בידוד ואפיון של ראש וצוואר קשקש Cell Carcinoma-אוכלוסיית מאפייני תאי גזע לאחר

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד תאי גזע סרטניים מקרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר או קווי תאי HNSCC. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הטיפול בסרטן לגבי אופן השימוש בכימותרפיה כדי להתגבר על עמידות לקרינה של הגידול. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת בשילוב של סמנים כדי להשיג ספציפיות גבוהה בתאי גזע סרטניים משורות תאי HNSCC.

הדגמת ההליך תהיה על ידי Prescillia Battiston-Montagne, הטכנאית שלנו ומריון גילורמיני, דוקטורט מהמעבדה שלי. כדי לבחור אוכלוסיית צד של תאים דמויי גזע סרטניים על ידי בדיקת פליטת צבע של Hoechst יש לסמן תחילה צינור חרוטי אחד Hoechst ואחד Hoechst ו-Verapamil. לאחר מכן, שטפו תרבית תאים HNSCC עם PBS סטרילי ואחריו תוספת של מיליליטר אחד של Tripsyn EDTA.

לאחר שלוש דקות ב-37 מעלות צלזיוס, עצרו את התגובה עם מדיום תרבית תאים טרי וספרו את התאים. לדלל את התרבית לאחת פעמים 10 עד התאים השביעיים למיליליטר ולהשלים את מדיום קו תאי ההורים. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר לצינור Hoechst ו-Verapamil וארבעה מיליליטר תאים לצינור Hoechst.

לאחר מכן, ערבבו בעדינות 10 מיקרוליטר של תמיסת ורפמיל הידרוכלוריד של חמישה מילי-מולרית לתוך דגימת הוכסט ווראפמיל ואחריה חמישה מיקרוליטרים של הוכסט לכל אחד כפול 10 עד התאים השישיים לשני הצינורות. לאחר מכן מכסים את הדגימות בנייר אלומיניום ומניחים אותן בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר 90 דקות עם ערבוב עדין כל 15 דקות צנטריפוגה את הצינורות והשעיה מחדש את הכדורים בשני מיליליטר PBS.

לאחר צנטריפוגה מרכזית, השעו מחדש את גלולת Hoechst ו-Verapamil ב-500 מיקרוליטר של יודיד פרופידיום ב-PBS ואת גלולת Hoechst בארבעה מיליליטר מאותו הדבר. כעת סנן את הדגימות דרך מסננות תאים של 70 מיקרון לתוך צינורות FACS כדי להסיר אגרגטים ולהניח את הדגימות על קרח מוגן מפני אור. לאחר מכן, טען את דגימת Hoechst על ציטומטר הזרימה ופתח את חלון גליון העבודה הגלובלי בתוכנת ציטומטר הזרימה.

לחץ על Dot Plot כדי ליצור גרף בגליון העבודה הגלובלי ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לבחור את פרמטרי הפיזור קדימה וצדדית. צור פיזור צדדי רחב על ידי גובה פיזור צדדי, תרשים נקודה באותו אופן ולאחר מכן לחץ על שער מצולע כדי ליצור אזור P1 בגרף השני, לבחור את התאים הבודדים ולהבחין בין הכפילים. לאחר מכן, צור אזור Hoechst אדום על ידי עלילת נקודות שטח Hoechst כחולה ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על התאים כדי להדגיש את אוכלוסיית P1.

לאחר מכן צור אזור P2 כדי לבחור את אוכלוסיית התאים השלילית של צבע Hoechst המופיעה כזרוע צדדית משמאל לאוכלוסיית התאים העיקרית ולאסוף 10,000 מאירועי הדגימה של Hoechst. כדי לוודא ששער P2 המייצג את אוכלוסיית הצד ממוקם כהלכה, אסוף גם 10,000 אירועי דגימה של Hoechst ו-Verapamil. האוכלוסייה הצדדית אמורה להיעלם.

לאחר מכן מיין את אוכלוסיית הצד של תאים שליליים בצבע הוכסט לצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של מדיום תאים דמוי גזע סרטני שלם. בסוף המיון, סובב את התאים והשהה מחדש את כדור אוכלוסיית הצד במיליליטר אחד של מדיום תא דמוי גזע סרטני שלם טרי. לאחר מכן ספרו את התאים וזרעו אותם במספר המתאים לתוך בקבוק תרבית תאים חדש.

כדי לבחור את תת-הקבוצה CD44-high/ALDH-high מתאי אוכלוסיית הצד הממוינים, סמן תחילה שבעה צינורות חרוטיים סטריליים של 15 מיליליטר כפי שמצוין. לאחר מכן, יש לדלל את התאים הממוינים ל-10 פעמים 10 לשבעה תאים למיליליטר במדיום תאי גזע ו-100 מיקרוליטר תאים לצינורות CD44-APC ו-IGG1-APC הלא מוכתמים וארבעה מיליליטר תאים לצינור ALDH ו-CD44-APC, כולם על קרח. סובב את התאים והשהה מחדש את כדורי CD44-APC ו-IGG1-APC הלא מוכתמים ב-100 מיקרוליטר של מאגר אחד מערכת ALDEFLUOR.

לאחר מכן הוסף חמישה מיקרוליטרים של מעכב ALDH DEAB לצינורות ALDH ו-DEAB ו-ALDH DEAB ו-CD44-APC. השעו מחדש את התאים בצינור ALDH ו-CD44-APC בארבעה מיליליטר של מגיב C המכילים ארבעה מיליליטר של מאגר אחד ו-20 מיקרוליטר של המגיב מהערכה והעבירו מיד 100 מיקרוליטר של תאים אלה לצינורות ALDH, ALDH ו-DEAB, ו-ALDH DEAB ו-CD44-APC. לאחר מכן הניחו את כל הצינורות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, מוגנים מפני אור, ערבוב הדגימות לאחר 15 דקות על ידי מערבולת עדינה.

בסוף הדגירה, צנטריפוגה את כל הדגימות והשליכו את הסופרנטנטים. לאחר מכן הנח את כל הצינורות על קרח והשהה מחדש את גלולת ALDH ו-CD44-APC בארבעה מיליליטר של מאגר A, כדורי CD44-APC ו-ALDH DEAB ו-CD44-APC ב-100 מיקרוליטר מאותו הדבר. השעו מחדש את גלולת IGG1-APC ב-100 מיקרוליטר של מאגר B ואת צינורות ALDH ו-ALDH ו-DEAB הלא מוכתמים ב-100 מיקרוליטר של מאגר אחד.

לאחר 10 דקות, סובב שוב את כל הדגימות ואחריו שטיפה ב-1 מיליליטר של מאגר אחד עבור כל הדגימות למעט דגימת ALDH ו-CD44-APC, שנשטפת בארבעה מיליליטר של מאגר אחד. לאחר הצנטריפוגה השנייה, השעו מחדש את כל הכדורים במיליליטר אחד של מאגר טרי למעט דגימת ALDH ו-CD44-APC, המושעה מחדש בארבעה מיליליטר של מאגר אחד. כעת טען את צינור ALDH ו-CD44-APC על ציטומטר הזרימה וצור APC על ידי עלילת נקודות כדי לדמיין את האוכלוסייה המוכתמת כפולה.

לאחר מכן, טען את צינור ה-ALDH כדי ליצור שער לתאים בעלי ALDH גבוה. התאים החיוביים אמורים להיעלם כאשר צינור ALDH ו-DEAB נטען. באותו גרף, צור שער שני באמצעות צינורות CD44-APC ו-IGG1-APC כדי לבחור את התאים הגבוהים CD44.

התאים החיוביים ייעלמו כאשר צינור IGG1-APC נטען. לאחר מכן טען את צינורות ALDH ו-CD44-APC ו-ALDH DEAB ו-CD44-APC כדי ליצור שער שלישי הכולל את התאים הגבוהים CD44/ALDH. השתמש בצינור ALDH-CD44 בעל צביעה כפולה כדי למקם את השער האחרון על התאים החיוביים הכפולים.

לאחר מכן מיין את התאים בעלי CD44 גבוה/ALDH גבוה לצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של מדיום תאים דמוי גזע סרטני שלם האוסף את התאים הנמוכים CD44 / ALDH נמוך במיליליטר אחד של מדיום תרבית תאים שלם כרצונך. לאחר המיון השני, יש להצמיד את התאים הגבוהים CD44 / ALDH לתוך בקבוק תרבית תאים מתאים עם מדיום תאים דמוי גזע סרטני שלם בחממת תרבית התאים למשך 18 עד 24 שעות. כאשר התאים נצמדו לתחתית הבקבוק, החליפו את מדיום התרבות והחזירו את הבקבוק לחממה.

כדי לאשר את פוטנציאל הגידול של התאים הגבוהים CD44 / ALDH גבוהים, נסה את השכבה החד-שכבתית דמוית גזע הסרטן כפי שהודגם כדי להשיג תרחיף של תא בודד ולהעביר פעם אחת 10 לששת התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. לאחר סיבוב התאים, יש להשעות מחדש את הגלולה במדיום נמוך בסרום בתוספת גורם גדילה אפידרמלי אנושי רקומביננטי הפרין ו-B27 ולדגור את התאים בצלחת פטרי בעלת עיגון נמוך בחממת תרבית התאים עד שנצפו כדורי הגידול במיקרוסקופיה אופטית. כאשר המיון מבוצע לראשונה על קו תאים חדש, יש צורך לאשר את פוטנציאל הגידול של קו התאים כפי שמעידה יכולתו ליצור כדורי גידול בתווך נטול סרום במבחנה.

יתר על כן, QPCR אמור להדגים ביטוי גבוה של בטא-קטנין וסמני תאים דמויי גזע אחרים על ידי תאים גבוהים CD44 / ALDH גבוהים. התאים בעלי CD44 גבוה/ALDH גבוהים אמורים להיות מסוגלים גם ליצור גידולים באתרם כאשר הם מוזרקים בכמויות נמוכות בהשוואה לתאים נמוכים CD44/ALDH נמוכים. לאחר השליטה, כל מיון תאים אמור להיות מסוגל להסתיים תוך חמש שעות אם הם מבוצעים כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להגן על הדגימות המסומנות בפלואורוכרום מפני חשיפה ישירה לאור. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מבחני נדידת פלישה כדי לענות על שאלות נוספות לגבי מעורבותם של תאי גזע סרטניים בתהליך גרורתי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הסרטן לחקור את מנגנוני בריחת הגידול בסרטן HNSCC.

לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד תאי גזע סרטניים מקווי תאי HNSCC באמצעות ניתוח רב-פרמטרי, זרימה ציטומטרית ומיון תאים. אל תשכח שעבודה עם תאי גידול ושילוב גורמי DNA עלולה להיות מסוכנת ביותר וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת חלוק מעבדה וכפפות בעת ביצוע הליך זה.