אינדוקציה של ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis עכברים וההערכה של הפצת מחלות התלויה של תאים חיסוניים ברקמות שונות

כתב יד זה מתאר את השיטות לאינדוקציה וניקוד של מודל דלקת המוח האוטואימונית הניסויי (EAE), יחד עם הערכת התפלגות תאי החיסון ורמות ציטוקינים mRNA בבלוטות הלימפה, הטחול, הדם וחוט השדרה באמצעות ציטומטריית זרימה ו-PCR כמותי, בהתאמה, בשלבי מחלה שונים.

המטרה הכוללת של מודל דלקת המוח האוטואימונית הניסיונית או EAE, היא להקל על חקר המנגנונים המולקולריים הפוטנציאליים העומדים בבסיס התפתחות טרשת נפוצה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הטרשת הנפוצה כגון, באיזה שלב של המחלה תאי מערכת החיסון חודרים למערכת העצבים המרכזית? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמודל EAE מחקה רבים מהמאפיינים העיקריים של טרשת נפוצה, כגון דה-מיאלינציה וחדירת תאי חיסון.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בטרשת נפוצה מכיוון שתרופות שנבדקו בשיטה זו כבר אושרו למחלה זו. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שישנם תנאים יסודיים שיש לקחת בחשבון בעת השראת EAE. יש להחזיק עכברים בסביבה נטולת מתח, ויש להכין רעלן שעלת טרי.

הדגמה רשמית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את בידוד בלוטות הלימפה וחילוץ חוט השדרה לפי תיאור בלבד. התחל בהזרקה תת עורית לעכברים נקבות בנות 10 עד 13 שבועות עם 200 מיקרוגרם של גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין. מתחלב ב-200 מיקרוליטר של אדג'ובנט פרוינד, המכיל 400 מיקרוגרם של מיקובקטריום טוברקולוזיס.

מיד ו-24 שעות לאחר מכן, יש להזריק לעכברים 0.2 מיקרוגרם של רעלן שעלת ב-200 מיקרוליטר PBS. חיוני שהעכברים יותאמו הן לטיפול והן לסביבת הניסוי לפני השראת EAE לגרימת מתח שיכול למנוע התפתחות של תסמינים קליניים. שבוע לאחר ההזרקה, בדוק את העכברים מדי יום לאיתור תסמינים קליניים כמתואר בטבלה.

כדי להעריך את אוכלוסיית תאי החיסון של בלוטות הלימפה הנגרמות על ידי EAE, בנקודת הזמן המתאימה לאחר האינדוקציה, הרטיבו את אזור החתך באיזופרופנול של 80%, והסירו בזהירות את העור מעל אזור הירך. בעזרת מלקחיים הסר בזהירות את בלוטת הלימפה המפשעתית מרקמת השומן. לאחר מכן שקלו את הצומת והניחו את הדגימה ב-PBS על קרח.

כדי לנתח את תאי חוט השדרה, הרטיבו את גב החיה באיזופרופנול, והשתמשו באזמל כדי לבצע חתך אורכי לאורך עמוד השדרה. לאחר מכן הסר את העור ונתח את החלק המותני של עמוד השדרה, תוך עצבנות הגפיים האחוריות. שטפו את עמוד השדרה עם מזרק מלא PBS כדי לחלץ את חוט השדרה.

לאחר הסרת כ-1/3 מחוט המותני, שקלו את שבר עמוד השדרה ואחסנו את הרקמה ב-PBS על קרח. כדי לנתח את אוכלוסיית תאי החיסון של הטחול, פתח את הרקמה כדי לקבל גישה לחלק התחתון של הבטן. לאחר מכן, הסר את הטחול וחתך כ- 1/8 מהרקמה.

שקלו את שבר הטחול, ואחסנו את הרקמה ב-PBS על קרח. לאחר מכן השתמש בבוכנה ממזרק של שני מ"ל כדי להשרות את שאר הרקמה דרך מסננת רשת של 70 מיקרון על צינור של 50 מיליליטר, ואחריה שטיפה של חמישה מיליליטר PBS של המסננת. צנטריפוגה התאים המסוננים.

השעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מאגר ליזה של תאים, והעבירו את התאים לצינור של 1.5 מיליליטר. לאחר 10 דקות בטמפרטורת החדר, יש לשטוף את התאים פעמיים ב -500 מיקרוליטר PBS. לאחר הכביסה השנייה, השעו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של 0.2% BSA ב-PBS, והוסיפו שני מיקרוליטרים של קולטן Fc חוסם מאגר אחד לתאים.

לאחר 15 דקות בחושך בטמפרטורת החדר, סמנו את התאים ב-13 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים למשך 15 דקות נוספות בטמפרטורת החדר בחושך. בתום הדגירה יש לשטוף את התאים לפחות פעמיים ב -500 מיקרוליטר PBS, ולהשעות מחדש את הגלולה הסופית ב -500 מיקרוליטר PBS טרי. לאחר מכן העבירו את התאים לצינור ציטומטריה זרימה על קרח.

לבסוף, כדי לנתח את הדגימות על ידי ציטומטריית זרימה, ישירות לפני מדידת ציטומטריית הזרימה, הוסף 30 מיקרוליטר של תקן ספירה מוחלטת ציטומטרית זרימה לתאים לקביעת ספירת התאים המוחלטת. לאחר מכן נתח את הדגימות על ציטומטר הזרימה. כפי שאיור זה ממחיש, עלייה חולפת בכל אוכלוסיות תאי החיסון בתוך בלוטות הלימפה נצפית בשלב החריף של השראת EAE.

עם זאת, בטחול, רק מקרופאגים, תאי B, תאי T ונויטרופילים מפגינים חדירה מוגברת. בדם, כל אוכלוסיות תאי החיסון מדגימות עלייה חולפת במחזור הדם ההיקפי שלהן בשלב הפרה-קליני התואמת לעלייה דומה תלוית מחלה בחוט השדרה המותני בשלב החריף של המחלה, למעט אוכלוסיית המונוציטים, שככל הנראה מתמיינה למקרופאגים לאחר הכניסה לחוט השדרה. כאן מוצגת אסטרטגיית השער להערכת אוכלוסיות התאים השונות.

מספר התאים קשור לכמות הרקמה או נפח הדם המנותח, המשקף את ספירת התאים המוחלטת. בבלוטות הלימפה, ביטוי ה-mRNA של IL-23 מוגבר בשלב הפרה-קליני, בעוד שהביטוי של IL-6 עולה באופן תלוי מחלה. בטחול, ביטוי IL-6 ו-IL-23 עולה בשלב הפרה-קליני, בעוד שביטוי ה-mRNA של IL-1 בטא אינו מושפע עד להופעת המחלה.

בדם, הביטוי של TNF-alpha mRNA בלבד מווסת ותלוי במחלה. בחוט השדרה המותני, TNF-אלפא, IL-1 בטא ואינטרפרון גמא מושרים בשלב החריף, בעוד ש-IL-6 מווסת בשלב הופעת המחלה בלבד. לאחר השליטה, ניתן להשלים את מודל ה-EAE, בידוד התאים שלאחר מכן וניתוח ההשפעות תוך שמונה שעות עבור עשרה עכברים אם הם מבוצעים כראוי.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו Western Blot או ELISA כדי לאשר את תוצאות ניתוח ביטוי ה-mRNA. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום טרשת נפוצה לחקור את מנגנון הדמיאלינציה במערכת העצבים המרכזית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגרום למודל EAE וכיצד לבודד תאי חיסון כדי לקבל תוצאות ציטומטריית זרימה הניתנות לשחזור.

אל תשכח שעבודה עם אדג'ובנט שלם של פרוינד עלולה להיות מסוכנת ביותר, והוסף אמצעי זהירות כגון הרמת עור העכבר והבטחת חדירה מלאה לעור על ידי המזרק יש לנקוט בעת ביצוע הליך זה.