהים לאלה של הצלחת הייזום ביופילם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל עד 4 תרכובות בדיקה בנפרד 1.0 מיליליטר של CRPMI ל 2x לריכוז הסופי הרצוי, כדי לתת דין וחשבון על דילול סופי בשלב 2.7. הערה: נקודת התחלה טובה היא 8 לקפל מעל ריכוז המעכבות של תאי planktonic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של המתחם 1 בבארות A1 ל- A3, מתחם 2 בבארות A4 עד A6, מתחם 3 בבארות A7 כדי A9 מתחם 4 בבארות A10 כדי A12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדרתי לדלל את תרכובות הבדיקה באמצעות פיפטה רבה ולהעביר 100 μl משורה א &#39;עד בטור ב ומערבבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן זה, להמשיך להעביר 100 μl לבאר. מערבב אחרי כל העברה ולהפסיק בשורת פ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ערבוב, לגרש 100 μl משורה F לתוך מיכל פסולת. אל תעבירו את כל נוזל אל שורות G ו- H. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של CRPMI היטב כל הצלחת באמצעות פיפטה רבה כדילהביא את נפח 200 μl. ראה איור 1 עבור פריסת צלחת סופית. </li></ol> 3. אתגר Biofilm <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של בופר פוספט (PBS) בצלחת 96-גם סטרילי טרי כי תכונות בארות עם ממדים זהים לאלה של הצלחת ייזום ביופילם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא את שקית פלסטיק סרט פרפין מצלחת הייזום ביופילם מודגרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את המכסה כלפי מעלה. יש להימנע ממגע בין יתדות והחלק התחתון צלחת כפי שהדבר עלול לגרום נזק ביופילם. שמור חלק תחתון לניתוח שלאחר מכן OD 600 (ראה 3.8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף תאי planktonic על ידי נחת-המכסה יתד לצלחת המכילה PBS (משלב 3.1). לצלול יתדות במשך 5 שניות, להרים מתוך PBS, לצלול שוב, נזהרים שלא לפגוע יתדות נגד הצדדים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את יתד המכסה שטוף לתוך הצלחת האתגר. הימנעו ממגע בלתי נחוץ בין יתדות הצלחת התחתונה כמו זו תגרום נזק ביופילם המובילתוצאות לא עקביות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת חותם עם הסרט פרפין ומקום לתוך שקית ניילון סגר כמתואר בשלב 1.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצלחת ללא רעד במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס חממת 2 5% CO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח בתחתית צלחת biofilm ייזום מ -3.3. Resuspend החיידקים בכל טוב בעזרת פיפטה רבה ערוצים ולמדוד את OD 600 עם קורא microplate מתאים כדי לאשר צמיחה המתרחשת כל הבארות אבל שולט עקרות בשורה H. </li></ol> 4. קביעת Biofilm <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בקורא צלחת מצויד בתא דגירה ומסוגלים לקחת קריאות הקרינה הקינטית לאיתור resazurin המרה. הגדרת מדידת קרינה הקינטית 24 שעות באמצעות עירור 530 ננומטר 590 פליטת ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הטמפרטורה בתא עד 37 ° C ויש להם את צלחת לקרוא כל 20 דק &#39;. הגדר את קורא הצלחת למדוד מהחלק התחתון של הצלחת פי instruc של היצרןמשא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן צלחת לשטוף ידי הוספת 200 μl של PBS עם פיפטה רבה לצלחת גם 96 סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני התאוששות ביופילם על ידי הוספת 400 μl של 0.8 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​resazurin הפתרון המניות 20 מ&quot;ל של מדיום CRPMI לריכוז סופי של resazurin 16 מיקרוגרם / מ&quot;ל. הערה: Resazurin הוא מגרה את העור ידוע. השתמש בחלוק מעבדה, משקפים להתיז, וכפפות בזמן הטיפול. CRPMI כמו תקשורת התאוששות ביופילם שמש משום שהוא מספק את אות הרקע הנמוכה ביותר, אבל זה יכול להיות מוחלף על ידי תקשורת מילר Hinton אם מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 150 μl של מדיום התאוששות ביופילם עם טפטפת רב היטב בכל צלחת 96-היטב טריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת צלחת אתגר מן החממה לתוך ארון בטיחות ביולוגי ובזהירות להסיר שקית פלסטיק סרט איטום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מכסת היתד מצלחת האתגר ולשטוף תאי planktonic ב PBS כמתואר 3.4. שמור את החלק התחתון של צלחת אתגר OD עוקבת 600 anaתמוגה (ראה 4.10). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה, למקם את מכסת היתד לתוך התחתון הצלחת המכיל את מדיום ההתאוששות ביופילם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוטף את הצד של הצלחת עם סרט פרפין, נזהר שלא להכשיל את החלק התחתון של הבארות ההיקפיות. מייד לאחר לעטוף את הצלחת, ומניח אותו על קורא הצלחת ולהתחיל לקרוא הקינטית פני תקופה של 24 שעות על ידי ייזום עשה בעבר resazurin פרוטוקול הקינטית משלב 4.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת הצמיחה של תאים planktonic שעשוי או עלול לא להתרחש במהלך האתגר, לקרוא את OD 600 של תחתית צלחת האתגר כולו באמצעות קורא צלחת מיקרו. פעל בהתאם להוראות שניתנו בשלב 3.8. הערה: בזהירות resuspend התוכן של כל אחד גם כתאים משילים את ביופילם נוטים לגדול במקבצים בתחתית הבאר. כל בועות בתוך הבאר תפרענה מאוד עם קריאות OD 600 ו יש להימנע או להסיר לפני לקרוא. </li></ol>

<ol><li>Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+insights+from+biofilm+biology+to+drug+development+-+can+a+new+approach+be+developed%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Applying insights from biofilm biology to drug development - can a new approach be developed.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 791-808 (2013).</li>
<li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prosthesis+infections+after+orthopedic+joint+replacement%3A+the+possible+role+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Orthop+Rev+%28Pavia%29%22%5BJournal%5D)">Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms.</a> Orthop Rev (Pavia). 5, 65-71 (2013).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases).</a> Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).</li>
<li>Bordi, C., de Bentzmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hacking+into+bacterial+biofilms%3A+a+new+therapeutic+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intensive+Care%22%5BJournal%5D)">Hacking into bacterial biofilms: a new therapeutic challenge.</a> Ann Intensive Care. 1, 19(2011).</li>
<li>Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+laboratory+reference+strains+mirror+%27real-world%27+pathogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Can laboratory reference strains mirror 'real-world' pathogenesis?</a> Trends Microbiol. 13, 58-63 (2005).</li>
<li>Kwasny, S. M., Opperman, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Static+biofilm+cultures+of+Gram-positive+pathogens+grown+in+a+microtiter+format+used+for+anti-biofilm+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Static biofilm cultures of Gram-positive pathogens grown in a microtiter format used for anti-biofilm drug discovery.</a> Curr Protoc Pharmacol. Chapter 13, Unit 13A 18(2010).</li>
<li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MBEC+Assay+System%3A+multiple+equivalent+biofilms+for+antibiotic+and+biocide+susceptibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The MBEC Assay System: multiple equivalent biofilms for antibiotic and biocide susceptibility testing.</a> Methods Enzymol. 337, 377-385 (2001).</li>
<li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Calgary+Biofilm+Device%3A+new+technology+for+rapid+determination+of+antibiotic+susceptibilities+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clinical+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms.</a> J Clinical Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).</li>
<li>Baker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+stress+induces+a+global+stress+response+in+Staphylococcus+aureus+and+represses+sae+and+agr+expression+and+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Copper stress induces a global stress response in Staphylococcus aureus and represses sae and agr expression and biofilm formation.</a> Appl Environ Microbiol. 76, 150-160 (2010).</li>
<li>Haeili, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+complexation+screen+reveals+compounds+with+potent+antibiotic+properties+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Copper complexation screen reveals compounds with potent antibiotic properties against methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58, 3727-3736 (2014).</li>
<li>O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+Alamar+Blue+%28resazurin%29+fluorescent+dye+for+the+assessment+of+mammalian+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity.</a> Eur J Biochem. 267, 5421-5426 (2000).</li>
<li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+the+minimal+bactericidal+concentration+of+an+antimicrobial+agent+for+planktonic+cells+%28MBC-P%29+and+biofilm+cells+%28MBC-B%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (MBC-P) and biofilm cells (MBC-B).</a> J Vis Exp. (83), e50854(2014).</li>
<li>Junker, L. M., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screens+for+small-molecule+inhibitors+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).</li>
<li>Shah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persisters%3A+a+distinct+physiological+state+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Persisters: a distinct physiological state of E. coli.</a> BMC Microbiol. 6, 53(2006).</li>
<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riddle+of+biofilm+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Riddle of biofilm resistance.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45, 999-1007 (2001).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הנה, יש לנו תארנו assay biofilm שונה לקביעת פעילות של מעכבים נבדקו על S. biofilms aureus התמקדות מצב מטבולי של תאים הקשורים ביופילם. בעוד נהלים אתגר וייזום ביופילם תיאר בעיקר המלצות היצרן חיקה, השימוש resazurin לצבוע לזהות ולכמת תאים הקשורים biofilm ששורדים אתגר 24 שעות מעכב באופן דרמטי מפשט את הנוהל המומלץ של התאוששות התא (דרך sonification באמבט מים) ו ספירה עוקבות תאי קיימא של דרך ספירת CFUs. הליך יצרן מומלץ זה כרוך לפחות 5 שלבי מניפולציה נוספים, כל אחד מהם לשג...

חיידקים פתוגניים יכולים ליצור biofilms in vivo מוביל לזיהומים כרוניים שאינם חריפים 1. הזיהום הקשורים biofilm הוא גורם סיכון רציני של פרוצדורות רפואיות שכוללות השתלה של גופים זרים (למשל, מחליף עצם מלאכותי, שתלים בחזה) או באמצעות ההתקנה של צינורות לקנה נשימה או צנתרי שתן 2. בהקשרים אלה, טיפול אנטי זיהומיות הוא כמעט תמיד הכרחי כמו זיהומים מבוססים ביופילם נמחקים לעתים רחוקות בכוחות עצמם, אפילו אצל אנשים עם מערכת חיסון תקינים. Staphylococcus aureus הוא אחד מגורמי המחלה העיר לעתים הקרוב ביותר המעורבים סיבוכים הקשורים biofilm המתרחשים במהלך השימוש 3 מכשירים רפואיים פולשניים. למרבה הצער, טבעו של biofilms כמחסום מגן שהופך אותם עמיד יותר לטיפול מאשר תאי planktonic 1,4, וההערכה של יעילות קלינית חזה היא חלק קריטי של השני ראשוניפיתוח תרופות כמו גם מעקב עמידות לתרופות. יש הכרה גוברת כי בתנאי מעבדה, מתמקדים תרבויות planktonic, לא יכולים לייצג נאמן בעולם האמיתי מחלה 5. עוד הרכבה את הבעיה, השכפול של פנוטיפים biofilm קשה, ומודלים ביופילם קיימים הם מייגעים סובלים הבנת גבוה ולהבדלי תוך assay 6. לכן, חוקרים רבים, דרך צורך, כברירת מחדל מבחני תא planktonic רגישות תרופה, ובכך באופן פוטנציאלי הזנחת היבט חשוב של ארסיויות חיידקים ומחלות. כאן אנו מתארים את הפרוטוקול לחיידקי assaying, במיוחד ס aureus, ב biofilms טרום גדל ניצול 7,8 מערכת ביופילם מבוסס 96-היטב. בעוד הפרוטוקול להיווצרות ואתגר ביופילם כדלקמן בעצם המלצת היצרן, אנו מציגים מתודולוגיה מידע עשיר חלופית לכימות את הכדאיות של biofILM לאחר אתגר. בקצרה, חיידקים בתרבית צלחת היתד, שם biofilms להיוצר על היתדות הבולטות המצורפות את המכסה של הצלחת. לאחר ההיווצרות ביופילם, את היתדות הם טבלו בעדינות בבארות של צלחת טריה המלאה PBS להסיר תאי planktonic. PEG-מכסה, עם biofilms המצורפת, מועבר צלחת אתגר חדש, המכיל ריכוזים שונים של אנטיביוטיקה להיות assayed. לאחר דגירה שנייה, מכסה שוב מוסרים, שטף, והועברתי צלחת התאוששות המכילה resazurin לצבוע, שם הם עוברים דגירה סופית. מרת Resazurin ניתן להקליט kinetically או נלקחת קריאת הסיום לאחר תקופת החלמה מוגדרת. שיטת צבע מבוסס זה לכימות הכדאי של biofilms שונה באופן משמעותי מן (יחידות המושבה להרכיב) CFU המייגעים מתודולוגיה לספור מבוססת כמתואר בפרוטוקול המקורי 7. OD 600 מדידות של צלחת תרופת אתגר resazurin קינטיקה המר לשמש לקריאה כדאיתקטן של תאי planktonic ו biofilm, בהתאמה, המציע assay מהיר, אמין ועשיר במידע ופשוט טכני להישרדות ביופילם.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Mueller-Hinton Medium</td><td>Oxoid</td><td>CM0405</td><td>עקוב אחר המלצות היצרן</td></tr><tr><td>RPMI-medium</td><td>Corning&nbsp;</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>CRPMI</td><td>Ref 9</td><td></td><td>RPMI-1640 בינוני צ'לקס למשך שעה אחת עם שרף Chelex 100 ולאחר מכן הושלם עם 10% RPMI-1640 Chelex</td></tr><tr><td>100 Resin</td><td>Bio Rad</td><td>142-2822</td><td></td></tr><tr><td>MBEC-plates</td><td>Innovotech</td><td>19111</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin נתרן מלח</td><td>סיגמא</td><td>R7017</td><td>800 ומיקרו; גרם/מ"ל במי DI&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td></tr><tr><td>פלטפורמת טלטול מיקרו צלחת</td> סטרילית מסנן&nbsp;<td>Heidolph Titramax 1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytation 3 קורא צלחות</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 תוכנה</td><td>Biotek</td><td></td><td>הקלטה וניתוח של המרת רזזורין</td></tr><tr><td>Neocuproine</td><td>Sigma</td><td>N1501&nbsp;</td><td>להכין מלאי של 10 מ"מ באתנול 100%, לאחסן ב -80 &ordm; C</td></tr><tr><td>נחושת גופרתית</td><td>Acros Organics</td><td>7758-99-8</td><td>מכינים תמיסת מלאי של 100 מ"מ במים, מאחסנים ב -4 &ordm; C</td></tr><tr><td>Cu-neocuproine</td><td>תוצרת</td><td></td><td>עצמית נוצר על ידי ערבוב מולריות שוות של ניאוקופרואין ונחושת גופרתית. התערובת דוללה במדיום CRPMI לריכוז הרצוי.</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma</td><td>G3632-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

מיקוד associated biofilm<em&gt; staphylococcus aureus</em&gt; assay רגישות בסמים בהתבסס resazurin שימוש

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

רוב החיידקים הפתוגניים מסוגלים ליצור ביופילמים במהלך זיהום, אך בשל הקושי לתפעל ולהעריך ביופילמים, הרוב המכריע של עבודת המעבדה מתבצעת עם תאים פלנקטוניים. כאן, אנו מתארים בדיקת ביופילם של לוחית יתד כפי שבוצעה עם Staphylococcus aureus. ביופילמים חיידקיים גדלים על יתדות המחוברות למכסה צלחת מיקרוטיטר של 96 בארות, נשטפים דרך טבילה עדינה במאגר ומונחים בצלחת אתגר תרופות. לאחר הדגירה שלאחר מכן הם נשטפים שוב ומועברים לצלחת התאוששות סופית, בה הצבע הפלואורסצנטי רזזורין משמש כאינדיקטור כדאיות. בדיקה זו מציעה קלות שימוש, אמינות ושחזור מוגברות מאוד, כמו גם שפע של נתונים כאשר היא מתבצעת כקריאה קינטית. יתר על כן, ניתן להתאים בדיקה זו לגישת סינון תרופות בתפוקה בינונית שבאמצעותה נלקחת במקום זאת קריאה פלואורסצנטית של נקודת קצה, המציעה נתיב למאמצי גילוי תרופות.

את assay resazurin הוא רגיש מספיק כדי לזהות באופן אמין מאוד כמה תאי קיימא יכולת שכפול במדיום נקי מסמים לאחר אתגר. ב מתודולוגיה זו, נגדיר את הריכוז בביעור ביופילם המינימאלי כמו הריכוז הנמוך ביותר בה ללא מרת resazurin נתפסת בתוך 24 שעות. את assay resazurin מסתמך על מולקולות חמצונים נמצאות תאים פעילים מבחינה מטבולית אשר להמיר את הצבע לצבוע מכחול ורוד. המרה דאי הוא ובכך אינדיקטור של צמיחת תאים, וניתן לכמת באמצעות קורא צלחת מיקרו ניאון. במאמר זה, neocup...

רוב הזיהומים החיידקיים מייצרים ביופילם. מתוקף הסביבה שלהם, חיידקים הקשורים לביופילם הם לעתים קרובות עמידים לתרופות פנוטיפיות. מולקולות אנטיבקטריאליות חדשות שהורגות חיידקים בביופילמים נמצאות אפוא בעדיפות גבוהה. אנו מקימים בדיקה לסינון מהיר של תרכובות אנטי-מיקרוביאליות היעילות בהדברת ביופילמים.

מיקוד Associated Biofilm<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Assay רגישות בסמים בהתבסס Resazurin שימוש

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לגדל באופן פשוט וניתן לשחזור ביופילמים חיידקיים בפורמט של פלטת 96 בארות על פינים המחוברים למכסה, לצורך בדיקת רגישות לאנטיביוטיקה באמצעות צבע חיוניות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הגילוי והפיתוח של אנטיביוטיקה, על ידי בחינת פעילויות על תאים הקשורים לביופיلمين, המייצגים לרוב טוב יותר מצבים של זיהום in vivo. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת לאתגר בקלות ביופילמים שנוצרו מראש במערך בדיקה תלת-שלבי במצע, ולקבוע עיכוב באמצעות צבע חיוניות נפוץ.ראשית, גדלו תרבית של אורגניזם המייצר ביופילם במצע עשיר בחומרים מזינים. זרקו את זן ה-Staphylococcus aureus Newman מתוך גליצרין למערכת של 10 milliliters של מצע Muller-Hinton. בצעו את כל העבודה הכרוכה בטיפול ב-S.aureus עם כפפות ובתוך קבينة בטיחות ביולוגית.דגרו למשך 16 שעות ב-37 °C במנערה סיבובית. העבירו את נפח התרבית המחושב לפסולת צנטריפוגה, והשקיעו את התאים על ידי סבב של דקה אחת ב-10,000 Gs. להכנת תכשיר ההIsInoculum לביופילם, שאבו את מצע הגידול המשומש ותלו את משקע התאים ב-20 milliliters של CRPMI. באמצעות פיפט רב-ערוצי של 200 microliter, הוסיפו 125 microliters של תכשיר ה-inoculum ממאגר של 25 milliliter לכל באר בשורות A עד G של הפלטה התחתונה.מלאו 125 µL של מצע CRPMI סטרילי בכל באער בשורה H כביקורת סטריליות. קחו את מכסה הפינים והחזיקו אותו מעל תחתית הפלטה כאשר הפינים פונים כלפי מטה. יישרו בזהירות את הפינים הבודדים עם הבאערים התואמים להם.הימנעו ממגע פיזי בין הפלטה לבין הפינים. לאחר היישור, הורידו את המכסה בזהירות. אטמו את המכסה לפלטה באמצעות סרט פאראפין כדי למנוע התאיידות, והניחו אותה בתוך שקית פלסטיק ניתנת לאטימה, תוך כדי סגירה הדוקה.שמרו על נפח אוויר נמוך ככל האפשר בתוך השקית כדי למזער אידוי. דגרו את הפלטה ללא ניעור בטמפרטורה של 37 °C למשך 48 שעות, באינקובטור עם 5% Carbon Dioxide. ביום אתגר הביופילם, קחו פלטה חדשה של 96 בארות והוסיפו 100 µL של CRPMI, שהגיע לטמפרטורת החדר, לכל בארה בשורות B עד H. דללו עד ארבעה תרכובות בדיקה בנפרד, ב-1.0 mL של CRPMI, לריכוז סופי כפול (2x) מהריכוז הרצוי.הוסיפו 200 µL של תרכובת 1 לבארים A1-A3. הוסיפו 200 µL של תרכובת 2 לבארים A4-A6. הוסיפו 200 µL של תרכובת 3 לבארים A7-A9, ו-200 µL של תרכובת 4 לבארים A10-A12. בצעו דילול סדרתי של תרכובות הבדיקה באמצעות פיפט רב-ערוצי.התחילו בהעברה של 100 µL משורה A לשורה B, וערבבו. באופן זה, המשיכו להעביר 100 µL מבאר לבאר. ערבבו לאחר כל העברה, והפסיקו בשורה F. לאחר הערבוב, השליכו 100 µL משורה F לכלי פסולת.אין להעביר נוזל כלשהו לשורות G ו-H. לבסוף, הוסף 100 µL של CRPMI לכל באער בלוח באמצעות פיפט רב-ערוצי, כדי להביא את הנפח הסופי ל-200 µL. הוסף 200 µL של phosphate-buffered saline ללוח 96 באערים סטרילי וחדש, בעל באערים במידות זהיות לאלו של לוח ייזום הביופילם. לאחר מכן, הסר את שקיות הפלסטיק ואת סרט הפרפין מלוח ייזום הביופילם שעבר אינקובציה.הרמו את המכסה ישירות כלפי מעלה, תוך הימנעות ממגע בין הפינים לתחתית המגש, שכן הדבר עלול לפגוע בביופילם. שמרו את החלק התחתון לצורך ניתוח OD600 בהמשך. שטפו תאי פלנקטון על ידי הנחת מכסה הפינים על המגש המכיל PBS.טבול את הפינים למשך חמישה שניות. הרם אותם מתוך ה-PBS, וטבול אותם פעם נוספת, תוך הקפדה שלא להקיש עם הפינים בדפנות הבארים. הנח את מכסה הפינים השטוף לתוך לוח האתגר.הימנעו ממגע מיותר בין הפינים לבין תחתית הפלטה, שכן הדבר יפגע בביופילם ויוביל לתוצאות לא עקביות. אטמו את הפלטה באמצעות סרט פראפין, והניחו אותה בתוך שקית פלסטיק הניתנת לאטימה כפי שנעשה קודם לכן. דגרו את הפלטה, ללא ניעור, למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 °C, בתוך אינקובטור עם 5% Carbon Dioxide.העבירו את התחתית של פלטת ייזום הביופילם ותלו את החיידקים בכל באר באמצעות פיפט רב-ערוצי. מדדו את ה-OD600 באמצעות קורא מיקרו-פלטה מתאים, כדי לוודא שחלה צמיחה בכל הבארים למעט בבקרת הסטריליות בשורה H. השתמשו בקורא פלטות המצויד בתא דגירה ומסוגל לבצע קריאות פלואורסצנציה קינטיות לצורך זיהוי המרת רזאזורין (resazurin). הגדירו מדידת פלואורסצנציה קינטית למשך 24 שעות, תוך שימוש באורך גל עירור של 530 nanometer ואורך גל פליטה של 590 nanometer.הגדירו את טמפרטורת התא ל-37 °C, וקבעו קריאה של הפלטה בכל 20 דקות. הגדירו את קורא הפלטות למדידה מהחלק התחתון של הפלטה בהתאם להוראות היצרן. הכינו את הפלטה לשטיפה על ידי הוספה של 200 µL של PBS לכל באער בפלטה סטרילית בעלת 96 באערים באמצעות פיפט רב-ערוצי.לאחר מכן, הכין מצע להתאוששות ביופילם על ידי הוספת 400 µL של תמיסת מקור resazurin בריכוז 0.8 mg/mL ל-20 mL של מצע CRPMI, עד לריכוז סופי של 16 µg/mL של resazurin. לאחר מכן, הוסף 150 µL של מצע להתאוששות ביופילם לכל באר בלוח 96 באריים חדש באמצעות פיפט רב-ערוצי. העבר את לוח האתגר מהאינקובטור לקלחת בטיחות ביולוגית, והסר בזהירות את השקית פלסטיק ואת סרט האיטום.הסר את מכסה הפינים (peg lid) מלוח האתגר, ושטוף תאי פלנקטון ב-PBS כפי שנעשה קודם לכן, תוך שמירת תחתית לוח האתגר לצורך אנליזת OD600 בהמשך. לאחר השטיפה, הנח את מכסה הפינים לתוך תחתית הלוח המכילה את מדיום השחזור של הביופילם. עטוף את דפנות הלוח בסרט פאראפין, תוך הקפדה שלא לחסום את התחתית של בארות ההיקף.מיד לאחר עטיפת הפלטה, הנח אותה בקורא הפלטות והתחל קריאה קינטית לאורך תקופה של 24 שעות, על ידי הפעלת פרוטוקול הקינטיקה של ה-resazurin שהוגדר מראש. כדי לכמת את הצמיחה של תאים פלנקטוניים שעשויים או לא להיווצר במהלך האתגר, קרא את ה-OD600 של כל תחתית פלטת האתגר באמצעות קורא מיקרו-פלטות. מוצג כאן דוגמה למבנה של פלטת אתגר, המשתמשת בשני דילוולים מלאים כדי לתתר את ריכוזי התרכובות.ביופילמים גדוליים טופלו בנאוקופרואין (neocuproine) או בקומפלקס הנחושת שלו. קריאות OD600 של תחתית פלטת האתגר לאחר 24 שעות גילתה כי קומפלקס הנחושת של נאוקופרואין, אך לא נאוקופרואין לבדו, מנע שחרור וצמיחה עוקבת של תאים חיוניים מביופילמים שטופלו בריכוזים של 1.25 micromolar ומעלה. הביופילמים התואמים נבחנו לאחר מכן באמצעות בדיקת רזאזורין (resazurin assay).בדיקה חזותית לאחר 24 שעות מאפשרת קבלת תשובה מהירה של "כן" או "לא" כאשר מריצים מספר פלטות במקביל. Resazurin הופך לוורוד בבארים עם ביופילמים חיוניים, אך נשאר כחול כאשר הביופילם הושמד. קריאה קינטית של המרת resazurin יכולה לחשוף השפעות תלויות-ריכוז על חיוניות הביופילם, כפי שמוצג כאן עם gentamicin.העיכוב התלוי-ריכוז בתחילת המרת הצבע מעיד על ירידה בחיוניות הביופילם. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להימנע מההטבקה של הפינים (pegs) לדפנות הבארות.

targeting-biofilm-associated-staphylococcus-aureus-using-resazurin

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

בדיקות אבחון רגישות מיקרוביאלית הנוכחי מסתמך על צמיחה של planktonic מבודד ב מזין, עשיר תנאים אירוביים. כאן, אנו מעסיקים בינוני חלופה כיח מלאכותית ללמוד הרגישות מיקרוביאלית של Pseudomonas aeruginosa biofilms תחת שני תנאים אירוביים ו microaerophilic נציג נוסף של הריאה סיסטיק פיברוזיס.

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

מקור: בוכר, ט. ואחרים. שיטות לחקר ביופילמים של B. subtilis כמודל לאפיון מעכבי ביופילם של מולקולות קטנות. J. Vis. Exp. (2016).הסרטון הזה מדגים כיצד שלמות מטריצת הביופילם משפיעה על עמידות חיידקים לאתנול על ידי השוואת יחידות יוצרות מושבות בביופילמים לא מטופלים ומופרעים על ידי מעכבים. הפחתת CFU בדגימות שטופלו במעכבים מראה כי מטריצת החוץ-תאית חיונית להגנה על תאים מוטמעים בביופילם מפני לחץ אנטימיקרוביאלי.

בדיקת עמידות לאתנול להערכת שלמות מטריצת הביופילם

מקור: ז'אנג, מ. ואח', בדיקת רגישות אנטימיקרוביאלית מהירה באמצעות הדמיית פיזור ראמן מגורה של שילוב דויטריום בחיידק יחיד. J. Vis. Exp. (2022)הסרטון הזה מדגים את השימוש במיקרוסקופ פיזור רמאן המגרה להערכת רגישות לאנטיביוטיקה על ידי מעקב אחר פעילות מטבולית מסומנת בדויטריום. על ידי ניטור אותות פחמן-דויטריום, השיטה מאפשרת זיהוי מהיר של אוכלוסיות חיידקים עמידות ורגישות.

זיהוי רגישות לאנטיביוטיקה חיידקית באמצעות מיקרוסקופ פיזור ראמן מגורה

סרטון זה מדגים בדיקה לסינון תרכובות אנטי-מיקרוביאליות שמחסלות ביעילות ביופילמים באמצעות לוחית יתד. המתודולוגיה מנטרת את המצב המטבולי של הביופילם לאחר הטיפול בתרכובות מיקרוביאליות, מה שמקל על קביעת ריכוז מיגור הביופילם המינימלי.

בדיקת ביופילם של צלחת יתד להקרנת חומרים אנטיבקטריאליים

biosensors phage ממוסס וחרוזים נוגדנים מסוגלים להבחין בין Methicillin עמיד (MRSA) וחיידקים סטפילוקוקוס רגישים. לפאגים היו משותקים על ידי שיטת אנגמיור-Blodgett על גבי משטח של חיישן microbalance גביש קוורץ ועבדו כבדיקות סטפילוקוקוס מגוון רחבות. חרוזים נוגדנים לזהות MRSA.

Biosensor לאיתור של חיידקי סטפילוקוקוס עמידים לאנטיביוטיקה

זיהומי ביופילם מראים סבילות גבוהה לכימותרפיה. אין בדיקה אחת שתופסת את המורכבות של ביופילמים. במקום זאת, יש צורך בבדיקות משלימות. אנו מציגים פלטפורמת סינון (שפותחה עבור S. aureus) המשלבת מבחני כדאיות, ביומסה ומטריצת ביופילם. זה מאפשר גילוי תרופות אנטי-ביופילם, כולל הערכה של השפעות כימותרפיות ארוכות טווח.

פלטפורמה של מבחנים אנטי biofilm המתאים לחקירת ספריות תרכובת טבעיות

פרוטוקול זה נועד לתאר כיצד לחקור את היקף הפנמת Staphylococcus aureus ואת יכולתה לשרוד בתוך התא המארח האנושי, כמו גם את היעילות התאית של תרכובות מיקרוביאלית.

שיפור הגנה מפני אנזימים כדי לחקור הפנמת Staphylococcus aureus ויעילות תאית של תרכובות מיקרוביאלית

מתודולוגיה זו מאפשרת הקמת מודל ביופילם פולימיקרוביאלי בסיסטיק פיברוזיס לבדיקת רגישות מיקרוביאלית במעבדות מחקר וקליניות. מודל זה מספק תוצאות מדויקות ואמינות על פני מגוון תפוקות.

פיתוח מודל ביופילם של מושבה פולימיקרוביאלית לבדיקת אנטי-מיקרוביאלים בסיסטיק פיברוזיס

Assay מתאר אמצעי מהיר למדוד היווצרות biofilm מוקדם חיידקים ופטריות. שיטה זו משתמשת צלחת microtiter כמו לתשתית להיווצרות חיידקים biofilm ו biofilm היא דמיינו באמצעות סגול זן קריסטל. Assay מספק גם assay איכותי או כמותי ליצירת biofilm מוקדם.

Biofilm microtiter תבשיל גיבוש Assay

הפרוטוקולים של ניצול לפתוח זרימת biofilms מערכת עם כורים זרימה טפטוף וסיבוב כורים דיסק מוצגים בפירוט.

השימוש זרימה טפטוף ו כורים דיסק סיבוב עבור Staphylococcus aureus Biofilm ניתוח

למדו שיטה לגידול ביופילמים חיידקיים בפורמט צלחת 96-באריות לבדיקת רגישות לאנטיביוטיקה באמצעות צביעת חיות. השיטה מאפשרת הערכת תרכובות אנטי-מיקרוביאליות נגד Staphylococcus aureus בביופילמים.

מיקוד Associated Biofilm

גלה סרטונים נוספים