קיבוע של biocatalysts רב בחרוזים אלגינט עבור פקטור רגנרציה Reusability משופר

המטרה הכללית של הליך ניסיוני זה היא להדגים את השימוש במערכת ביוקטליטית מצומדת של תאים שלמים המקובעת בחרוזי אלגינאט לשיפור תנובת הייצור והשימוש החוזר. זהו נושא המחקר שלי, שבו עניתי על שאלות מפתח בתחום הביוקטליזה, כגון קיבוע ביוקטליזטורים, יציבות, רגנרציה של קופקטורים וביוקטליזטורים של תאים שלמים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת גישה פשוטה אך גמישה לשיפור הייצור של ביו-מולקולות חשובות רבות באמצעות מסלולים תלויים קופקטור.

בפרוטוקול זה נעשה שימוש בשני זני E coli רקומביננטיים. SpNOx E coli, המבטא NADH oxidase, ו-HjLAD E coli, המבטא L-arabinitol dehydrogenase. מכיוון שההליך זהה עבור שני זני ה-E coli, הוא יודגם עבור HjLAD E coli בלבד.

יש להחדיר מושבה בודדת של HjLAD E coli לשלושה מיליליטר של מצע LB, המועשר ב-15 micrograms per milliliter של Ket-A-My-Sin, ולדגור למשך לילה במכשיר אינקובטור עם ניעור. למחרת, יש לדלל את התרבית ביחס של 1:100 לתוך 200 מיליליטר של מצע LB טרי המכיל 15 micrograms per milliliter של Ket-A-My-Sin, ולדגור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius במהירות של 250 RPM עד שה-OD 600 מגיע לכ-0.6. יש להשרות את ביטוי חלבון HjLAD על ידי הוספת 0.1 millimolar IPTG למצע הגידול, ודגירה בטמפרטורה של 25 degrees Celsius, במהירות של 200 RPM, למשך שש שעות.

יש לקצור את התאים המושרים על ידי סבב צנטריפוגה ב-3200 ×g ובטמפרטורה של 4°C למשך 20 דקות. יש להסיר את הנוזל העליון (supernatant), ולהמשיך בעיבוד משק התאים כפי שמוצג במקטע הבא. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, נשעה את משקי התאים של HjLAD E coli ושל SpNox E coli בנפרד בבופר Tris-Hcl בריכוז 50 mM, בצפיפות תאים של 5 גרם משקל תאים יבש לליטר.

במבחנה עם תחתית עגולה בנפח 14 milliliter, ערבבו 600 µL של HjLAD E coli בריכוז five gram dry cell weight per liter, 600 µL של SpNOx E coli בריכוז five gram dry cell weight per liter, 100 µL של 20 millimolar NAD plus, ו-150 µL של two molar L-aribinitol. השלימו את נפח התגובה לשני milliliters על ידי הוספת 550 µL של 50 millimolar Tris-HCl. דגרו את תערובת התגובה בטמפרטורה של 30 °C ובמהירות של 200 RPM למשך שמונה שעות.

לאחר שמונה שעות, סבב את התערובת בצנטריפוגה ב-3200 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך 10 דקות, ואסוף את עליון התגובה (supernatant). כדי לכמת את ייצור ה-L-xylulose באמצעות בדיקה קולורימטרית, שאב 100 µL מהעלייה שנאסף לשפרוֹרת של 1.5 mL. הוסף 50 µL של cysteine בריכוז 1.5%,‏ 900 µL של חומצה גופרית (sulfuric acid) בריכוז 70%, ו-50 µL של Kar-Piz-All בריכוז 0.1% המומס באתנול, וערבב בעדינות על ידי היפוך השפרוֹרת שלוש פעמים.

דגרו את תערובת התגובה בטמפרטורה של 37 °C ובמהירות של 200 RPM למשך 20 דקות. מדדו את הבליעה האופטית של תערובת התגובה ב-560 nm באמצעות ספקטרופוטומטר. התחילו את פרוטוקול האימובליזציה על ידי הכנת תמיסת alginate בריכוז של 4%.

הוסף 0.8 גרם של sodium alginate ל-20 מיליליטר של מים מזוקקים, וחמם את התערובת כדי להמיס את ה-sodium alginate. הוסף 600 מיקרוליטר של HjLAD E coli בריכוז של חמישה גרם משקל תאים יבש לליטר, ו-600 מיקרוליטר של SpNOx E coli בריכוז של חמישה גרם משקל תאים יבש לליטר ל-1.2 מיליליטר של תמיסת alginate בריכוז 4%. ערבב את התאים ואת ה-alginate באמצעות פיפוט עדין כדי למנוע היווצרות בועות.

כדי להבטיח היווצרות של חרוזי אלגינט בעלי גודל, מורפולוגיה וקשיחות אחידים, קריטי להוסיף את תרחיף תאי האלגינט ממרחק אופטימלי, באופן איטי ובטיפות, לתוך נפח מספיק של תמיסת סידן כלוריד כך שכל החרוזים יהיו מכוסים. שאבו את תרחיף תאי האלגינט למזרק באמצעות מחט, ולאחר מכן הוסיפו את התערובת בטיפות לתוך תמיסת סידן כלוריד 0.3 molar בכוס כימית של 100 milliliter תוך כדי ערבוב רציף. השאירו את החרוזים בתמיסת הסידן כלוריד למשך שעתיים עד שלוש שעות בטמפרטורת החדר ללא ערבוב כדי לאפשר לקשירה הצולבת להתרחש.

שפכו את תמיסת הסידן כלוריד ללא הפרעה לחרוזים, על ידי מזיגה זהירה של תמיסת הסידן כלוריד לתוך מבחנה קונית של 15 milliliter. העבירו את החרוזים שנותרו למבחנה קונית אחרת של 50 milliliter. כדי להסיר עודפי סידן כלוריד ותאים שלא עוברו לאנקפסולציה, שטפו את החרוזים עם בופר Tris-HCl בריכוז 50 millimolar.

הוסיפו 10 milliliters של בופר לחרוזים, והניחו לתמיחה לעמוד ללא הפרעה במשך שלוש עד חמש דקות. לאחר שהחרוזים שוקעים לתחתית, שפכו את הבופר למכל אחר. באופן זה, שטפו את החרוזים שלוש פעמים.

אין לסבב את החרוזים בצנטריפוגה באף אחד מהשלבים, שכן הם עלולים להיקרע. אין להשליך את תחליל השטיפה Tris-HCl המשומש. שאבו את 30 milliliters של תחליל השטיפה המשומש יחד עם תמיסת calcium chloride המשומשת שנאספה קודם לכן.

השקיפו את תאי ה-E coli שאינם מקובעים על ידי סבב צנטריפוגה של תמיסת calcium chloride ו-Tris-HCl שהופרשה, ב-3200 times G למשך 20 דקות. העבירו את החרוזיים השטופים לשפופרת. לאחר מכן, העריכו את הביוסינתזה של L-xylulose לפי הפרוטוקול שהודגם עבור משקעי התאים, אך השתמשו בכל החרוזיים השטופים במקום במשקעי התאים.

כדי להעריך את היציבות של הביוקטליזים המקובעים לייצור L-xylulose, אספו את החרוצים לאחר שהם נוצרו. שטפו אותם פעמיים עם 10 milliliters של 50 millimolar Tris-HCl buffer ללא סנטריפוגציה, כפי שהודגם קודם לכן. השתמשו בכל החרוצים השטופים כדי לבצע את התגובה לייצור L-xylulose כפי שהודגם קודם לכן.

כמת את ייצור ה-L-xylulose באמצעות בדיקה קולורימטרית, כפי שהודגם קודם לכן. חזור על תגובת ייצור ה-L-xylulose למספר מחזורי הייצור הרצוי, ומדוד את כמות ה-L-xylulose שהופקה בעילי תגובת ה-supernatant בכל מחזור. ייצור ה-L-xylulose מוגבר על ידי מערכת ביוקטליטית מצומדת זו המבוססת על תאים שלמים.

החל מריכוז ראשוני של 150 millimolar של L-aribinitol, שימוש בביוקטליסט HjLAD E coli לבדו הניב תשואה של 79% L-xylulose. לשם השוואה, שימוש בתאי HjLAD E coli ותאי SpNOx E coli ביחס של אחד לאחד הניב תשואה של 96% L-xylulose. הערכה של הפרמטרים המשפיעים על יעילות הקיבוע של הביוקטליסט העלתה כי היעילות עולה עם עליית ריכוז הסודיום אלגינאט בטווח של אחוז אחד עד שלושה.

עם זאת, ריכוזי sodium alginate הגבוהים מ-2% גורמים לירידה בתשואת ה-L-xylulose. בשימוש בריכוז של 2% של sodium alginate, נקבע כי ריכוז calcium chloride האופטימלי לאימוביליזציה ולתשואת L-xylulose הוא 0.3 molar. נבחנה היכולת לשימוש חוזר בביוקטליזטור.

בגרף זה, ייצור L-xylulose עבור שבעה מחזורי שימוש רציפים של ביוקטליזטורים של תאים שלמים מצומדים, מקובעים וחופשיים, מוצגים באפור כהה ובהיר, בהתאמה. למרות שהתפוקה המקסימלית של L-xylulose על ידי ביוקטליזטורים של תאים שלמים מצומדים ומקובעים נמוכה יותר מזו של מערכת תאים שלמים מצומדים וחופשיים, היכולת לשימוש חוזר משתפרת באמצעות קיבוע. בתום שבעה מחזורי שימוש רציפים, הביוקטליזטורים המקובעים שמרו על יציבותם, ושימרו 65% מתפוקת ה-L-xylulose המקורית.

לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הביוקטליזה לבחון את התנובות של ביוקטליזטורים רב-תאיים מלאים, ואת התגובות העיקריות המערבות קופקטורים.