הערכת Neurogenesis יסודי Xenopus עוברים באמצעות Immunostaining

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לאפשר הדמיה מהירה ונוחה של אוכלוסיות שונות של תאי עצב במוח העוברי המתפתח של קסנופוס. שיטות אלו יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוגנזה הראשונית, כגון התבוננות בתהליך הוויסות של התמיינות עצבית במערכת העצבים המרכזית של קסנופוס. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת תצפית בו זמנית על מאגר האב העצבי של תאי גזע, כמו גם מאגר עצבי ראשוני מובחן בתוך ניסוי יחיד.

כדי להתחיל בהליך זה, שאפו בזהירות חמישה עד עשרה עוברים מבקבוקון הזכוכית באמצעות פיפטה מפלסטיק או זכוכית מבלי להכניס בועות אוויר. העבירו את העוברים לתא ההרכבה והתבוננו תחת סטריאוסקופ. מלאו את תא ההרכבה בתמיסת ג'לטין כדי להבטיח את קשיחות גוש הקטע.

לאחר מכן, סדרו את העוברים זה לצד זה בעזרת זוג מלקחיים דקים. סמן את כיוון הראש על ידי ציור חץ על שפת החדר באמצעות טוש תואם קריוגני. עבור קבוצות מרובות של עוברים, רשום את התיאור של כל קבוצה על שפת החדר המתאים.

לאחר מכן, הניחו בזהירות את החדר אופקית בקופסת קצף מלאה למחצה בקרח יבש. סגור את המכסה ואפשר לתא ההרכבה להקפיא בזה אחר זה למשך חמש עד עשר דקות. לאחר מכן, המשיכו בהקפאה או שמרו דגימות קפואות בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך שבוע עד שבועיים לפחות מבלי לאבד את החיסוניות.

בהליך זה, הסר את גוש הדגימה הקפוא מהתא על ידי לחיצה על תחתית החדר באמצעות מקל קהה או אצבע. לאחר מכן, הוסף כמה טיפות של מדיום מקפיא רקמות על דיסק החזקת הדגימה. הרכיבו את בלוק הדגימה כשהקצה הקדמי של העוברים פונה כלפי מעלה והניחו לבלוק המותקן לעמוד בתוך תא הקריוסטט למשך כדקה, או עד שהמדיום מקפיא הרקמות הופך אטום.

התקן מיד את הדיסק המחזיק דגימה על המיקרוטום כשהצד התחתון של בלוק הדגימה פונה כלפי מעלה. חתוך חלק מבלוק הדגימה באמצעות להב כאשר בלוק הדגימה עדיין רך יחסית. לאחר מכן, השאירו את הדיסק המחזיק את הדגימה על המיקרוטום למשך חמש דקות לפחות כדי לאפשר לטמפרטורה שלו להגיע לשיווי משקל.

לאחר מכן, חתוך בהדרגה את גוש הדגימה כלפי מטה עד שראשי הראשנים נראים דרך הג'לטין השקוף. כדי להגביר את מהירות החיתוך, הגדל את עובי הקטע. עקוב אחר ביצועי הקריוסטט, כגון החדות והזווית של הלהב, כדי להבטיח שהחלקים הבאים נוצרים ברצועה ארוכה.

לאחר שראשי הראשנים נראים לעין, התאם את הגדרות הקריוסטט בחזרה לקדמותן, כדי לוודא שהפרוסות המוגמרות יכולות ליצור רצועות ואינן חופפות או נדבקות ללהב. לאחר מכן, המשיכו לקצץ עד שראשי הראשנים כמעט חשופים. צחצחו את כל חלקי השאריות על הבמה לפני שתתחילו לאסוף את חלקי הדגימה.

צרו כ-10 עד 15 חלקים ותנו להם ליצור רצועה ארוכה. הפוך את צלחת זכוכית הכיסוי העבה הצידה והסר בעדינות את הרצועה מהלהב בעזרת מברשת עדינה. לאחר מכן, סדרו אותו על הבמה כשהציר הארוך מקביל ללהב.

צרו 10 עד 15 חלקים ותנו להם ליצור רצועה ארוכה מבלי להישבר. זה אולי לא קל ודורש תרגול. טריק אחד הוא לנסות לא להפעיל את המהירות גבוהה מדי על גלגל היד.

במקום זאת, סובב את גלגל היד בזהירות ובאטיות. לאחר מכן, בחר שקופית אחת טעונה חיובית בטמפרטורת החדר ותייג אותה בעיפרון. לאחר מכן, לחץ אותו במהירות ובחוזקה על הרצועה כשהצד המסומן כלפי מטה.

לאחר מכן, הסר את השקופית מתא הקריוסטט. חזור על שלב זה כדי לסדר 20 עד 30 פרוסות במקביל בכל שקופית. יבש את הצדדים באוויר למשך 10 דקות, ולאחר מכן המשך מיד להליך הצביעה החיסונית או אחסן את השקופיות בקופסת שקופיות בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס עד שלושה עד שישה חודשים לפני ביצוע הליך הצביעה החיסונית.

כאן, אנו יכולים לראות את מישורי החתך המתאימים של המוח הקדמי, המוח האמצעי, המוח האחורי וחוט השדרה של ראשן קסנופוס אשר ישמשו כדי לספק הפניות מיקום לתמונות הבאות. החתכים המתאימים, שנצבעו באנטי-סוקס 3, טובולין אנטי-אצטיל ו-DAPI מראים את המיקומים היחסיים של מאגרי תאי גזע עצביים כמו גם נוירופילמנטים בתוך הצינור העצבי. והנה חתכי הרוחב המתאימים המוכתמים ב-Anti-MyT1 ו-DAPI המציגים את המיקומים היחסיים של הנוירונים הראשוניים המובחנים בתוך הצינור העצבי.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להבטיח זמן קירור מספיק עבור בלוק הדגימה בקרח יבש. אחרת, ייתכן שבלוק הדגימה לא יהיה קשה מספיק ולכן קשה לחתוך אותו.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח ההתפתחותיים לחקור את ההתמיינות העצבית במערכות העצבים המרכזיות של קסנופוס. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור קטעים, ולהתבונן במאגרים ספציפיים של תאים עצביים במערכת העצבים המרכזית של קסנופוס.