מיקוד Associated Biofilm Staphylococcus aureus Assay רגישות בסמים בהתבסס Resazurin שימוש

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגדל בקלות ובשחזור סרטי ביו חיידקים בפורמט צלחת של 96 בארות על יתדות מחוברות למכסה לבדיקת רגישות לאנטיביוטיקה באמצעות צבע כדאיות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הגילוי והפיתוח של אנטיביוטיקה על ידי חקר פעילויות על תאים הקשורים לביופילם שלעתים קרובות מייצגים יותר מצבי זיהום invivo. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לאתגר בקלות ביופילמים מוכנים מראש בבדיקה בינונית בת שלושה חלקים ולקבוע עיכוב באמצעות צבע כדאיות נפוץ.

כדי להתחיל, גדל תרבית של אורגניזם המייצר ביופילם במדיום עשיר בחומרים מזינים. חסנו את זן הסטפילוקוקוס הזהוב ניומן מגבעול גליצרול ב-10 מיליליטר של מדיום מולר-הינטון. בצע את כל העבודות הכרוכות בטיפול ב-S.aureus עם כפפות, ובתוך ארון בטיחות ביולוגית.

דגירה למשך 16 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס על שייקר סיבובי. הוסף את נפח התרבית המחושב לצינור צנטריפוגה, ותאי גלולה על ידי סיבוב במשך דקה אחת ב-10,000 Gs.To להכין את חיסון הביופילם, לשאוב את מצע הגידול המושקע ולהשעות מחדש את גלולת התא ב-20 מיליליטר של CRPMI. בעזרת פיפטה רב-ערוצית בנפח 200 מיקרוליטר, הוסף 125 מיקרוליטר חיסון ממאגר של 25 מיליליטר לכל באר שורות A עד G של הצלחת התחתונה.

מלאו 125 מיקרוליטר של מדיום CRPMI סטרילי בכל באר בשורה H כבקרת סטריליות. קח את מכסה היתד והחזק אותו מעל תחתית הצלחת כשהיתדות פונות כלפי מטה. יישר בזהירות את יתדות הבודדות עם הבארות שלהן.

הימנע ממגע פיזי בין הצלחת ליתדות. לאחר היישור, הורד את המכסה בזהירות כלפי מטה. אטמו את המכסה לצלחת עם סרט פרפין כדי למנוע אידוי, והניחו אותו בשקית ניילון הניתנת לאיטום, ואוטמים היטב.

שמור על נפח האוויר בשקית נמוך ככל האפשר כדי למזער את האידוי. דגרו את הצלחת מבלי לרעוד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות, בחממת פחמן דו חמצני של 5%. ביום אתגר הביופילם, קחו צלחת טרייה של 96 בארות והוסיפו 100 מיקרוליטר של CRPMI, מאוזנים לטמפרטורת החדר, לכל באר של שורות B עד H. דללו עד ארבע תרכובות בדיקה בנפרד, ב-1.0 מיליליטר של CRPMI, עד פי 2 מהריכוז הסופי הרצוי.

הוסף 200 מיקרוליטר של תרכובת 1 בבארות A1-A3.200 מיקרוליטר של תרכובת 2 בבארות A4-A6.200 מיקרוליטר של תרכובת 3 בבארות A7-A9. ו -200 מיקרוליטר של תרכובת 4 בבארות A10-A12. לדלל באופן סדרתי את תרכובות הבדיקה באמצעות פיפטה רב ערוצית.

התחל בהעברת 100 מיקרוליטר משורה A לשורה B, וערבב. באופן זה, המשך להעביר 100 מיקרוליטר מבאר לבאר. מערבבים לאחר כל העברה, ועוצרים בשורה F.לאחר הערבוב, מוציאים 100 מיקרוליטר משורה F למיכל פסולת.

אין להעביר נוזל לשורות G ו-H.לבסוף, הוסף 100 מיקרוליטר CRPMI לכל באר של הצלחת באמצעות פיפטה רב ערוצית, כדי להביא את הנפח הסופי ל-200 מיקרוליטר. הוסף 200 מיקרוליטר של מי מלח עם חוצץ פוספט לצלחת טרייה, סטרילית, עם 96 בארות הכוללת בארות במידות זהות לאלה של לוחית ההתחלה של הביופילם. לאחר מכן, הסר את שקית הניילון וסרט הפרפין מצלחת התחלת הביופילם המודגרת.

הרם את המכסה ישר כלפי מעלה, הימנע ממגע בין היתדות לתחתית הצלחת, מכיוון שהדבר עלול לגרום נזק לביופילם. שמור את החלק התחתון לניתוח OD600 הבא. שטפו את תאי הפלנקטון על ידי הנחת מכסה היתד על הצלחת המכילה PBS.

טבלו יתדות למשך חמש שניות. הרם אותם מה-PBS, וטבל פעם נוספת, היזהר לא לפגוע ביתדות בדפנות הבאר. הנח את מכסה היתד השטוף בצלחת האתגר.

הימנע ממגע מיותר בין יתדות לצלחת התחתונה, מכיוון שהדבר יפגע בביופילם, מה שיוביל לתוצאות לא עקביות. אוטמים את הצלחת בניילון פרפין, ומניחים בשקית ניילון הניתנת לאיטום כמו קודם. דגרו את הצלחת, ללא טלטול, למשך 24 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס, בחממת פחמן דו חמצני של 5%.

קח את החלק התחתון של לוחית ההתחלה של הביופילם ותלה מחדש את החיידקים בכל באר באמצעות פיפטה רב-ערוצית. מדוד את ה-OD600 עם קורא מיקרו-פלטות מתאים, כדי לאשר צמיחה המתרחשת בכל הבארות אך בקרות הסטריליות בשורה H.השתמש בקורא צלחות המצויד בתא דגירה ומסוגל לבצע קריאות פלואורסצנטיות קינטיות לזיהוי המרת רזזורין. הגדר מדידת פלואורסצנציה קינטית של 24 שעות באמצעות עירור של 530 ננומטר ופליטה של 590 ננומטר.

הגדר את טמפרטורת החדר ל-37 מעלות צלזיוס, וקרא את הצלחת כל 20 דקות. הגדר את קורא הצלחות למדידה מתחתית הצלחת בהתאם להוראות היצרן. התכוננו לשטוף את הצלחת על ידי הוספת 200 מיקרוליטר PBS לכל באר של צלחת סטרילית של 96 בארות עם פיפטה רב ערוצית.

לאחר מכן, הכינו מדיום התאוששות ביופילם, על ידי הוספת 400 מיקרוליטר של 0.8 מיליגרם למיליליטר תמיסת מלאי רזזורין ל-20 מיליליטר של מדיום CRPMI, לריכוז סופי של 16 מיקרוגרם למיליליטר רזזורין. לאחר מכן, הוסף 150 מיקרוליטר של מדיום התאוששות ביופילם עם פיפטה רב-ערוצית, לכל באר של צלחת טרייה של 96 בארות. העבירו את לוחית האתגר מהחממה לארון ביו-בטיחות, והסירו בזהירות את שקית הניילון וסרט האיטום.

הסר את מכסה היתד מלוח האתגר, ושטוף תאי פלנקטון ב-PBS כמו קודם, תוך שמירה על החלק התחתון של לוחית האתגר לניתוח OD600 לאחר מכן. לאחר השטיפה, הנח את מכסה היתד בתחתית הצלחת המכילה את מדיום השחזור של הביופילם. עטפו את צד הצלחת בסרט פרפין, והקפידו לא לחסום את תחתית הבארות ההיקפיות.

מיד לאחר עטיפת הצלחת, הנח אותה על קורא הצלחות והתחל קריאה קינטית במשך תקופה של 24 שעות, על ידי התחלת פרוטוקול רזזורין-קינטי שנעשה קודם לכן. כדי לכמת צמיחה של תאים פלנקטוניים שעשויים להתרחש או לא להתרחש במהלך האתגר, קרא את ה-OD600 של כל תחתית לוחית האתגר באמצעות קורא מיקרו-לוחות. מוצגת כאן פריסה לדוגמה של לוחית אתגר, המשתמשת בשני דילולים מלאים כדי לטטר ריכוזי תרכובות.

ביופילמים שגודלו טופלו בניאוקופרואין, או קומפלקס הנחושת שלו. קריאות OD600 של תחתית לוחית האתגר לאחר 24 שעות גילו כי קומפלקס הנחושת הניאוקופרואין, אך לא ניאוקופרואין בלבד, מנע נשירה וצמיחה לאחר מכן של תאים ברי קיימא מביופילמים מטופלים בריכוזים של 1.25 מיקרומולר ומעלה. הביופילמים המתאימים נבדקו לאחר מכן על ידי בדיקת רזזורין.

בדיקה ויזואלית לאחר 24 שעות מאפשרת תשובה מהירה, כן-לא אם מספר לוחיות מופעלות במקביל. רזזורין הופך לוורוד בבארות עם ביופילמים ברי קיימא, אך נשאר כחול כאשר הביופילם הוכחד. קריאה קינטית של המרת רזזורין יכולה לחשוף השפעות תלויות ריכוז על כדאיות הביופילם, כפי שמוצג כאן עם גנטמיצין.

העיכוב התלוי בריכוז בתחילת המרת הצבע, מעיד על ירידה בכדאיות של הביופילם. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לא להיתקל את היתדות בצד הבארות.