Murine הינד לימב ארוך עצם Dissection ובידוד מח העצם

המטרה הכללית של הליך נתיחה זה של עצמות ארוכות ובידוד מוחי עצם היא להסיר במהירות ובאופן שיטתי את העצמות הארוכות ולאסוף את מוח העצם לצורך ניתוחים המשכיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח הקשורות לביולוגיה של מוח העצם, גרורות סרטניות ואימונולוגיה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שתהליך הנתיחה מהיר וסטנדרטי, והליך בידוד מוח העצם הוא סטרילי למדי. התחילו במיקום העכבר בתנוחה גבהית (supine).

לאחר מכן, מקבעו את כל ארבעה כריות כף הרגל מתחת למפרק הקרסול וריססו את העכבר ב-70% ethanol, תוך הרטבה יסודית של הרגליים. לאחר מכן, בצעו חתך קטן מימין לקו האמצע בבטן התחתונה, מעל הירך, והרחיבו את החתך במורד הרגל ומעבר למפרק הקרסול. משכו את העור לאחור.

לאחר מכן, גזרו את שריר ה-quadriceps המעוגן לקצה הפרוקסימלי של ה-femur כדי לחשוף את הצד האנטריורי של עצם הירך, והצמידו את השריר הרחק מהרגל באמצעות סיכה בזווית של 45 מעלות מהלוח. כאשר המספריים מונחים כנגד הצד הפוסטריורי של ה-femur, גזרו את שרירי ה-hamstrings מהמפרק של הברך. לאחר מכן, משכו לאחור את העור ואת שרירי ה-hamstring המעוגנים לקצה הפרוקסימלי של ה-femur כדי לחשוף את הצד הפוסטריורי של העצם, והצמידו את שרירי ה-hamstring הרחק מהרגל, כאשר הסיכה מונחת בזווית של 45 מעלות.

בעזרת הפינצטה, אחזו את הקצה הדיסטלי של ה-femur ממש מעל מפרק הברך. לאחר מכן, הנחיתו את להבי המספריים משני צדי גוף ה-femur לכיוון מפרק הירך. לאחר ההגעה לראש ה-femur, סובבו את המספריים והעבירו את הלהב העליון ישירות מעל ראש ה-femur כדי לבצע פריקה של ה-femur.

כעת אחזו בחלק העליון של גוף הפמור (עצם הירך) באמצעות הפורספס, וגזרו את הרקמה הרכה מהראש של הפמור כדי לשחרר את הפמור מהאצטבולום (הגומחה של עצם האגן). לאחר מכן משכו את כל עצם הרגל, כולל הפמור, הברך והטיביה (שוק), כלפי מעלה והרחקה מהגוף, וגזרו בזהירות את רקמת החיבור והשרירים המחברים את הרגל לעור. כאשר כל רקמת החיבור הוסרה, פריסו את מפרק הקרסול מעבר לטווח התנועה הרגיל וסובבו את המספריים כפי שהודגם כעת כדי לגרום לפריקה של הטיביה.

אחזו בקצה הדיסטלי של הטיביה, תוך הקפדה שלא לקרע את הגידים, ומשכו את הטיביה למעלה והתרחקו מהגוף ומלוח הפינים. לאחר מכן, הסירו כל רקמה חיבורית שנותרה ומחוברת לעצם הארוכה באזור הברך, וכל שריר או רקמה חיבורית נוספים המחוברים לפמור ולטיביה. כדי להכין את העצם הארוכה לבידוד מח העצם, אחזו בפמור כאשר הפטלה פונה החוצה וראש הפמור פונה כלפי מטה.

בצעו פלסיה (פריסה) של מפרק הברך וסבבו את המספריים כדי לנתק את הטיביה (שוקה) מהפמור (ירך). לאחר מכן, הסירו כל רקמה מחברת המחברת בין הפמור לטיביה. בשלב הבא, אחזו בפמור כאשר הצד הקדמי פונה החוצה והראש הפמורלי פונה כלפי מטה, והנחו את המספריים במעלה גוף הפמור לכיוון הקונדילים.

סובב בעדינות את המספריים הלוך ושוב כדי להסיר את הקונדילים, את הפיקה ואת האפיפיזה, ובכך לחשוף את המטאפיזה. לאחר מכן, השתמש בפינצטה, במספריים ובניגוני Kimwipes כדי להסיר כל רקמת שריר או רקמה מחברת נוספת המחוברת לפמור. בשלב הבא, אחז בטיביה כאשר הצד הקדמי פונה החוצה וקצה הקרסול פונה כלפי מטה.

אם האפיפיזה של השוקה (tibial epiphysis) שלמה, הנחו את המספריים במעלה גוף השוקה לכיוון הקונדילים וסובבו את המספריים בעדינות קדימה ואחורה כדי להסיר את הקונדילים ואת האפיפיזה, ובכך לחשוף את המטאפיזה של השוקה (tibial metaphysis). לאחר מכן, הסירו כל שריר או רקמה חיבורית נוספת המחוברים לשוקה, כפי שהודגם זה עתה. כדי לאסוף את מחית העצם, דחפו תחילה מחט בכיול 18 gauge דרך תחתיתו של מבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח 0.5 milliliter.

לאחר מכן, מקמו את העצמות הארוכות בתוך הפקעת, כאשר קצה הברך פונה כלפי מטה, וסגרו את המכסה. הכניסו את פקעת המיקרוצנטריפוגה בנפח 0.5 מיליליטר לתוך פקעת מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר, וסובבו את הפקעת במיקרוצנטריפוגה במהירות של 10,000 ×g או יותר למשך 15 שניות. ודאו באמצעות בדיקה ויזואלית שמוח העצם הוצא מהעצמות בתהליך הסבב.

העצמות צריכות להיראות לבנות, ומשקע גדול צריך להיות נראה בתוך המבחנה הגדולה יותר. לאחר מכן, השליכו את העצמות הנמצאות במבחנת המיקרוצנטריפוגה בנפח 0.5 milliliters, והשעיו את מחית העצם בתמיסה המתאימה לניתוח הרצוי בהמשך. טכניקת נתיחה מהירה זו מתאימה למספר ניתוחים המשכיים, כולל היסטומורפומטריה והיסטולוגיה.

ואכן, כפי שמוצג בשחזור תלת-ממדי זה של micro-CT היסטומורפומטרי מייצג, הן העצם הספוגית והן המעטפת הקורטיקלית נשמרות, מה שמאפשר כימות מדויק של הפרמטרים המבניים הסטנדרטיים להיסטומורפומטריית עצם. בחתך היסטולוגי מייצג זה של טיביה מקובעת בפורמלין, שעברה דקאלציפיקציה ונצבעה ב-H and E, ניתן להבחין בשימור השלמות של הן העצם המהתגבשת והן מח העצם התאי לצורך אנליזה היסטולוגית. יתרה מכך, מח העצם שבודד באמצעות הליך זה מתאים ליישומים רבים של שלבים מאוחרים יותר, כולל תרבית תאים ראשונית של אוסטאוקלסטים או אוסטאובלסטים.

לאחר רכישת המיומנות, ניתן להשלים את הטכניקה תוך כמעט שבע דקות, מהניתוח של העצם הארוכה ועד לבידוד מחול השומן, במידה שהיא מבוצעת כהלכה. במהלך ביצוע הפרוצדורה, חשוב לזכור למקם את העכבר בצורה שתקל על הניתוח. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון FACS או תהליכים אחרים של תא בודד, כדי לענות על שאלות נוספות הנוגעות לשינויים באוכלוסיות תאי מחול השומן.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה כיצד לנצח במהירות את העצמות הארוכות של עכברים ולהפריד את מחית העצם באמצעות סנטריפוגה.