Name: ניתוח Clinicopathological ביטוי מירנה שד רקמות סרטן על ידי שימוש מירנה באתרו כלאה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: למד זיהוי ביטוי miRNA ברקמות סרטן שד באמצעות הכלאה באתרו. שיטה זו מאפשרת איתור מיקום מדויק של מיקרו-RNA בתאים ותורמת להבנת תפקידם בפתולוגיה הסרטנית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק ה-NIH (5R01 CA178386-03) ומענק USC ASPIRE-1 ל-HC. ברצוננו להודות ל-Vrushab Gowda על עזרתו בכתבי היד.

מחקר זה אושר על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדית של בית החולים האוניברסיטאי הלאומי Chonnam הוואסון ואונ&#39; הדרום קרוליינה. דגימות TMA מורכבות סרטן שד רקמות שד נורמלים סמוכות מתאימות נמסרו על ידי Biobank של חולי הוואסון אונ&#39; הלאומיים Chonnam, חבר ברשת Biobank קוריאה. 1. פתרון כנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 1 ליטר מים חינם DNase ו RNase. הפוך את כל תמיסות כימיות באמצעות diethylpyrocarbonate (DEPC) מים מטופלים. פנקו 1 ליטר מים עם 500 μl של DEPC דגירה במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר. חיטוי המים כדי להשבית DEPC. זהירות: אין לשאוף DEPC מאחר וידוע מסרטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן PBS 1x מ 10x PBS באמצעות מים מטופלים DEPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 20x SSC (לפזר 175.3 גרם של NaCl ו 88.2 גרם של נתרן ציטראט ב 800 מ&quot;ל מים, להתאים את ה- pH ל 7.0 עם ירידה כמה 14 N פתרון של HCl ולהתאים את עוצמת הקול עד 1 ליטר עם וואטאה), 4% paraformaldehyde, 95% אתנול, 80% אתנול באמצעות מים מטופלים DEPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 8 מ&quot;ל של triethanolamine ו -1.05 מ&quot;ל של HCl ב 590 מ&quot;ל מים DEPC שטופלו ולהוסיף 1.5 מ&quot;ל של אנהידריד אצטית עבור acetylation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מיקרוגרם / μl proteinase K במאגר (50 mM Tris-HCl, pH 8.0 ב DEPC מים מטופלים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ הכלאה מורכב 500 μl של לפוראמיד, 250 μl של 20x SSC, 100 μl של 50x פתרון של Denhardt, 12.5 μl של t-RNA, 2.5 μl של ה- DNA זרע הרינג, 30 μl של RVC, 0.02 גרם של מגיב חסימת 50 μl מי DEPC. כן טרי. </li></ol> 2. סעיפי רקמות שד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכי 5 מיקרומטר קבוע פורמלין חלקי פרפין מוטבע עם microtome ולהחיל את הסעיף לחייב שקופית 14. הערה: רקמת השד משמש כאן הוכנה בעבר מרשת Biobank קוריאה. </li></ol> 3. רקמות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פרפין הלוך ושובמ הרקמה ידי טבילה שקופיות לתוך 2x צנצנת Coplin קסילן טרי במשך 10 דקות כל אחד ו רעננותם קטע רקמה על ידי 5 incubations דקות בהפחתת ריכוזי אתנול (100%, 95% ו -80%) ב DDH 2 O. בצע פעולה זו במנדף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את רקמת DEPC מי מטופלים במשך 5 דקות. בשלב זה יש לבצע גבולות סביב קטע רקמה עם עט מחסום הידרופובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקן את הרקמה עם 4% PFA במשך 15 דקות ואחריו לשטוף עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הרקמה ב 0.3% Triton X-100 / PBS במשך 10 דקות ואחריו לשטוף עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המדגם עם 50 מיקרוגרם / פתרון μl proteinase K עבור 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. ואז דגירה סעיפים רקמה עם triethanolamine ו אנהידריד אצטית עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו לשטוף עם PBS. אין לשטוף PBS נדרשת בין טיפול proteinase K ו triethanolamine / טיפול אנהידריד אצטית. </li></ol> הכלאה 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הרקמה ביסודיות incuבייט בסעיף רקמות עם חיץ הכלאה ל -2 עד 3 שעות בטמפרטורת החדר. בדרך כלל 120 חיץ הכלאה μl הוא מספיק כדי לכסות את קטע רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 5&#39;-DIG שכותרתו בדיקה LNA כדי הריכוז הסופי של 3 PM ב 120 פתרון הכלאה μl. ככל ריכוז המניות בדרך כלל הוא 40 ng / μl, להוסיף 3 μl של המניה ל -120 μl חיץ הכלאה ו דגירה התערובת על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטע רקמת דגירה עם הלילה חללי על 54 מעלות צלזיוס (Tm) בתא לח. בדרך כלל 120 μl הוא מספיק כדי לכסות חלק אחד. צור לחות באמצעות שתי מגבות נייר רטובות. הגודל האידיאלי של החדר הוא 10 אינץ &#39;על 8 אינץ&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה:&#39;אני עשוי להיות שונה עבור מירנה שונה. 54 ° C הוא אזכורים עבור miR-489. </li></ol> 5. חומרא Wash <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הרקמה עם 5x SSC עבור 7 דקות (לאחר שלב הכלאה, תנאים חינם RNase אינם נחוצים עוד?). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השנינות קטע רקמהh 1x SSC עבור 7 דקות פעמיים ב 57 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את קטע רקמה עם SSC 0.2X עבור 7 דקות ב 57 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את קטע רקמה עם SSC 0.2X עבור 7 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטע רקמה מדגירים PBS במשך 10 דקות. </li></ol> 6. חסימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה קטע רקמה עם חסימת חיץ בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 בתא לח (כדי להפוך חיץ חסימת להוסיף 2 FBS מ&quot;ל, 10 μl של Tween-20 ו -3 μl של BSA ב -18 מ &#39;של PBS. חסימת חנות חיץ ב 4 מעלות צלזיוס). </li></ol> 7. דגירה נוגדן ראשוני ופיתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 1: 300 נוגדן אנטי DIG-AP בחסימת מאגר דגירת קטע הרקמה עם נוגדן ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את החלקים עם חיץ לשטוף 3 פעמים, במשך 5 דקות כל אחד (חיץ שמספק ערכת פיתוח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח את קטע הרקמה עם ערכה מסחרית עבור phosphatase אלקליין שמייצר אור פלורסנט CY-3. </li> &lt;li&gt; שטף את החלק עם חיץ לשטוף למשך 5 דקות. סעיף הכתם עם 100 μl של 2.5 ng / לצבוע Hoechst μl במשך 5 דקות ואחריו לשטוף 5 דקות עם חיץ לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר הקטע עם הרכבת חיץ על פי הפרוטוקול של היצרן. השתמש 15 μl לכל קטע רקמה ולנגב פתרון הרכבה מוגזם עם רקמת לנגב. חותם את השקופית עם לק ברור למנוע דולף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו מיקרוסקופ פלורסנט סעיף משתמש עם 10X עדשה כך שסך כל ההגדלה היא 100X. </li></ol>

<ol><li>Shah, N. R., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+pathogenesis+of+breast+cancer%3A+Implications+in+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis and treatment.</a> World J Clin Oncol. 5, 48-60 (2014).</li>
<li>Tang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-185+suppresses+tumor+proliferation+by+directly+targeting+E2F6+and+DNMT1+and+indirectly+upregulating+BRCA1+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">miR-185 suppresses tumor proliferation by directly targeting E2F6 and DNMT1 and indirectly upregulating BRCA1 in triple-negative breast cancer.</a> Mol Cancer Ther. 13, 3185-3197 (2014).</li>
<li>Ye, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+silencing+of+miR-375+induces+trastuzumab+resistance+in+HER2-positive+breast+cancer+by+targeting+IGF1R%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Epigenetic silencing of miR-375 induces trastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer by targeting IGF1R.</a> BMC Cancer. 14, 134(2014).</li>
<li>Oneyama, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-mediated+downregulation+of+mTOR%2FFGFR3+controls+tumor+growth+induced+by+Src-related+oncogenic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-mediated downregulation of mTOR/FGFR3 controls tumor growth induced by Src-related oncogenic pathways.</a> Oncogene. 30, 3489-3501 (2011).</li>
<li>McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+breast+cancer%3A+the+potential+of+miRNA+for+diagnosis+and+treatment+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring.</a> Cancer Metastasis Rev. 34, 145-155 (2015).</li>
<li>Quesne, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+prognostic+associations+of+miR-205+and+let-7b+in+breast+cancer+revealed+by+in+situ+hybridization+analysis+of+micro-RNA+expression+in+arrays+of+archival+tumour+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Biological and prognostic associations of miR-205 and let-7b in breast cancer revealed by in situ hybridization analysis of micro-RNA expression in arrays of archival tumour tissue.</a> J Pathol. 227, 306-314 (2012).</li>
<li>Fernandez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-340+inhibits+tumor+cell+proliferation+and+induces+apoptosis+by+targeting+multiple+negative+regulators+of+p27+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">miR-340 inhibits tumor cell proliferation and induces apoptosis by targeting multiple negative regulators of p27 in non-small cell lung cancer.</a> Oncogene. 34, 3240-3250 (2015).</li>
<li>Yu, L., Zhang, J., Guo, X., Li, Z., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-224+upregulation+and+AKT+activation+synergistically+predict+poor+prognosis+in+patients+with+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-224 upregulation and AKT activation synergistically predict poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Epidemiol. 38, 408-413 (2014).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-146+up-regulation+predicts+the+prognosis+of+non-small+cell+lung+cancer+by+miRNA+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">microRNA-146 up-regulation predicts the prognosis of non-small cell lung cancer by miRNA in situ hybridization.</a> Exp Mol Pathol. 96, 195-199 (2014).</li>
<li>Kriegel, A. J., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+in+situ+hybridization+for+formalin+fixed+kidney+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">MicroRNA in situ hybridization for formalin fixed kidney tissues.</a> J Vis Exp. , e50785(2013).</li>
<li>Ucar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-212+and+miR-132+are+required+for+epithelial+stromal+interactions+necessary+for+mouse+mammary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">miR-212 and miR-132 are required for epithelial stromal interactions necessary for mouse mammary gland development.</a> Nat Genet. 42, 1101-1108 (2010).</li>
<li>Nuovo, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+microRNAs+in+paraffin+embedded%2C+formalin+fixed+tissues+and+the+co-localization+of+their+putative+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">In situ detection of microRNAs in paraffin embedded, formalin fixed tissues and the co-localization of their putative targets.</a> Methods. 52, 307-315 (2010).</li>
<li>Kierzek, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+locked+nucleic+acid+residues+on+the+thermodynamic+properties+of+2%27-O-methyl+RNA%2FRNA+heteroduplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The influence of locked nucleic acid residues on the thermodynamic properties of 2'-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes.</a> Nucleic Acids Res. 33, 5082-5093 (2005).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+embedding+tissue+samples+for+sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Paraffin embedding tissue samples for sectioning.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+expression+of+miR-182+and+miR-503+cooperatively+targets+FBXW7%2C+contributing+to+the+malignant+transformation+of+colon+adenoma+to+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Sequential expression of miR-182 and miR-503 cooperatively targets FBXW7, contributing to the malignant transformation of colon adenoma to adenocarcinoma.</a> J Pathol. 234, 488-501 (2014).</li>
</ol>

אין מה לחשוף.

מטרת המחקר הנוכחי הייתה לקבוע את רמת הביטוי מירנה ברקמות סרטן השד באמצעות מירנה הכלאה באתרה. יש לציין כי בניסוי זה, כל התנאים היו אופטימיזציה עבור רקמת סרטן השד. אופטימיזציה נוספת עשויה להידרש סוגי רקמות אחרות. כל הפתרונות חייב להיעשות עם מים DEPC וכל מכולות לשמש יש לשטוף עם מים מטופלים DEPC ובהמשך autoclaved. אפילו קל זיהום RNase יכול להפריע את התוצאה הסופית של הניסוי. כפי מירנה הוא רצף קצר מאוד, יש צורך להשתמש חללית LNA כדי להקל הכלאה טובה יותר עם המטרה. יתר על כן, לאחר...

סרטן השד הוא בין סוגי הסרטן הנפוצים ביותר המשפיעים על האוכלוסייה הנשית על פני הגלובוס. יותר מ -1.3 מיליון מקרים של סרטן השד מדווחים מדי שנה ברחבי עולם 1,2. למרות תאים סרטניים נחשבו באופן מסורתי כמו ביולוגית הומוגנית מאוד שגשוג, זה הפך להיות ברור כי סרטן השד הוא גנטי קליני הטרוגנית. עמידות לתרופות אנטי סרטניות רווחות היא סימן היכר של סרטן השד מתקדם, שמובילה את התמותה ברוב המכריע של מטופלים באמצעות הסיוע של גרורות מרחק התקדמות וסרטן 3. מיקרו RNA (miRNAs) הם קבוצה של מולקולות RNA קטנות כ 22 נוקליאוטידים המווסתים ביטוי גנים על ידי חסימת תרגום mRNA או בתיווך mRNA השפלה 4. יותר מ -2,000 miRNAs השונה עד כה זוהה בבני אדם, אשר מקושרים מחל אנושיות 5. מערך הולך וגדל של מחקרים havהדואר הוכיח כי miRNAs יכול לתפקד כמו מוטציות מדכאי גידול ובדר&quot;כ dysregulated בגידולים 6. miRNAs מאוד להשפיע כל tumorigenesis העיקרי על ידי שליטה על הרגולטורים העיקריים של התקדמות מחזור התא, הזדקנות, אפופטוזיס autophagy, יחד עם אלה של תנועתיות תאים סרטניים, פלישה גרורה 7. ביטוי Aberrant מירנה נקשר גם עם השלכות קליניות כגון במה, בידול, הפרוגנוזה ואת תגובה לטיפול אדג&#39;ובנטי 8. בפרט, גדל ביטוי miR-146 הוא מתואם עם פרוגנוזה גרועה בחולי סרטן ריאות 9. מחקר אחר הראה כי ביטוי אבוד של מירנה-let7b קשור פנוטיפים ממאירים, וכתוצאה מכך, 6 הישרדות עניה. הבנת הסוגים של תאים ומבנים מבטאים miRNAs היא חלק חשוב להבין את המכניקה שדרכו שינויים בתא השפעת ביטוי מירנהרקמת פנוטיפים 10. miRNAs מסוים מצא להיות מופרשים בתאי סטרומה נלקח על ידי תאי אפיתל ולפעול עליהם במיוחד את המטרות שלהם. באותה רוח, miR-212 ומיר-132 מופרשים על ידי stroma ולהסדיר את אינטראקציות סטרומה אפיתל הנדרשים תולדה ductal במהלך התפתחות בלוטת החלב 11. המטרה הכללית של מאמר זה היא להסביר פרוטוקול מפורט לזהות ביטוי מירנה ברקמות סרטן השד באמצעות מירנה הכלאה באתרה. יש לנו אופטימיזציה כל התנאים כדי assay את רמות ביטוי מירנה-489 בדגימות חולות סרטן השד. לשם כך, השתמשנו DIG שכותרתו נעול חומצות גרעין (LNA) בדיקה בניסוי שלנו. חלק נוקלאוטידים המקורי היה שינוי LNA, כלומר, גשר מתילן חיבור &#39;אטום חמצן 4&#39; 2 אטום פחמן של עמוד השדרה ריבוז שמתקן נוקלאוטיד כזה שהוא נשאר &quot;נעול במקום&quot; לאחר כלאה. כתוצאה מכך, זה הרבה יותר קשהעבור מתחם ההכלאה לפגל 12,13.

<table><tbody><tr><td>ELF-97</td><td>טכנולוגיית חיים&nbsp;</td><td>E6604</td><td></td></tr><tr><td>50x Denhard't&nbsp;</td><td>טכנולוגיית חיים&nbsp;</td><td></td><td></td>750018</tr><tr><td>t-RNA</td><td>רוש</td><td>109541</td><td>להרכיב מחדש במי DEPC</td></tr><tr><td>הרינג זרע DNA</td><td>פרומגה&nbsp;</td><td>D1815</td><td></td></tr><tr><td>חסימת רוש&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>RVC</td><td>Fisher</td><td>50-812-650</td><td>לפני השימוש סובב אותו ב-16.1 RCF וקח supernatant&nbsp;</td></tr><tr><td>בדיקה miR-489&nbsp;</td><td>Exiqon</td><td>38599-01</td><td></td></tr><tr><td>BSA Roche ללא נוקלאז</td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td>711454</tr><tr><td>נוגדן ראשוני-אנטי DIG</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>11093274910</tr><tr><td>דיאתיל פירוקרבונט&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>1609478</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח clinicopathological ביטוי מירנה שד רקמות סרטן על ידי שימוש מירנה<em&gt; באתרו</em&gt; כלאה

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לזיהוי miRNA ברקמת סרטן השד באמצעות הכלאה באתרה עם בדיקת LNA (חומצת גרעין נעולה) עם תווית דיגוקסיגנין. הגשושית זוהתה על ידי נוגדנים לפוספטאז אלקליין נגד DIG ופותחה מאוחר יותר באמצעות מצע פוספטאז אלקליין המייצר אותות פלואורסצנטיים. כאן השתמשנו בטכניקת miRNA in situ hybridization (MISH) כדי לנתח ביטוי של miR-489 ברקמות של חולות סרטן השד. טכניקה זו יכולה לזהות לוקליזציה של miRNA מעניין בדגימות רקמה בודדות. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי להשוות את הביטוי של miRNA רצוי ברקמת הגידול לזה ברקמה נורמלית סמוכה ולזהות את המבנים הספציפיים האחראים לביטוי miRNA זה. טכניקה זו יכולה להיות שימושית מאוד במענה על שאלות קליניות מסוימות, כגון תפקידו של miRNA ספציפי בהתפתחות סרטן. התוצאות שלנו מצביעות על כך שתאי אפיתל חלב מבטאים רמות גבוהות משמעותית של miR-489 מאשר תאי גידול סמוכים.

רקמת סרטן שד אדם שמשה כדי לקבוע ביטוי מירנה-489. צינור בלוטת חלב ותאי אפיתל נמצאו להביע מירנה-489 גבוהות משמעותי רמות מאשר רקמת גידול סמוכה בשני חולים (איור 1A ו -1 B). זה מראה בבירור כי ביטוי מירנה-489 אבד רקמת גידול, דבר המצביע על פעילות מדכאת גידול של מירנה-489. כדי להמשיך לאשר את הממצאים, רקמת הגידול לבין רקמות בריאות סמוכות מאותו החולה הושוו. כפי שנצפה באיור 2 א ו -2, רקמות בר...

כאן אנו מציגים פרוטוקול לאיתור ביטוי miRNA בדגימות חולות סרטן השד באמצעות הכלאה של miRNA באתר.

ניתוח Clinicopathological ביטוי מירנה שד רקמות סרטן על ידי שימוש מירנה<em&gt; באתרו</em&gt; כלאה

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA ...

המטרה הכללית של היברידיזציה של Micro RNA In Situ זו היא לזהות את המיקום של ה-Micro RNA הנבדק ברקמת סרטן השד. כך יוכל המסר להשיב על שאלות מפתח בתחום סרטן השד, כגון האם ה-micro RNA הנבדק הוא לא ברור או מדכא גידולים.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת שלה לזהות גרעיניות תאיות של עניין ברקמת סרטן השד. התחל את הכנת הרקמה על ידי הסרת פראפין מחתכי רקמת שד שהוכנו מראש. טבול את השקופיות בצנצנת Coplin ב-Xylene טרי פעמיים, למשך עשר דקות בכל פעם.בצעו רהידרציה לחתך הרקמה באמצעות דגירה בריכוזים יורדים של ethanol במים מזוקקים פעמיים, למשך חמש דקות בכל שלב. לאחר מכן, טבלו את הרקמה במים שעובדו ב-diethylpyrocarbonate או DEPC למשך חמש דקות. בזמן שהרקמה טבולה, סמנו גבולות מסביב לחתך הרקמה באמצעות עט מחסום הידרופובי.לאחר הטבילה ב-DEPC, קבע את הרקמה ב-4% PFA למשך 15 דקות. לאחר הקיבוע, בצע שטיפה ב-PBS. לאחר מכן, הטבל את הרקמה ב-0.3% Triton X-100 ב-PBS למשך עשר דקות.דגרו את הדגימה עם תמיסת Proteinase K בריכוז 50 micrograms per microliter למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. לאחר מכן, דגרו את חתכי הרקמה עם triethanolamine ו-acetic anhydride למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השלימו את הפעולה בשטיפה ב-PBS.שטפו את הרקמה ביסודיות. דגרו את נתח הרקמה עם 120 µL של תמיסת היברידיזציה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דללו את הגשש NLA המסומן ב-DIG ב-5' לריכוז סופי של 3 pM ב-120 µL של תמיסת היברידיזציה.לאחר מכן, הוסיפו 3 µL של תמיסת מלאי בריכוז 40 ng/µL ל-120 µL של באפר היברידיזציה. דגרו את התערובת בטמפרטורה של 95 °C למשך חמש דקות. הכניסו את נתח הרקמה למכל של 10 על 8 אינץ' וכסו את הרקמה ב-120 µL מהגשושית כך שהיא תהיה מכוסה לחלוטין.הרטיב שני נייר סופג וכסה את המכל כדי ליצור תא לחות. דגור את נתח הרקמה למשך לילה ב-54 °C. לאחר ההיברידיזציה, שטוף את הרקמה בבופר saline sodium citrate בריכוז 5X או SSC למשך שבע דקות ב-57 °C.בשלב הבא, שטפו את נתח הרקמה עם 1X SSC פעמיים. שטפו את נתח הרקמה עם 0.2X SSC. לאחר מכן, שטפו את נתח הרקמה עם 0.2X SSC למשך שבע דקות בטמפרטורת החדר.דגרו את נתח הרקמה ב-PBS למשך עשר דקות. דגרו את נתח הרקמה עם חוצץ (blocking buffer) בטמפרטורת החדר למשך שעה בתא לח. דללו את הנוגדן anti DIG AP ביחס של 1:300 בחוצץ.דגרו את נתח הרקמה עם הנוגדן בטמפרטורה של 4 degrees Celsius למשך לילה. למחרת, שטפו את הנתחים עם בופר שטיפה שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם. עקבו אחר הוראות הערכה המסחרית ELF 97 כדי לפתח את נתח הרקמה באמצעות פוספטאז אלקלי המפיק אור פלואורסצנטי בגודל שלוש.בשלב הבא, שטפו את הסניט באמצעות בופר שטיפה למשך חמש דקות. צבעו את הסניט עם 100 µL של צבע Hoeshct בריכוז של 2.5 ng/µL למשך חמש דקות. לאחר הצביעה, בצעו שטיפה של חמש דקות עם בופר שטיפה.השתמש ב-15 µL של תמיסת קיבוע (mounting buffer) עבור כל נתח רקמה. לאחר מכן, נגב את עודפי תמיסת הקיבוע בעזרת נייר ניגוב לרקמות. לבסוף, אטום את הזכוכית עם לק שקוף כדי למנוע דליפה.לבסוף, בחנו את החתך באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה כוללת של 100 X. רקמת סרטן שד אנושית משני מטופלים שימשה לקביעת הביטוי של Micro RNA 489. נמצא כי תאי אפיתל ותעלות של בלוטות זיכרון מבטאים רמות גבוהות משמעותית של Micro RNA 489 בהשוואה לרקמת גידול סמוכה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן ביצוע היברידיזציה של Micro RNA In Sito באמצעות דגימות ממטופלים עם סרטן השד.

clinicopathological-analysis-mirna-expression-breast-cancer-tissues

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

פולימראז כמותי זמן אמת תגובת שרשרת (QPCR) היא שיטה מהירה רגישה כדי לחקור את רמות הביטוי של microRNA שונים (מירנה) מולקולות דגימות הגידול. שימוש בביטוי זה השיטה של ​​מאות מולקולות שונות מירנה יכול להיות מוגבר, לכמת אותה ולנתח אותה מהתבנית cDNA אותו.

MicroRNA איתור גידולים הערמונית ב כמותי בזמן אמת PCR (QPCR)

מאמר זה מתאר בפרוטוקול הכלאה באתר מותאם לגילוי colormetric ביטוי microRNA בסעיפי כליות קבועים פורמלין.

MicroRNA<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה לרקמות כליה פורמלין קבועה

מולקולרי איתות דרך גם אסטרוגן ומייקרו RNA הם קריטיים בהתפתחות סרטן השד וצמיחה. אסטרוגן מפעיל את קולטני האסטרוגן, שהם גורמי שעתוק. גורמי שעתוק רבים יכולים לווסת את הביטוי של מיקרו RNA, והוא יכול להיות צדודית מיקרו RNA מוסדר אסטרוגן תוך שימוש בטכניקות שונות בקנה מידה גדולה.

פרופיל של מיקרו RNA המוסדר אסטרוגן בתאי סרטן השד

כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט לניתוחי ביטוי microRNA (miRNA) ברקמות קליניות של סרטן ערמונית קפוא (FFPE) או סרטן ערמונית קפוא טרי (PCa) המשתמשות ב-PCR כמותי בזמן אמת (RT-PCR) והכלאה באתרה (ISH).

ניתוח ביטוי מירנה ברקמות קליניות בסרטן הערמונית

חומצת גרעין השפלה ארכיוני רקמת הגידול הטרוגניות, חוסר דגימות רקמה קפוא טרי עלולה להשפיע לרעה על שירותי אבחון סרטן במעבדות פתולוגיה ברחבי העולם. כתב יד זה מתאר אופטימיזציה של פאנל של סמנים ביולוגיים שימוש assay חרוז מגנטי מולטיפלקס לסווג סרטן השד.

אופטימיזציה של וזמינותו הביטוי מבוסס-RNA מולטיפלקס באמצעות חומר ארכיוני של סרטן השד

פורמלין-קבוע דגימות פרפין-מוטבע מהווים מקור חשוב של סמנים מולקולריים של מחלות אנושיות. כאן אנו מציגים פרוטוקול הכנה ספריית cDNA מבוסס המעבדה, בתחילה עוצב עם RNA טריים קפואים, באופן מיטבי עבור הניתוח של מיקרו Rna בארכיון של רקמות מאוחסן עד 35 שנים.

רצף MicroRNA רטרוספקטיבה: DNA משלימים ספריית הכנת פרוטוקול באמצעות פורמלין-קבוע RNA פרפין-מוטבע דגימות

מיקרו-RNAs (miRNAs) הם רצפי RNA הומולוגי מאוד וקצר, הגשה הרגולטורים post-transcriptional RNAs שליח (mRNAs). שיטות איתור miRNA הנוכחית להשתנות רגישות. אנו מתארים פרוטוקול המשלבת בחיי עיר הכלאה immunostaining לגילוי בו-זמניות של מולקולות miRNA וחלבון במקטעי רקמת הלב העכבר.

MiRNA רקמות ספציפיות ביטוי פרופיל בהלב העכבר באמצעות סעיפים באתרו של הכלאה

אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את רמת הביטוי של מחזורי microRNA (miRNAs) בדגימות הפלסמה של חולי סרטן. בפרט, השתמשנו ערכת זמינים מסחרית עבור מחזור miRNA החילוץ, שעתוק במהופך. לבסוף, ניתחנו את פאנל של 24 miRNAs שנבחר באמצעות לוחות מותאמים אישית בדיקה מראש הבחין בזמן אמת.

זיהוי של לוח מותאם אישית MicroRNA במחזור בחולים עם סרטן המעי הגס גרורתי

הפרוטוקול מתאר בדיקת הכלאה אימונופלואורסצנטית טנדם עם רקמה משובצת פרפין קבועה בפורמלין כדי לזהות ולכמת מיקרו-RNA וחלבונים מרובים בו זמנית.

הגברה וזיהוי של מיקרו-RNA באמצעות הכלאה נעולה של חומצת גרעין-באתרה כשיטת זיהוי וכימות חדשה

אנו מציגים פרוטוקול לניתוח מבניים ההלחנה של biofilm אוראלי טבעי עם מכשירים...

Biofilm ניתוח שבעל פה של Palatal expanders על ידי הכלאה ב-situ פלואורסצנטי מיקרוסקופיה Confocal סריקת לייזר

למד זיהוי ביטוי miRNA ברקמות סרטן שד באמצעות הכלאה באתרו. שיטה זו מאפשרת איתור מיקום מדויק של מיקרו-RNA בתאים ותורמת להבנת תפקידם בפתולוגיה הסרטנית.

ניתוח Clinicopathological ביטוי מירנה שד רקמות סרטן על ידי שימוש מירנה

גלה סרטונים נוספים