אינדוקציה של ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis עכברים וההערכה של הפצת מחלות התלויה של תאים חיסוניים ברקמות שונות

המטרה הכוללת של מודל ה-Experimental Autoimmune Encephalomyelitis או EAE, היא להקל על חקר המנגנונים המולקולריים הפוטנציאליים העומדים בבסיס התפתחותה של טרשת נגדית. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הטרשת הנגדית, כגון: באיזה שלב של המחלה חודרים תאי מערכת החיסון למערכת העצבים המרכזית? היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שמודל ה-EAE מדמה רבות מהמאפיינים העיקריים של טרשת נגדית, כגון דמיאלינציה וחדירה של תאי מערכת החיסון.

להשלכות של טכניקה זו יש השפעה על הטיפול בטרשת נגדית, שכן תרופות שנבחנו בשיטה זו כבר אושרו לטיפול במחלה זו. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה עשויים להתקשות, מכיוון שישנם תנאים מדוקדקים שחייבים להביאם בחשבון בעת השראת EAE. יש להחזיק את העכברים בסביבה נטולת סטרס, ויש להכין רעלן פרטוסיס (pertussis toxin) באופן טרי.

הדגמה רשמית של שיטה זו היא קריטית, שכן בידוד קשרי הלימפה והוצאת חוט השדרה הם תהליכים שקשה ללמוד באמצעות תיאור בלבד. התחילו בהזרקה תת-עורית לעכברות נקבות בנות 10 עד 13 שבועות של 200 micrograms של myelin oligodendrocyte glycoprotein, שהומוגניזされました ב-200 microliters של complete Freund's adjuvant, המכיל 400 micrograms של mycobacterium tuberculosis.

הזריק לעכברים באופן תוך-peritonal 0.2 micrograms של רעלן הפרטוסיס (pertussis toxin) ב-200 microliters של PBS, באופן מיידי ופעם נוספת לאחר 24 שעות. חיוני שהעכברים יסתגלו הן לטיפול והן לסביבת הניסוי לפני השראת EAE, כדי למנוע השרה של סטרס העשוי למנוע את התפתחות התסמינים הקליניים. שבוע לאחר ההזרקה, בדוק את העכברים מדי יום לאיתור תסמינים קליניים כפי שמתואר בטבלה.

כדי להעריך את אוכלוסיית תאי החיסון בקשרי הלימפה שנוצרה כתוצאה מהשראת EAE, בנקודת הזמן המתאימה לאחר ההשראה, הרטיבו את אזור החתך ב-80% isopropanol, והסירו בזהירות את העור מעל אזור הירך. בעזרת פינצטה, הסירו בזהירות את קשרי הלימפה המפשעיים (inguinal lymph node) מרקמת השומן. לאחר מכן שקלו את הקשרי הלימפה, והניחו את הדגימה ב-PBS על קרח.

כדי לנתח את תאי חוט השדרה, הרטיבו את גב בעל החיים באיזופרופנול, והשתמשו בסכין מנתחים כדי לבצע חתך לאורכי לאורך עמוד השדרה. לאחר מכן הסירו את העור, ובדלו את החלק המותני של עמוד השדרה, המעצב את הגפיים האחוריות. שטפו את עמוד השדרה באמצעות מזרק מלא ב-PBS כדי להוציא את חוט השדרה.

לאחר הסרה של כ-1/3 מחבל השדרה המותני, שקלו את מקטע השדרה ואחסנו את הרקמה ב-PBS על קרח. כדי לנתח את אוכלוסיית תאי החסינות בטחול, פתחו את הרקמה כדי להגיע לחלק התחתון של הבטן. לאחר מכן, הסירו את הטחול וחתכו כ-1/8 מהרקמה.

שקלו את שקע של הטחול, ואחסנו את הרקמה ב-PBS על קרח. לאחר מכן, השתמשו בבוכנה של מזרק של 2 mL כדי למעוך את שאר הרקמה דרך נפה עם רשת של 70 מיקרון על גבי מבחנה של 50 mL, ולאחר מכן שטפו את המסננת עם 5 mL של PBS. סובבו במ centri-fuge את התאים המסוננים.

ששפשף מחדש את המשקע ב-500 µL של תמיסת ליזיס לתאים, והעבר את התאים לשפופרת של 1.5 mL. לאחר 10 דקות בטמפרטורת החדר, שטוף את התאים פעמיים ב-500 µL של PBS. לאחר השטיפה השנייה, ששפשף מחדש את המשקע ב-100 µL של 0.2% BSA ב-PBS, והוסף לתאים 2 µL של תמיסת חסימה לקולטני Fc.

לאחר 15 דקות בחושך בטמפרטורת החדר, סמנו את התאים בעזרת 13 µL של תערובת נוגדנים למשך 15 דקות נוספות בטמפרטורת החדר ובחושך. בסיום האינקובציה, שטפו את התאים לפחות פעמיים ב-500 µL של PBS, ושחזר את המשקע הסופי ב-500 µL של PBS טרי. לאחר מכן, העבירו את התאים למבחנה עבור ציטומטריית זרימה על קרח.

לבסוף, כדי לנתח את הדגימות באמצעות ציטומטריה של זרימה, מיד לפני מדידת הציטומטריה של הזרימה, הוסיפו 30 µL של סטנדרט לספירה מוחלטת עבור ציטומטריה של זרימה לתאים לצורך קביעת מספר התאים המוחלט. לאחר מכן, נתחו את הדגימות במכשיר הציטומטר של הזרימה. כפי שמוצג באיור זה, נצפית עלייה זמנית בכל אוכלוסיות תאי המערכת החיסונית בתוך קשרי הלימפה במהלך השלב החריף של השראת EAE.

בטחחול, עם זאת, רק מקרופאגים, תאי B, תאי T ונויטרופילים מראים חדירה מוגברת. בדם, כל אוכלוסיות התאי המערכת החיסונית מראות עלייה חולפת בסירקולציה הפריפריאלית במהלך השלב הפרה-קלני, התואמת לעלייה דומה התלויה במחלה בחוט השדרה המותני במהלך השלב האקוטי של המחלה, למעט אוכלוסיית המונוציטים, שככל הנראה מבדילה למקרופאגים לאחר הכניסה לחוט השדרה. כאן מוצגת אסטרטגיית ה-gating להערכת אוכלוסיות התאים השונות.

מספרי התאים קשורים לכמות הרקמה או לנפח הדם שנותחו, ובכך משקפים את ספירת התאים המוחלטת. בקשרי הלימפה, ביטוי ה-mRNA של IL-23 עולה במהלך השלב הפרה-קליני, בעוד שהביטוי של IL-6 עולה באופן תלוי מחלה. בטחול, ביטויי IL-6 ו-IL-23 עולים בשלב הפרה-קליני, בעוד שביטוי ה-mRNA של IL-1 beta אינו מושפע עד להופעת המחלה.

בדם, רק הביטוי של mRNA של TNF-alpha מוגבר ובאופן התלוי במחלה. בחבל השדרה המיתני, TNF-alpha, IL-1 beta ואינטרפרון גמא מופעלים במהלך השלב החריף, בעוד ש-IL-6 מוגבר רק במהלך שלב הפריצה של המחלה. ברגע ששולטים במודל ה-EAE, ניתן להשלים את בידוד התאים העוקב ואת ניתוח ההשפעות תוך שמונה שעות עבור עשרה עכברים, במידה והם מבוצעים כראוי.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון Western Blot או ELISA כדי לאשר את תוצאות ניתוח ביטוי ה-mRNA. לאחר פיתחו, סללל טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הטרשת הנשעת לחקור את מנגנון הדמיאלינציה במערכת העצבים המרכזית. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשרות את מודל ה-EAE וכיצד לבודד תאי מערכת חיסונית כדי להשיג תוצאות הזרמה ציטומטרית (flow cytometry) הניתנות לשחזור.

יש לזכור כי עבודה עם adjuvant של Freund המלא עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט באמצעי זהירות בעת ביצוע הליך זה, כגון הרמה של עור העכבר והבטחה כי המזרק חדר לעור באופן מלא.