Murine הינד לימב ארוך עצם Dissection ובידוד מח העצם
April 14th, 2016
כאן אנו מציגים פרוטוקול לדיסקציה של עצמות ארוכות של הגפיים האחוריות (עצם הירך והשוקה) מעכבר המעבדה. אנו מתארים עוד טכניקה מהירה לבידוד מח עצם מעצמות אלו המשתמשת בצנטריפוגה להסרת מח עצם מחלל מח העצם.
המטרה הכוללת של הליך ניתוח עצם ארוך זה ובידוד מח עצם היא להסיר במהירות ובשיטתיות את העצמות הארוכות ולאסוף את מח העצם להמשך ניתוח במורד הזרם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הקשורות לביולוגיה של מח העצם, גרורות סרטן ואימונולוגיה. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שתהליך הדיסקציה מהיר וסטנדרטי, הליך בידוד מח העצם הוא סטרילי למדי, התחל במיקום העכבר במצב שכיבה.
לאחר מכן הצמידו את כל ארבע כריות הכפות מתחת למפרק הקרסול ורססו את העכבר באתנול 70%, תוך טבילה יסודית של הרגליים. לאחר מכן, בצע חתך קטן מימין לקו האמצע בבטן התחתונה ממש מעל הירך, והאריך את החתך במורד הרגל ומעבר למפרק הקרסול. משוך את העור לאחור.
לאחר מכן חותכים את שריר הארבע ראשי המעוגן לקצה הפרוקסימלי של עצם הירך כדי לחשוף את הצד הקדמי של עצם הירך, ולהצמיד את השריר החוצה מהרגל עם הסיכה בזווית של 45 מעלות מהלוח. כשהמספריים כנגד הצד האחורי של עצם הירך, חותכים את שרירי הירך האחורי ממפרק הברך. לאחר מכן משוך לאחור את שרירי העור ושרירי הירך האחורי המעוגנים לקצה הפרוקסימלי של עצם הירך כדי לחשוף את הצד האחורי של העצם, והצמד את שרירי הירך האחורי החוצה מהרגל, תוך הנחת הסיכה בזווית של 45 מעלות.
בעזרת המלקחיים, אחוז בקצה הדיסטלי של עצם הירך ממש מעל מפרק הברך. לאחר מכן הנח את להבי המספריים משני צידי פיר הירך לכיוון מפרק הירך. לאחר שהגעתם לראש הירך, סובבו את המספריים, הזיזו את הלהב העליון ישירות מעל ראש הירך כדי לעקור את עצם הירך.
כעת תפסו את החלק העליון של פיר הירך בעזרת המלקחיים, וחתכו את הרקמה הרכה מראש הירך כדי לשחרר את עצם הירך מהאצטבולום. לאחר מכן משוך את כל עצם הרגל, כולל עצם הירך, הברך והשוקה, למעלה והרחק מהגוף, וחתוך בזהירות את רקמת החיבור והשריר המחברים את הרגל לעור. לאחר הסרת כל רקמת החיבור, יש למתוח יתר על המידה את מפרק הקרסול ולסובב את המספריים כפי שהודגם זה עתה כדי לפרק את השוקה.
אוחזים בקצה הדיסטלי של השוקה ומקפידים לא לחתוך את הגידים, מושכים את השוקה כלפי מעלה והרחק מהגוף ומלוח הסיכה. לאחר מכן הסר את כל רקמת החיבור שנותרה המחוברת לעצם הארוכה בברך וכל שריר או רקמת חיבור נוספת המחוברת לעצם הירך ולשוקה. כדי להכין את העצם הארוכה לבידוד מח העצם, אחוז בעצם הירך כשהפיקה פונה הצידה וראש הירך פונה כלפי מטה.
האריכו יתר על המידה את מפרק הברך וסובבו את המספריים כדי לעקור את השוקה מעצם הירך. לאחר מכן הסר את כל רקמת החיבור המחזיקה את עצם הירך והשוק יחד. לאחר מכן, אחוז בעצם הירך כשהצד הקדמי פונה החוצה וראש הירך פונה כלפי מטה, והנח את המספריים במעלה פיר הירך אל הקונדילים.
סובב בעדינות את המספריים קדימה ואחורה כדי להסיר את הקונדילים, הפיקה והאפיפיזה, תוך חשיפת המטאפיזה. לאחר מכן, השתמש במלקחיים, במספריים וב-Kimwipes כדי להסיר כל שריר נוסף או רקמת חיבור המחוברת לעצם הירך. לאחר מכן, אחוז בשוק כשהצד הקדמי פונה החוצה וקצה הקרסול פונה כלפי מטה.
אם האפיפיזה הטיביאלית שלמה, הנח את המספריים במעלה פיר השוק אל הקונדיל וסובב בעדינות את המספריים קדימה ואחורה כדי להסיר את הקונדיל והאפיפיזה, תוך חשיפת המטאפיזה הטיביאלית. לאחר מכן הסר כל שריר נוסף או רקמת חיבור המחוברת לשוקה, כפי שהודגם זה עתה. כדי לקצור את מח העצם, דחף תחילה מחט בגודל 18 דרך החלק התחתון של צינור מיקרו-צנטריפוגה של 0.5 מיליליטר.
לאחר מכן הכניסו את העצמות הארוכות לתוך הצינור, קצה הברך כלפי מטה וסגרו את המכסה. קן את צינור המיקרו-צנטריפוגה של 0.5 מיליליטר בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, וצנטריפוגה את הצינורות בגדול או שווה ל-10,000 פעמים גרם במיקרו-צנטריפוגה למשך 15 שניות. ודא שמח העצם סובב מהעצמות על ידי בדיקה חזותית.
העצמות צריכות להיראות לבנות, וכדור גדול צריך להיות גלוי בצינור הגדול יותר. לאחר מכן השליכו את העצמות בצינור המיקרו-צנטריפוגה של 0.5 מיליליטר, ותלו את מח העצם בתמיסה המתאימה לניתוח הרצוי במורד הזרם. טכניקת דיסקציה מהירה זו מתאימה למספר ניתוחים במורד הזרם, כולל היסטומורפומטריה והיסטולוגיה.
ואכן, כפי שהודגם על ידי שחזור מיקרו-CT תלת מימדי היסטומורפומטרי מייצג זה, הן העצם המבטלת והן המעטפת הקורטיקלית נשמרות, מה שמאפשר כימות מדויק של הפרמטרים המבניים הסטנדרטיים להיסטומורפומטריית עצם. בחתך היסטולוגי מייצג זה של שוק פורמלית מוכתמת H ו-E וקבועה ונטולת אבנית, ניתן לראות שמירה על שלמות העצם המסוידת ומח העצם התאי לצורך ניתוח היסטולוגי. יתר על כן, מח העצם המבודד בהליך זה מתאים ליישומים רבים במורד הזרם, כולל תרבית תאים ראשונית של אוסטאוקלסטים או אוסטאובלסטים.
לאחר השליטה, ניתן להשלים את הטכניקה תוך כשבע דקות, מדיסקציה ארוכה של העצם ועד לבידוד מח העצם, אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון ההליך, חשוב לזכור למקם את העכבר כדי להקל על הדיסקציה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו FACS או תהליכים אחרים של תא בודד כדי לענות על שאלות נוספות הנוגעות לשינויים באוכלוסיות תאי מח העצם.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח במהירות את העצמות הארוכות של עכברים ולבודד את מח העצם באמצעות צנטריפוגה.
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקול לניתוח דיסקציה של עצמות ארוכות מרגליים אחוריות מעכברים במעבדה וטכניקה מהירה לבידוד מח העצם באמצעות צנטריפוגה. השיטה נועדה להקל על ניתוחים מורדים הקשורים לביולוגיה ואימונולוגיה של מח העצם.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה של מח העצם
- גרורות סרטניות
- אימונולוגיה
רקע
- הניתוח של עצמות ארוכות הוא קריטי לחקר מחלות הקשורות לעצמות.
- בידוד מח העצם הוא חיוני לניתוחים תאיים שונים.
- טכניקות סטנדרטיות משפרות את השיחזור במחקר.
- נהלים מהירים חוסכים זמן בתהליכי עבודה ניסויים.
מטרת המחקר
- לספק גישה שיטתית לדיסקציה של עצמות ארוכות.
- לאפשר איסוף יעיל של מח העצם לניתוח.
- לשמור על שלמות העצם והמח ליישום מורדים.
שיטות בשימוש
- מיקום העכבר והכנה לדיסקציה.
- דיסקציה שלב אחר שלב של עצם הירך ועצם השוקה.
- בידוד מח העצם באמצעות צנטריפוגה.
- אימות חזותי של מיצוי המח.
תוצאות עיקריות
- הטכניקה יכולה להסתיים בכשבע דקות.
- שלמות מח העצם נשמרת לניתוח היסטולוגי.
- מתאים ליישומי מורדים שונים, כולל תרבית תאים.
- פרמטרים סטנדרטיים מאפשרים כימות מדויק במחקר.
מסקנות
- טכניקת הדיסקציה והבידוד המהירה הזו היא יעילה ויעילה.
- היא תומכת במחקרים נוספים על אוכלוסיות תאי מח העצם.
- שליטה בטכניקה משפרת את יכולות המחקר בתחומים קשורים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of murine bone marrow enables high-throughput screening of hematopoietic and stromal cell populations, supporting target validation in oncology and immunology. Standardized dissection reduces variability in preclinical models, improving data reliability for go/no-go decisions. Rapid processing facilitates integration into discovery workflows where sample throughput impacts lead identification timelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of bone marrow niche mechanisms in cancer metastasis and immune cell regulation.
- Operational Value: Provides reproducible access to primary bone marrow cells for functional target de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Isolated marrow supports assay development for osteoclast/osteoblast differentiation and drug response profiling.
- Operational Value: Centrifugation-based method allows scalable processing of large cohorts for screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Preserved marrow integrity enables phenotypic screening of stromal and hematopoietic compartments in disease models.
- Operational Value: Standardized protocol supports cross-lab reproducibility in multicenter preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical efficacy testing by providing a reliable source of primary bone marrow cells.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing in bone-immune crosstalk and metastatic niche formation.
- Screening: Enables preparation of standardized cell inputs for drug sensitivity and cytotoxicity assays.
- Analytics: Yields quantifiable outputs for flow cytometry, cytokine profiling, and genetic analysis.
- Translational Research: Connects in vitro findings to preclinical validation through consistent cell sourcing.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for bone marrow-derived assays across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in bone marrow-dependent disease models.
- Operational Value: Standardization minimizes user variability and processing time.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid sample turnaround.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement through reliable preclinical data generation.
Implementation Considerations
- Requires training in murine anatomy and aseptic dissection technique.
- Needs access to microcentrifuge capable of ≥10,000 × g and sterile tubes.
- Demands standardization across users to ensure marrow yield and viability consistency.
- Adaptation considerations include adjusting bone size for different mouse strains or ages.
- Practical limitation: Protocol is optimized for murine long bones; not directly applicable to larger species without modification.
