TAPE: דבק עוצר דמום אורגני בהשראת תרכובת ניכרת בכל היבט של צמחים עבור יישום כירורגי

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לפתח דבק המוסטטי מתכלה ליישומים כירורגיים, בהשראה מתרכובת נפוצה בצמחים. שיטה זו יכולה לסייע לנו להבין את מנגנון ההידבקות העמיד במים של ביומטריקה, כגון דבקים לרקמות וחומרי איטום ביישומים ביו-רפואיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שתהליך ההכנה של TAPE הוא פשוט ביותר, ניתן להרחבה וידידותי לסביבה.

ראשית, הכין תמיסת Tannic Acid בבקבוק זכוכית של ארבעה מיליליטר על מעבב מגנטי. הוסף 1 ml של מים מזוקקים ו-1 g של Tannic Acid תוך ערבוב במהירות של 200 rpm. לאחר שעה, ה-Tannic Acid יהיה מומס לחלוטין בתמיסה חומה.

בשלב הבא, הוסיפו 1 ml של מים מזוקקים ל-1 g של אבקת PEG וערבבו אותם באמצעות וורטקס עד לקבלת תרחיף לבן. שמרו את התרחיף בטמפרטורה של 60 °C למשך 10 דקות. התמיסה צריכה להפוך לשקופה לחלוטין.

לאחר מכן, החזירו אותו לטמפרטורת החדר. בשלב הבא, בתוך מבחנת מיקרוצנטריפוגה, ערבבו 329 µL של תמיסת PEG עם 671 µL של תמיסת Tannic Acid. קחו את המדגם באיטיות, כיוון ששתי התמיסות צמיגיות למדי.

ערבבו בעדינות את התמיסות לתערובת דמוית דבש באמצעות שפכטל צר. סובבו את התערובת ב-12,300 gs למשך שלוש דקות ברוטור בעל זווית קבועה. לאחר מכן, שאבו בזהירות עם פיפט כמה שיותר מהנוזל העליון (supernatant), כך שיישאר ה-TAPE שנוצר במלואו.

יש לאחסן את ה-TAPE בטמפרטורה של ארבע עד שמונה מעלות Celsius למשך מספר שבועות. כדי למדוד את חוזק ההדבקה של ה-TAPE, הכין רקמת בדיקה מביופסיית עור של חזיר באמצעות מחץ (punch). הסר את כל השומן ולאחר מכן הכין שתי רקמות בדיקה בקוטר של ששה מילימטרים.

מרחו דבק ציאנואקרילט מסחרי בצד החיצוני של כל רקמה וחברו את המוטות או חפץ דומה שייאחז על ידי מכונת הבדיקה. לאחר מכן, מרחו טיפה של TAPE לצד אחד של הרקמה והפיצו אותה באופן אחיד בין הצדדים הפנימיים של שתי הרקמות כך שיהיו מחוברות. לאחר מכן, חברו והפרידו את הרקמות מספר פעמים כדי ליצור תערובת הומוגנית המכסה באופן מלא את הממשק.

בשלב הבא, חברו את המוטות למכשיר הבדיקה. התחילו בהפעלת כוח של 20 Newtons למשך דקה אחת. לאחר מכן, גרמו למוטות להיפרד בקצב של מילימטר אחד לדקה עד שהרקמות יופרדו לחלוטין.

הנתונים מוצגים כעקום כוח-מרחק. כדי לבחון את חוזק ההיצמדות בנוכחות מים, יש להוסיף 20 µL של מים לאזור המופרד בין שתי הרקמות ולהצמיד מיד את המשטחים הרטובים באמצעות ה-TAPE. חזור על הבדיקה כפי שבוצעה קודם לכן, ללא שינויים נוספים.

ראשית, חתכו פקק בקוטר שמונה מילימטרים מתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה ושקלו אותו. לאחר מכן, מלאו את הפקק ב-150 milligrams של TAPE ומדדו את המשקל הכולל. אין למלא את הפקק מעבר לשפה, שתידרש כחסם.

הוסיפו 50 milliliters של בופר PBS לבקבוק תרבית תאים של 75 square centimeter. הכניסו את הפקק הטעון לבקבוק והטביעו אותו. דגרו את הבקבוק בטמפרטורה של 37 degrees Celsius על שייקר אורביטלי המכוון ל-50 rpm, אך לא יותר מכך.

בזמן הרצוי, הסר את המכסה וייבש אותו בעזרת גז חנקן. לאחר מכן, שקול את המכסה. בשלב הבא, החזר את ה-PBS אל הבקבוק והמשך בדגירה תוך써 ניעור עדין עד לנקודת הזמן הבאה.

מהמדידות, חשבו את המשקל הנותר היחסי. התחילו עם עכבר זכר בן שבועות שש תחת הרדמה מלאה, שנבדק באמצעות צביטה בבהו'; ודאו כי מרחתם משחה וטרינרית על העיניים לפני תחילת הניתוח.

כעת, חשפו את הכבד באמצעות חתך קו אמצע בבטן, והניחו נייר סינון בעל מסה ידועה מתחת לכבד כדי לקבע אותו. לאחר מכן, דקרו את הכבד עם מחט בקוטר 18G כדי להסב דימום. תוך כדי ספיגת הדם בעזרת גזה סטרילית, הניחו מיד 100 µL של TAPE על אתר החתך.

עבור בקרות חיוביות, השתמשו בציאנואקרילט או בדבק דומה, ועבור בקרות שליליות אל תבצעו פעולה כלשהי. אין צורך בתפרים נוספים. לאחר מריחת הדבק, אספו את הדם מאתר הפגיעה אל תוך הנייר.

יש להחליף את הנייר בכל 30 second למשך שתי דקות. מדדו את מסת הדם שנספגה בארבעה ניירות הסינון. יש להקרין את בעל החיים.

נבחנו מספר יחסי ריכוז של TA ו-PEG והשילוב האידיאלי להכנת TAPE היה יחס נפחי של שניים לאחד. TAPE כזה הוחל בין שתי עורות חזיר בקוטר של ששה מילימטרים, ולאחר מכן נבדק במכונת מתיחה כפי שתיאור. הכוח הדרוש להפרדת שתי עורות החזיר נמדד בתחילה ב-200 kilopascals ועלה ל-250 kilopascals עם מחזורים חוזרים.

כאשר דגימות העור הולחו לאחר כל מחזור של היצמדות/ניתוק, חוזק המתיחה של הקשר ירד בתחילה ל-90 kilopascals ופחת ל-50 kilopascals לאחר 20 מחזורים. עמידות ה-TAPE נבדקה בנפחים קטנים המדוללים ב-PBS עם ניעור בתנאי תאורה פיזיולוגיים. המסה נשמרה למשך 21 ימים תוך שימוש בפורמולציית יחס של שניים לאחד.

ניסוח של TAPE ביחס של אחד לאחד החזיק מעמד ל-13 ימים בלבד בתנאים אלו. לאחר מכן, נערך מבחן המוסטזיס in vivo. הכבד שנאטם באמצעות TAPE הושווה לדבק פיברין מסחרי.

הכבד שנאטם באמצעות TAPE דימם באופן משמעותי פחות מהכבד שנאטם באמצעות דבק פיברין. לאחר רכישת המיומנות, ניתן להכין את ה-TAPE תוך חמש דקות אם הפעולה מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמור על היחס האופטימלי בין Tannic Acid ל-PEG, כיוון שהוא עשוי להשפיע באופן דרמטי על כוח ההיצמדות של ה-TAPE.

לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הביומטריה לבחון דרכים בהשראת הטבע לפתרון בעיות עכשוויות בפיתוח חומרים דבקיים עמידים למים. אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי חומרים המסטטיים, ניתן ליישמה גם במערכות אחרות, כגון חומרי איטום רקמות לריפוי פצעים ומדבקות להשתלה למתן תרופות.