Name: הערכת Neurogenesis יסודי Xenopus עוברים באמצעות Immunostaining (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: למדו טכניקת immunofluorescence לויזואליזציה של אוכלוסיות נוירונים במערכת העצבים המרכזית של עוברי Xenopus. שיטה זו מאפשרת תצפית בו-זמנית של תאי גזע עצביים ונוירונים מובחנים בניסוי אחד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים פרופ &#39;מיכאל Klymkowsky באוניברסיטת קולורדו בבולדר ופרופ&#39; ננסי Papalopulu באוניברסיטת מנצ&#39;סטר למתן חביב אנטי Sox3 ואנטי Myt1 נוגדנים, בהתאמה. אנו מודים לחברים במעבדת Papalopulu לקבלת הצעות תובנה שלהם בפיתוח פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי שני קרן ריפוי Studentships כדי SZ ו JL, שתי מלגות הפרויקט מטעם קרן ריפוי כדי SZ / EA ו JL / EA בהתאמה, מענק תוכנית אחת של קרן Wellcome כדי EA (WT082450MA), ומענק אחד אסטרטגית לתמיכה מוסדית מן קרן Wellcome [097,820 / Z / 11 / Z].

<ol><li>De Robertis, E. M., Kuroda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal-ventral+patterning+and+neural+induction+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos.</a> Annual Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).</li>
<li>Wilson, S. W., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+steps+in+the+development+of+the+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Early steps in the development of the forebrain.</a> Dev Cell. 6, 167-181 (2004).</li>
<li>Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+embryonic+cells+will+become+nerve+cells+unless+told+otherwise%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Vertebrate embryonic cells will become nerve cells unless told otherwise.</a> Cell. 88, 13-17 (1997).</li>
<li>Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+activin+receptor+signaling+promotes+neuralization+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of activin receptor signaling promotes neuralization in Xenopus.</a> Cell. 77, 273-281 (1994).</li>
<li>Fainsod, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dorsalizing+and+neural+inducing+gene+follistatin+is+an+antagonist+of+BMP-4%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The dorsalizing and neural inducing gene follistatin is an antagonist of BMP-4.</a> Mech Dev. 63, 39-50 (1997).</li>
<li>Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsoventral+patterning+in+Xenopus%3A+inhibition+of+ventral+signals+by+direct+binding+of+chordin+to+BMP-4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4.</a> Cell. 86, 589-598 (1996).</li>
<li>Zimmerman, L. B., De Jesus-Escobar, J. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Spemann+organizer+signal+noggin+binds+and+inactivates+bone+morphogenetic+protein+4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Spemann organizer signal noggin binds and inactivates bone morphogenetic protein 4.</a> Cell. 86, 599-606 (1996).</li>
<li>Koyano, S., Ito, M., Takamatsu, N., Takiguchi, S., Shiba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus+Sox3+gene+expressed+in+oocytes+of+early+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The Xenopus Sox3 gene expressed in oocytes of early stages.</a> Gene. 188, 101-107 (1997).</li>
<li>Rogers, C. D., Harafuji, N., Archer, T., Cunningham, D. D., Casey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+Sox3+activates+sox2+and+geminin+and+indirectly+represses+Xvent2+expression+to+induce+neural+progenitor+formation+at+the+expense+of+non-neural+ectodermal+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Xenopus Sox3 activates sox2 and geminin and indirectly represses Xvent2 expression to induce neural progenitor formation at the expense of non-neural ectodermal derivatives.</a> Mech Dev. 126, 42-55 (2009).</li>
<li>Zhang, C., Basta, T., Jensen, E. D., Klymkowsky, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta-catenin%2FVegT-regulated+early+zygotic+gene+Xnr5+is+a+direct+target+of+SOX3+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The beta-catenin/VegT-regulated early zygotic gene Xnr5 is a direct target of SOX3 regulation.</a> Development. 130, 5609-5624 (2003).</li>
<li>Penzel, R., Oschwald, R., Chen, Y., Tacke, L., Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+early+embryonic+expression+of+a+neural+specific+transcription+factor+xSOX3+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization and early embryonic expression of a neural specific transcription factor xSOX3 in Xenopus laevis.</a> Int J Dev Biol. 41, 667-677 (1997).</li>
<li>Bellefroid, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-MyT1%2C+a+Xenopus+C2HC-type+zinc+finger+protein+with+a+regulatory+function+in+neuronal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">X-MyT1, a Xenopus C2HC-type zinc finger protein with a regulatory function in neuronal differentiation.</a> Cell. 87, 1191-1202 (1996).</li>
<li>Moody, S. A., Miller, V., Spanos, A., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+a+neuron-specific+beta-tubulin+in+frog+%28Xenopus+laevis%29%3A+a+marker+for+growing+axons+during+the+embryonic+period%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of a neuron-specific beta-tubulin in frog (Xenopus laevis): a marker for growing axons during the embryonic period.</a> J Comp Neurol. 364, 219-230 (1996).</li>
<li>Oschwald, R., Richter, K., Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+a+nervous+system-specific+class+II+beta-tubulin+gene+in+Xenopus+laevis+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Localization of a nervous system-specific class II beta-tubulin gene in Xenopus laevis embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Int J Dev Biol. 35, 399-405 (1991).</li>
<li>Chitnis, A., Henrique, D., Lewis, J., Ish-Horowicz, D., Kintner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+neurogenesis+in+Xenopus+embryos+regulated+by+a+homologue+of+the+Drosophila+neurogenic+gene+Delta%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Primary neurogenesis in Xenopus embryos regulated by a homologue of the Drosophila neurogenic gene Delta.</a> Nature. 375, 761-766 (1995).</li>
<li>Roberts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+functional+organization+of+spinal+neurons+in+developing+lower+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Early functional organization of spinal neurons in developing lower vertebrates.</a> Brain Res Bull. 53, 585-593 (2000).</li>
<li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+neurogenesis+in+Xenopus%3A+the+spatio-temporal+pattern+of+proliferation+and+cell+lineages+in+the+embryonic+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord.</a> Neuron. 3, 399-411 (1989).</li>
<li>Hirabayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt%2Fbeta-catenin+pathway+directs+neuronal+differentiation+of+cortical+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Wnt/beta-catenin pathway directs neuronal differentiation of cortical neural precursor cells.</a> Development. 131, 2791-2801 (2004).</li>
<li>Munji, R. N., Choe, Y., Li, G., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+regulates+neuronal+differentiation+of+cortical+intermediate+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling regulates neuronal differentiation of cortical intermediate progenitors.</a> J Neurosci. 31, 1676-1687 (2011).</li>
<li>Bonev, B., Stanley, P., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-9+Modulates+Hes1+ultradian+oscillations+by+forming+a+double-negative+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-9 Modulates Hes1 ultradian oscillations by forming a double-negative feedback loop.</a> Cell Rep. 2, 10-18 (2012).</li>
<li>Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-9+reveals+regional+diversity+of+neural+progenitors+along+the+anterior-posterior+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis.</a> Dev Cell. 20, 19-32 (2011).</li>
<li>Munoz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Xenopus+laevis+spinal+cord+requires+Sox2%2F3+expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells.</a> Dev Biol. , (2015).</li>
<li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Vleminckx, K., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fezf2+promotes+neuronal+differentiation+through+localised+activation+of+Wnt%2Fbeta-catenin+signalling+during+forebrain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fezf2 promotes neuronal differentiation through localised activation of Wnt/beta-catenin signalling during forebrain development.</a> Development. 141, 4794-4805 (2014).</li>
<li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Functional+Genome-Wide+In+Vivo+Screen+Identifies+New+Regulators+of+Signalling+Pathways+during+Early+Xenopus+Embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis.</a> PloS one. 8, e79469(2013).</li>
<li>Wang, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox3+expression+identifies+neural+progenitors+in+persistent+neonatal+and+adult+mouse+forebrain+germinative+zones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Sox3 expression identifies neural progenitors in persistent neonatal and adult mouse forebrain germinative zones.</a> J Comp Neurol. 497, 88-100 (2006).</li>
<li>Sabherwal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+apicobasal+polarity+kinase+aPKC+functions+as+a+nuclear+determinant+and+regulates+cell+proliferation+and+fate+during+Xenopus+primary+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The apicobasal polarity kinase aPKC functions as a nuclear determinant and regulates cell proliferation and fate during Xenopus primary neurogenesis.</a> Development. 136, 2767-2777 (2009).</li>
<li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cDNA%2FMorpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Dev Biol. 7, 107(2007).</li>
<li>Moreno, N., Retaux, S., Gonzalez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+expression+of+Pax6+in+Xenopus+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal expression of Pax6 in Xenopus forebrain.</a> Brain Res. 1239, 92-99 (2008).</li>
<li>Kay, B. K., Shah, A. J., Halstead, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Ca2%2B-binding+protein%2C+parvalbumin%2C+during+embryonic+development+of+the+frog%2C+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of the Ca2+-binding protein, parvalbumin, during embryonic development of the frog, Xenopus laevis.</a> J Cell Biol. 104, 841-847 (1987).</li>
<li>Park, B. Y., Hong, C. S., Weaver, J. R., Rosocha, E. M., Saint-Jeannet, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xaml1%2FRunx1+is+required+for+the+specification+of+Rohon-Beard+sensory+neurons+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Xaml1/Runx1 is required for the specification of Rohon-Beard sensory neurons in Xenopus.</a> Dev Biol. 362, 65-75 (2012).</li>
<li>Lea, R., Bonev, B., Dubaissi, E., Vize, P. D., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescent+in+situ+mRNA+hybridization+%28FISH%29+on+whole+mounts+and+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescent in situ mRNA hybridization (FISH) on whole mounts and sections.</a> Methods Mol Biol. 917, 431-444 (2012).</li>
<li>Canaria, C. A., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+optical+imaging+in+living+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Advanced optical imaging in living embryos.</a> Cell Mol Life Sci. 67, 3489-3497 (2010).</li>
<li>Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+laser+scanning+microscopy+as+a+tool+for+Xenopus+oocyte+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research.</a> Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).</li>
<li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pTransgenesis%3A+a+cross-species%2C+modular+transgenesis+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource.</a> Development. 138, 5451-5458 (2011).</li>
<li>Kovacevic Grujicic, N., Mojsin, M., Krstic, A., Stevanovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+human+SOX3+promoter%3A+identification+of+transcription+factors+implicated+in+basal+promoter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the human SOX3 promoter: identification of transcription factors implicated in basal promoter activity.</a> Gene. 344, 287-297 (2005).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myt1+and+Ngn3+form+a+feed-forward+expression+loop+to+promote+endocrine+islet+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Myt1 and Ngn3 form a feed-forward expression loop to promote endocrine islet cell differentiation.</a> Dev Biol. 317, 531-540 (2008).</li>
<li>Rogers, C. D., Archer, T. C., Cunningham, D. D., Grammer, T. C., Casey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox3+expression+is+maintained+by+FGF+signaling+and+restricted+to+the+neural+plate+by+Vent+proteins+in+the+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Sox3 expression is maintained by FGF signaling and restricted to the neural plate by Vent proteins in the Xenopus embryo.</a> Dev Biol. , 307-319 (2008).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

כאן אנו מדגימים שיטה נוחה ויעילה המאפשרת הדמית נוירוגנזה עיקרית בעוברי Xenopus. שיטה זו מאפשרת הערכה של סוגים שונים של תאים עצביים, כולל תאי גזע עצביים ועל נוירונים העיקרי מובחן באמצעות סמנים סוג תא ספציפי. הפרוטוקול הוא איתן בדרך כלל עם רמה גבוהה מאוד של שחזור. עבור עוברים נמצאים בשלבים טרום בקיעה (כלומר עד לשלב 28), אנו ידניים ממליצים להסיר את קרום vitelline לפני הקיבוע כמו זו מאפשרת עוברת כדי ליישר באופן מלא לפני הקיבעון. זה חשוב במיוחד בעת איסוף עוברים בשלבים מוקדמים יחסית (לפני הבקיעה), מאז עוברים כפוף קשה מאוד לארגן את הכיוון הרצוי בתוך החדר גובר. אנחנו לא חווינו אובדן של immunogenicity לאחר קיבוע MEMFA או PFA ומכאן צעד יחזור אנטיגן נוסף אינו הכרחי בפרוטוקול זה. בנוסף, זההליך immunostaining יכול להתבצע דגימות chromogenic / ניאון הכלאה באתרה. בתרחיש כזה, מומלץ לדלג על שלב הטיפול K פרוטאז במהלך הפרוטוקול הכלאה באתרו. לאחר תגובת מצע chromogenic / פלורסנט, דגימות ניתן לכבס עם TBS ו מוטבעות פתרון ג&#39;לטין דגים בצורה דומה דגימות קבועות MEMFA / PFA. בקבוקונים לדוגמא יכולים להיות מוגנים מפני אור על ידי עטיפת הבקבוקונים בנייר אלומיניום אם ניאון הכלאה באתרו יהיה צלם יחד עם מכתים immunofluorescent מאוחר יותר. במקרים מסוימים, עובר עלולים להתכווץ בצורה מוגזמת אחרי חדירת ג&#39;לטין. זו נגרמת ככל הנראה על ידי אחד קיבעון מספיק או מיצוי TBS-טריטון מספיק. ודא כי עוברי תוקנו PFA / MEMFA לפחות 2-3 שעות או רצוי לילה ב 4 מעלות צלזיוס. אם הבעיה נמשכת, להגדיל את זמן הכביסה של TBS-טריטון 3 עבור שעה 1. במהלך קריו-sectioנינג, הנוקשות של לחסום מדגם עשוי להשתנות כמו קבוצות שונות של ג&#39;לטין דגים יש מאפיינים שונים. בעיה זו ניתן לפצות באופן חלקי על ידי התאמת הטמפרטורה של microtome. טמפרטורה נמוכה יותר תגרום גוש &quot;קשה&quot; מדגם אולם מתחת לטמפרטורה נמוכה מוגזמת בלוק הדגימה נעשה פריך וקשה סעיף. חלק כיוונון עדין או בפועל (באמצעות בלוקי מדגם מדומים ללא עוברי) לפני כל חתך עשויה להועיל לפני השימוש על במיוחד דגימות יקרות. בעיה בדרך נתקלה במהלך החתך היא החלקים הדקים לפעמים נוטים להדביק על צלחת זכוכית העבה ולא להישאר שטוחים על במת הפלדה. זה יכול להיות במיוחד לשבש שכן הוא כל זמן קוטע את תהליך החתך הרציף. במקרים כאלה בדרך כלל נגרמים על ידי אחת משתי סיבות: תא הסעיף ו (בעיקר) צלחת הזכוכית העבה לא להיות קר מספיק, או מוגזם מטען סטטי על המכונית ואת operator, במיוחד במזג אוויר יבש. הראשון ניתן לפתור על ידי לכבות את הטמפרטורה של חדר הסעיף ולהשאיר צלחת הזכוכית בתוך תוספת זמן (אולי הלילה); ואת האחרון על ידי הארקת cryostat כראוי. חיבור משטח המתכת של cryostat לברז מתכת או מערכת צינורות מים דומה עשויה מתכת יכולה להיות דרך חלופית כדי לשחרר את המטענים סטטיים. לאחר כל שימוש, צלחת זכוכית עבה יש לשטוף היטב עם חומר ניקוי שאינו מאכל (כגון נוזל כלים), שטופים במים ultrapure, ריססו עם אתנול טהור, עטוף בנייר מגבת כדי להגן על פני השטח ואת הקצוות מפגיעה. הנוגדנים המפורטים בפרוטוקול הם ספציפיים בדרך כלל רק לעתים נדירות אנו נתקלים ספיחה לא ספציפית או אות רקע גבוהה. יצוין כי, אם באמצעות מומת חום בסרום עיזים / טלה כסוכן חסימה,-איון חום מוגזם (כמו דמיינו כתוצאה מהיווצרותם של נמהר פלאפי בנסיוב) צריךלהימנע ככל נמהר זה מאוד אטרקטיבי כדי נוגדנים משני ועשוי לתרום מקור רקע גבוה. זה אפשרי, ולפעמים רצוי, כדי לבצע מכתים כפול לדמיין אוכלוסיות שונות של תאים עצביים בו זמנית. כזה מכתים כפול אפשרי ובאופן כללי נותן תוצאות משביעות רצון עם השילובים הבאים: Sox3 / N-אמבט או Myt1 / N-אמבט. עם זאת, פעמים המכתימות של Sox3 ו Myt1 מסתבך בשל העובדה כי שני נוגדנים הם ממקור ארנב. בדקנו כמה ערכות תיוג ישירות נוגדנים, אולם לא נצפו תוצאות משביעות רצון (אות לרעש ברמה נמוכה), ככל הנראה בשל חוסר הגברת אות מ נוגדנים משני. גישה אפשרית אחת לעקוף בעיה זו תהיה להעלות קווים מהונדסים Xenopus, כמפורט להלן. אחת המגבלות העיקריות של פרוטוקול זה הוא, כי בעוד פרוטוקול זה יכול מספיק distinguish שתי ברכות עיקריות של תאים עצביים, כלומר, ברכת תא גזע העצבית להביע Sox3 ואת נוירונים הבדילו להביע Myt1, היא חסרו את היכולת לחשוף תת-אוכלוסיות שונות של נוירונים בדיל. כזה תת אוכלוסיות, אשר כוללות, אך אינם מוגבלות, הנוירונים מוטוריים עיקריים, interneurons, ואת עצב סנסורי, בדרך כלל מאופיינים הגנים סמנו דיפרנציאלי הביע שלהם 28-30. כאמור, התקדמות בפיתוח ססגוניות הכלאה באתרו בשילוב עם שיטת זיהוי immunofluorescence מבוסס נוגדנים בעוברי Xenopus יכולה למלא את הפער לחשוף תת-אוכלוסיות אלו של נוירונים בדיל לחקירת פוטנציאל 31. לחלופין, כפי הודגם במודל עכברים, זה היה גם להיות רצוי להעלות מערך מקיף יותר של נוגדנים מסוג התא ספציפי להבחין אוכלוסיות תאים שונות כגון Xenopus. זהגם ראוי להזכיר כי, כתוספת בשיטה זו, התקדמות הדמיה אופטיות ניתוח תמונה, כגון מיקרוסקופיה multiphoton, שחזור 3D, ופילוח, ניתן ליישם גם לאחר הערכות ראשוניות להשיג תצפיות מקיפות יותר של ביציות Xenopus וכן עוברי מוקדם, במיוחד תחת חיה הגדרת 32,33. לכן, כדי לעקוב אחר התפשטות, בידול, ותנועה של תאים עצביים בבעלי חיים, זה היה להיות רצוי להקים אחד או יותר קווים מהונדסים כי נמל חלבוני ניאון מונעים על ידי אמרגן סוג תא ספציפי כדי לאפשר תצפית חיים של אוכלוסיות תאים כאלה בתחילת Xenopus עוברי. הקמת X. laevis קו עם אמרגן נוירו-ספציפי β טובולין נהיגת tauGFP ושימושיה ספק דוגמא יפה 23,34. עם רצפי אמרגן מלאים הוא sox3 ו myt1 המאופיין בבעלי חוליות 35-37, זה shולד להיות יחסי קל להקים קווי מהונדס נוספים Xenopus שאמור לתרום בהרחבה לשתי קהילת Xenopus ושדה כללי יותר של מחקר נוירוגנזה העיקרי.

בבעלי חוליות, התפתחות מערכת העצבים המרכזית מורכבת מכמה שלבים ייחודיים עדיין רצופים. הצעד הראשון הוא אינדוקציה עצבית, כאשר תאי ectodermal נאיביים מפורטים כלפי גורל עצבי ולא גורל אפידרמיס. מספר מנגנוני ויסות מחוברים מעורבים בשלב זה ב Xenopus ומערכות מודל אחר 1,2. תהליך זה מתואם בעיקר על ידי גורמים מופרשים המיוצרים על ידי mesoderm הבסיסי, כגון chordin, שגולגולת, ו follistatin 3-7. לאחר אינדוקציה עצבית, קבוצת משנה של אבות עצביים לצאת ממעגל התא מתחיל להבחין בתהליך המכונה נוירוגנזה ראשוני. לא כל מבשרי נוירונים להבדיל בשלב זה. התאים העצביים מבשרי הנותרים ממשיכים להתרבות, ובכך לשמר את הברכה תא גזע הדרושים להמשך צמיחה של מערכת עצבים המרכזית ברחבי פיתוח לבגרות. אלה יחסי ציבורoliferating תאים עצביים מבשר מאופיינים הביטוי שלהם של Sry (Y באזור בקביעת מין) -box 3 (sox3) גן 8-11. אוכלוסיית אחרים של תאים, אשר היציאה מחזור התא ומתחייבים גורל הבדיל, מזוהים על ידי הביטוי של סמנים גן בידול, טובולין, בטא 2B בכיתה IIb (tubb2b, N-גיגית) ו גורם שעתוק המיאלין 1 (myt1) 12-14. כזה תאים עצביים הבדיל בסופו של דבר להצמיח קטגוריות שונות של נוירונים כולל, אך לא רק, מנוע, הבין, ואת עצב סנסורי ממוקם באזורים נפרדים בתוך הצינור העצבי 15-17. בעוד מאמצים משמעותיים הוקדשו לחשוף את מנגנוני ויסות ששולטים דפוסי גורל קביעת אירועי neuroectoderm הקדמי, פחות תשומת לב נעשה על בחקירת אירועי נוירוגנית המתרחשים בעקבותבשלב דפוסים ראשוני. ואכן, הולך אותות, תקנות תעתיק, כמו גם שינויים שלאחר translational מעורבים כולם בפעילות בשלב מאוחר זה, זה לשלוט מפרט עיתוי שושלת במהלך הנוירוגנזה 18-20. בדיקות נוספות לתוך המנגנונים האלה דורשות שיטה אמינה לדמיין בקלות להבחין אוכלוסיות שונות של תאים עצביים. הנ&quot;ל סמנים עצביים, כולל, Sox3, Myt1, ו- N-האמבטיה, יכולה לספק אמצעי לזיהוי אוכלוסיות תאים שונים אלה, ובכך לספק את היסודות הדרושים חושף את המנגנון הבסיסי של בידול עצבי 21-23. למרות תיוג הפרש של אוכלוסיות תאים עצביות הודגם באורגניזמים מודל שניים, מחקרים מעטים יחסית נצלו את מערכת Xenopus במלואם בעניין זה. זאת בעיקר בשל מחסור של נוגדנים תואמים באופן מהימן לזהות את neur השונהאוכלוסיות תאים onal בצינור העצבי. כאן, אנו מתארים שיטה המאפשר הדמיה והבחנה עצבית בעוברי Xenopus מוקדם באמצעות immunostaining, המספק גישה חזקה ונוחה לחקירת נוירוגנזה עיקרי Xenopus. פרוטוקול זה אמור לתת הדרכה מספקת לחוקרים המעוניינים בהתפתחות המוקדמת של מערכת העצבים המרכזית Xenopus בין שלב 26 ושלב 45.

<table><tbody><tr><td>גנטמיצין&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>טריס-בסיס</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746452</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793639</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RDD003</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>37% פורמלדהיד&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין מעור דגי מים קרים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>עובש בסיס חד פעמי 15 מ"מ x 15 מ"מ x 5 מ"מ Simport</td><td>VWR</td><td>EMB-200-015A</td><td></td></tr><tr><td>תבנית בסיס חד פעמית 7 מ"מ x 7 מ"מ x 5 מ"מ Simport</td><td>VWR</td><td>EMB-200-010K</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus שקופיות</td><td>ThermoFisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הקפאת רקמות (OCT)</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td>14020108926</tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica&nbsp;</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>כפפות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קרח</td><td></td><td></td><td></td>יבש</tr><tr><td>טריטון X-100&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 85-90 מעלות; C בלוק</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חום עט PAP</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>אצטון, צנצנת מכתים בדרגה</td><td></td><td></td><td></td>אנליטית</tr><tr><td>עם מדפי</td><td></td><td></td><td></td>שקופיות</tr><tr><td>קופסת מזון בלחיצה בגודל מתאים (בעלת יכולת להחזיק 1-2 צלחת 6 בארות בפנים)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>טובולין אנטי אצטילציה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7451</td><td></td></tr><tr><td>IgG נגד עכבר (H+L), F(ab')2&nbsp; שבר (Alexa Fluor&reg; &nbsp; 488 מצומד)</td><td>איתות תאים</td><td>4408</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-ארנב IgG (H+L), F(ab')2&nbsp; שבר (Alexa Fluor&reg; &nbsp; 555 מצומד)</td> <td>איתות תאים</td><td>4413</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; 647 איתות</td><td>תאי</td> פלואידין <td>8940</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>איתות תאים</td><td>4083</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade</td><td>Mountant Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכת neurogenesis יסודי<em&gt; xenopus</em&gt; עוברים באמצעות immunostaining

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

נוירוגנזה ראשונית היא תהליך דינמי ומורכב במהלך ההתפתחות העוברית המגדיר את הפריסה הראשונית של מערכת העצבים המרכזית. במהלך תהליך זה, חלק מתאי גזע עצביים עוברים התמיינות ומולידים את האוכלוסיות הראשונות של נוירונים ראשוניים מובחנים בתוך מערכת העצבים המרכזית המתהווה. מספר אורגניזמים מודל של בעלי חוליות שימשו כדי לחקור את המנגנונים של אפיון, דפוס והתמיינות של גורל תאים עצביים. בין אלה ניתן למצוא את הצפרדע האפריקאית, Xenopus, המספקת מערכת רבת עוצמה לחקירת המנגנונים המולקולריים והתאים האחראים לנוירוגנזה ראשונית בשל התפתחותה המהירה והנגישה וקלות המניפולציות העובריות והמולקולריות. כאן, אנו מציגים שיטה נוחה ומהירה להתבוננות באוכלוסיות השונות של תאי עצב בתוך מערכת העצבים המרכזית של Xenopus. באמצעות צביעת נוגדנים ואימונופלואורסצנציה על מקטעים של עוברי קסנופוס, אנו מסוגלים לצפות במיקומים של תאי גזע עצביים ונוירונים ראשוניים מובחנים במהלך נוירוגנזה ראשונית.

תוצאות הנציגים להראות בחתכים של עובר שלב 30 Xenopus ברמות שונות, כלומר המוח הקדמי, המוח התיכון, למוח האחורי, וחוט שדרה, מוכתמות נוגדנים שונים (איור 4). כאמור, Sox3 שכותרתו אוכלוסיית תא אב עצבית מאתרת הקרבה של לומן של הצינור העצבי, בעוד MyT1 שכותרתו נוירונים עיקרי בדיל נודד החוצה ולאתר ליד השכבה השולית (lamina בסיס) של הצינור העצבי. Anti-אצטיל-טובולין תוויות אקסונים בנוירונים הבדיל, אשר ניתן לצפות בתוך הצינור העצבי כולו. תופעות ספציפיות מציאת גן או ביטוי יתר היא שיטה בשימוש נרחב בנוירוביולוגיה להעריך האם מודולציה של ההתבטאות של גנים ספציפיים (ים) משבשת את הצמיחה והתבדלות של תאים עצביים. במקרים כאלה, גם Morpholinos (MOS) או DNA מבנה (ים) נושאת פרו<html> moter מונחה גן (הים) מוזרק לתוך אחד משני בלסטומרים בשלב שני תאים 23. לחלופין, הם יכולים להיות מוזרקים לתוך חדר המוח ואחריו electroporation, אשר יגרום מציאה או ביטוי יתר של גן רצוי (ים) 27. בשני המקרים, את ההשפעות תוגבלנה צד אחד של העובר, מה שהופך את הצד הנגדי של העובר כפי בקרה פנימית מטופל. לאחר קיבוע, חתך, ו immunostaining, ההשפעות של מציאת גן / יתר ביטוי הם לכמת באמצעות ספירת השוואת המספרים הסלולרי של אוכלוסיות שונות משני צדי עובר. על ידי צבירת נתונים אלה מכמה עובריים, ניתוח סטטיסטי יכול להתבצע. בתוצאות הנציג שלנו, לא הפרעות נעשו העוברים. דוגמאות של הפרעות גן והשפיע על אוכלוסיות תאים עצביות שונות ניתן למצוא הפניות 20,23. t &quot;FO: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig1.jpg" /> איור 1:. סדר עובר ואורינטצית העובש בסעיף (א) תיאור קריקטורה המראה את הרכבת ההרכבה, לציין את המגש סומן בתווית עם התאריך, במה, ואת הכיוון של עוברים. (ב) תמונה המציגה את המראה הטבעי של הרכבת ההרכבה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig2.jpg" /> איור 2:. האורינטציה ואת המיקום של גוש הג&#39;לטין על דיסק ההחזקה המדגמת (א) תיאור קריקטורה המראה את הרכבת בלוק סעיף, לב עוברי נמצא בעמדת &quot;ראש בראש&quot; ואת גוש הג&#39;לטין קבוע בחוזקה on כדי הדיסק ההחזקה מדגם ידי המדיום הקפאת רקמות בבסיס (ראה תרשים 2B). (ב) תמונה המציגה את המראה הטבעי של הרכבת בלוק הסעיף, לב ההצטברות של המדיום הקפאה רקמות בין גוש הג&#39;לטין ודיסק ההחזקה המדגמת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig3.jpg" /> איור 3:. רציף חתך (א) דגם של תא סעיף. דיסק החזקת המדגם צריך לסובב וקבוע למצב שצד העובר הוא פונה כלפי מעלה. אחרי כמה (6-10) חלקים, הרצועה הארוכה של אריחי סעיף רציפים מופרד בעדינות מן הלהב (הכחול) בעזרת מברשת בסדר, ואז פונה 90 מעלות על הצלחת החזקה. ואז זמני בחדר טעון חיובי שקופיתצמוד בלחץ על רצועת הסעיף פונה כלפי מטה ומייד הרים עד רצועות מוגמרות שנאספו. (ב) בדרך כלל, כל שקופית יכולה להכיל 2 קווים מקבילים של רצועות, כפי שמוצג. זכור להכין תיעוד מפורט על התווית לשקופית באמצעות עיפרון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig4.jpg" /> איור 4: חתך של שלב 30 X. laevis ראשנים מכתימים הרקמה העצבית, 20X. (א) שרטוטים המציינים את מיקומם היחסי (מוח קדמי, מוח תיכון, למוח אחורי, וחוט שדרה) של מטוסים בפרק ראשני Xenopus. (ב) על סמך חתכים מקבילים מוכתם אנטי Sox3 (אדום), אנטי-acetylated טובולין (Green), ו DAPI (הכחול), המראה את המיקום היחסי של ברכות תאי גזע עצביות כמו גם neurofilaments בתוך הצינור העצבי. (C) מקביל בחתכים מוכתמים אנטי MyT1 (אדום) ו DAPI (כחול), המראים את המיקום היחסי של נוירונים עיקרי מובחן בתוך הצינור העצבי. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

מאמר זה מציג שיטה נוחה ומהירה המאפשר הדמיה אוכלוסיות תאים עצביים שונים במערכת העצבים המרכזית של עוברי Xenopus באמצעות מכתים immunofluorescent על ​​הסעיפים.

הערכת Neurogenesis יסודי<em&gt; Xenopus</em&gt; עוברים באמצעות Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לאפשר ויזואליזציה מהירה ונוחה של אוכלוסיות שונות של תאי עצב במוח עוברי של xenopus בהתפתחות. שיטות אלו יכולות לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנוירוגנזה הראשונית, כגון תצפית על תהליך הבקרה של דיפרנציאציה עצבית במערכת העצבים המרכזית של xenopus. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת תצפית סימולטנית על מאגר תאי האב של תאי הגזע העצביים, כמו גם על מאגר עצבי ראשוני מובחן, במסגרת ניסוי יחיד.כדי להתחיל בהליך זה, שאבו בזהירות חמישה עד עשרה עוברים מתוך מבחנת הזכוכית באמצעות פיפטה מפלסטיק או מזכוכית, ללא הכנסת בועות אוויר. העבירו את העוברים לתא ההרכבה ובחנו אותם תחת סטריאוסקופ. מלאו את תא ההרכבה בתמיסת ג'לטין כדי להבטיח את קשיחותו של בלוק החיתוך.בשלב הבא, סדרו את העוברים זה לצד זה באמצעות פינצטה בעלת קצה דק. סמנו את כיוון הראש על ידי שרטוט חץ על שפת התא באמצעות טוש העמיד בקירור. עבור קבוצות מרובות של עוברים, רשמו את תיאור כל קבוצה על שפת התא המתאים.לאחר מכן, הניחו בזהירות את התא באופן אופקי בתוך קופסת קלקר המולאה למחצה בקרח יבש. סגרו את המכסה, ואפשרו לתאי הקיבוע להקפיא אחד אחד למשך חמש עד עשר דקות. לאחר מכן, המשיכו לביצוע חיתוך קריוגני (cryosectioning) או שמרו את הדגימות הקפואות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס למשך שבוע עד שבועיים לפחות, מבלי לאבד את האימונוגניות.בנוהל זה, הוצא את בלוק הדגימה הקפוא מהתא על ידי לחיצה על תחתית התא באמצעות מקל קהה או אצבע. לאחר מכן, הוסף מספר טיפות של מדיום להקפאת רקמה על דיסק החזקת הדגימה. הרכב את בלוק הדגימה כאשר הקצה האנטריורי של העוברים פונה כלפי מעלה, והשאר את הבלוק המורכב בתוך תא הקריוסטט למשך כדקה אחת, או עד שהמדיום להקפאת הרקמה הופך עכור.התקינו מיד את דיסקית החזקת הדגימה על המיקרוטום, כאשר הצד התחתון של בלוק הדגימה פונה כלפי מעלה. הסִירו חלק מבלוק הדגימה באמצעות להב בעודו רך יחסית. לאחר מכן, השאירו את דיסקית החזקת הדגימה על המיקרוטום למשך חמש דקות לפחות כדי לאפשר לטמפרטורה להגיע לשיווי משקל.לאחר מכן, קצצו את גוש הדגימה בהדרגה עד שראשי השלשומים יהיו גלויים דרך הג'לטין השקוף. כדי להגביר את מהירות הקיצוץ, הגדילו את עובי החתך. עקבו אחר ביצועי הקריוסטט, כגון חדות הלהב וזוויתו, כדי להבטיח שהחתכים הבאים ייוצרו כרצועה ארוכה.ברגע שראשי השבבים הופכים נראים, החזירו את הגדרות הקריוסטט למצב רגיל, כדי להבטיח שהפרוסות המוכנות ייווצרו כרצועות ולא יהיו חופפות או דבוקות ללהב. לאחר מכן, המשיכו בקיצוץ עד שראשי השבבים יהיו כמעט חשופים. הדיפו בעזרת מברשת שאריות של חתכים על הבמה לפני תחילת איסוף חתכי הדגימה.הכינו כ-10 עד 15 חתכים ותנו להם להיווצר כרצועה ארוכה. הפכו את לוח זכוכית הכיסוי העבה הצידה והסירו בעדינות את הרצועה מהלהב באמצעות מכחול בעל חוד דק. לאחר מכן, סדרו אותה על הבמה כך שהציר הארוך יהיה מקביל ללהב.הכינו בין 10 ל-15 מקטעים והניחו להם להיווצר כרצועה ארוכה ללא שברים. הדבר עשוי להיות מאתגר ודורש תרגול. טריק אחד הוא לנסות שלא להפעיל מהירות גבוהה מדי על הגלגל הידני.במקום זאת, סובב את גלגל היד בזהירות ובאיטיות. לאחר מכן, בחר זכוכית נושאת טעונה חיובית בטמפרטורת החדר וסמן אותה בעיפרון. לאחר מכן, לחץ אותה במהירות ובחוזקה על הרצועה, כאשר הצד המסומן פונה כלפי מטה.לאחר מכן, הוצא את השקופית מתא הקריוסטט. חזור על שלב זה כדי לסדר 20 עד 30 פרוסות במקביל על כל שקופית. ייבש את הצדדים באוויר למשך 10 דקות, ולאחר מכן עבור מיד להליך הצביעה האימונוהיסטוכימית או אחסן את השקופיות בקופסת שקופיות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס למשך שלוש עד שישה חודשים לפני ביצוע הליך הצביעה האימונוהיסטוכימית.כאן ניתן לראות את מישורי החיתוך המתאימים של המוח הקדמי, המוח האמצעי, המוח האחורי וחוט השדרה של ראשן xenopus, שישמשו כמסגרת התייחסות מיקום לתמונות הבאות. החיתכים הרוחביים המתאימים, שנצבעו ב-Anti-Sox 3, Anti-Acetylated Tubulin ו-DAPI, מראים את המיקומים היחסיים של מאגרי תאי הגזע העצביים וכן של נוירופילמנטים בתוך הצינור העצבי. וכאן מוצגים החיתכים הרוחביים המתאימים שנצבעו ב-Anti-MyT1 ו-DAPI, המראים את המיקומים היחסיים של הנוירונים הראשוניים המובחנים בתוך הצינור העצבי.ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה בשעתיים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הפרוצדורה, חשוב לזכור להבטיח זמן קירור מספיק עבור בלוק הדגימה בקרח יבש. אחרת, ייתכן שבלוק הדגימה לא יהיה קשיח מספיק, ובכך יהיה קשה לחתוך אותו.לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הנוירוביולוגיה ההתפתחותית לבחון דיפרנציאציה עצבית במערכות העצבים המרכזיות של Xenopus. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הכנת חתכים, וכן כיצד לצפות במאגרים ספציפיים של תאי עצב במערכת העצבים המרכזית של Xenopus.

assessing-primary-neurogenesis-in-xenopus-embryos-using-immunostaining

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אינדוקציה עצבית היא הצעד הראשון ביצירת המוח. זהו המנגנון שבאמצעותו הצומת של Hensen (מארגן), מורה רקמות סמוכות לאמץ גורל עצביים, כלומר להצמיח מערכת העצבים. וידאו זה מדגים assay לזירוז העצבית בעובר האפרוח.

Assay עבור אינדוקציה עצבית בעובר צ&#39;יק

ב electroporation ברחם היא שיטה ערך עבור transfecting ובתאים עצביים in vivo. בהתאם למיקום של אלקטרודות ואת timepoint ההתפתחותי של electroporation, תת מסוימים של תאים בקליפת המוח יכול להיות ממוקד. התאים הממוקדים אז יכול להיות מנותח in vivo או במבחנה על ההשפעות של שינוי גנטי.

ברחם electroporation ואחריו תרבות עצבית ראשונית ללימוד פונקציה ג&#39;ין בתת קבוצה של נוירונים קליפתיים

שליטה על ההתפשטות של תאי גזע הסומטיים היא גורם מרכזי פוגעות המחקר והשימוש בטיפול שלהם. כאן אנו מתארים מערכת באופן זמני להרחבת שליטה עצבית גזע תאים במהלך ההתפתחות ובגרות, אשר ניתן להשתמש כדי להגדיל את מספר הנוירונים שנוצרו במוח העכבר.

התרחבות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation או הזרקת Stereotaxic ויראלי

הסרטון מדגים שיטת צביעה אימונופלואורסצנטית המשמשת לבחינת נוירוגנזה בהיפוקמפוס הבוגר. בתחילה, אזור מוח עכבר עובר טיפול בנוגדנים ראשוניים המכוונים לחלבוני סמן הקשורים לנוירוגנזה בתאי אב עצביים. לאחר מכן, הוא מסומן עם נוגדנים משניים מתויגים עם fluorophores. לאחר מכן נצפה קטע המוח תחת מיקרוסקופ קונפוקלי כדי להבחין בין תת-סוגים שונים של תאי אב, בהתבסס על דפוסי הביטוי של שילובים שונים של חלבוני סמן.

טכניקת צביעה אימונופלואורסצנטית לזיהוי נוירוגנזה של היפוקמפוס בוגר

סרטון זה מדגים את ההליך להכתמת תאי גזע עצביים חדשים במקטעי רקמת מוח באמצעות שילוב EdU, ואחריו immunofluorescence כדי לדמיין חלבונים ספציפיים, שיפור ההבנה של דינמיקה התא והתפשטות.

צביעת אימונופלואורסצנטיות להדמיית תאי גזע עצביים מתרבים באזורי מוח עכבר

מאמר וידאו זה מדגים פרוטוקול מקיף לאיתור וכימות של כל שלבי הנוירוגנזה של ההיפוקמפוס במבוגרים באותו קטע רקמה. פיתחנו שיטה להתגבר על המגבלות של אימונופלואורסצנציה מרובה עקיפה המתעוררת כאשר נוגדנים מתאימים ממינים מארחים שונים אינם זמינים.

אימונוהיסטוכימיה ותיוג מרובה עם נוגדנים ממיני Host אותו ללימוד למבוגרים בהיפוקמפוס נוירוגנזה

כאן אנו מתארים הליך המבוסס על שימוש בחלקיקים לנטי-ויראלים לשינוי גנטי ארוך טווח של תאי גזע עצביים ו/או תאי אפנדימליים סמוכים להם בנישה הנוירוגנית הגחנית-תת-חדרית הבוגרת המאפשרת ניתוח נפרד של השפעות אוטונומיות ולא אוטונומיות של תאים, תלויות נישה על תאי גזע עצביים.

הנדסה גנטית יציבה ויעילה של תאי V-SVZ העכבר למבוגרים עבור הניתוח של הגזע עצבי נייד אוטונומי והשפעות חד אוטונומיות

בעוברי קסנופוס, תאים מגג הבלסטוקואל הם פלוריפוטנטיים וניתן לתכנת אותם ליצירת רקמות שונות. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לשימוש בצמחי גג בלסטוקואל דו-חיים כמערכת בדיקה לחקירת תכונות מפתח in vivo  ו-in vitro של התפתחות עצבית מוקדמת.

כמו תא גזע<em&gt; Xenopus</em&gt; Explants העובריים לחקר תכונות המוקדמות עצבי התפתחותית<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר גישה לניתוח התנהגות של מבוגרים בתאי גזע/מחולל קדמון בתגובה לטיפול כימוגנטי של מעגל מקומי ספציפי עצביים.

Assaying בוויסות מעגל ספציפי של היפוקמאל מבוגרים תאים מקודמן עצבי

אנו מציגים פרוטוקול דו-חלקי המשלב הדמיה של סידן פלורסנט עם היברידיזציה באתרו, ומאפשר לניסויים לתאם דפוסים של פעילות הסידן עם פרופילי ביטוי גנים ברמה של תא אחד.

סידן פלואורסצנטי הדמיה ובעקבות היברידיזציה באתרו לאפיון עצבי בלתי מבשר בקספוס זריזה

מאמר זה מציג ארבע מהטכניקות הנפוצות ביותר להדמיית תאים חיוביים של BrdU למדידת נוירוגנזה בוגרת בחולדות. עבודה זו כוללת הוראות להכנת מגיבים, ניהול אנלוגי של תימידין, פרפוזיה של שריר הלב, הכנת רקמות, תגובה אימונוהיסטוכימית של פרוקסידאז, אימונופלואורסצנציה, הגברת אותות, צביעה נגדית, הדמיית מיקרוסקופיה וניתוח תאים.

טכניקות אימונוהיסטוכימיה לניתוח התפשטות תאים ונוירוגנזה בחולדות באמצעות BrdU אנלוגי של תימידין

למדו טכניקת immunofluorescence לויזואליזציה של אוכלוסיות נוירונים במערכת העצבים המרכזית של עוברי Xenopus. שיטה זו מאפשרת תצפית בו-זמנית של תאי גזע עצביים ונוירונים מובחנים בניסוי אחד.

הערכת Neurogenesis יסודי

גלה סרטונים נוספים