שיטה מהירה עבור עיבוד דם כדי להגדיל את התשואה של רמות הפפטיד פלזמה בדם אנושי

המטרה הכוללת של שיטת RAPID זו היא לשפר את התפוקה של הורמוני פפטיד אנדוגניים שיימדדו בדם אנושי. לאחרונה הוקמה שיטת RAPID לשימוש בחולדות, ומתאימה גם לשימוש בדם אנושי. שיטת RAPID משפרת את היבול, ומאפשרת זיהוי הצורה המולקולרית הנכונה של פפטיד אנדוגני.

שיטת RAPID קלה לשימוש. עם זאת, שיטת RAPID גוזלת זמן רב יותר ויקרה יותר בהשוואה לדגימת דם סטנדרטית. אז זה עשוי להיות ישים יותר במסגרת המחקר.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן לדילול בזמן של הדגימות כמו גם לפליטה יש חשיבות רבה כדי להבטיח רמת פפטיד תקינה. אסוף דם ורידי בזמן סטנדרטי לאחר צום לילה מווריד האמה. ולעבד על פי נהלים סטנדרטיים, או בשיטת RAPID.

הנחו את הנבדקים לא להתאמן או לעשן לפני שאיבת הדם. לעיבוד סטנדרטי, יש לאסוף דם בצינורות מצוננים המכילים EDTA וצנטריפוגה תוך 10 דקות ב-3000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. אספו את הסופרנטנט, ושמרו אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף על ידי בדיקה רדיו-אימונולוגית.

לעיבוד מהיר, יש לדלל מיד דם אחד עד 10, במאגר RAPID קר כקרח. PH שלוש נקודה שש, המכילה אפס נקודה אחת אמוניום מולארי. אפס נקודה חמש נתרן כלורי מולארי, ומעכבי אנזימים.

תוך 10 דקות, צנטריפוגה של דגימת ה-RAPID ב-3000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ואספו את הסופרנטנט באמצעות פיפטה. לאחר מכן, טען מחסניות כרומטוגרפיה עם 100% אקטיטונטריל, במהירות של 10 מיליליטר לדקה. לאחר שיווי משקל עם 0.1% טריפלואורואצטי, או TFA.

טען עם דגימת RAPID supernatant, בקצב קבוע של מיליליטר לדקה, באמצעות משאבת מזרק. לאחר שטיפת המחסניות בשלושה מיליליטר של 0.1% TFA, ב-10 מיליליטר לדקה, יש להוציא לאט את דגימת ה-RAPID עם שני מיליליטר של 70% אצטוניטריל המכילים 0.1% TFA, בשני מיליליטר לדקה. יבש את הדגימות שנפלטו באמצעות צנטריפוגה ואקום, ואחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס, עד לעיבוד נוסף על ידי בדיקה רדיואימונולוגית.

השג יוד 125 פפטידים אנושיים עם תווית רדיו. שמור את הפפטידים בצורת אבקה עד לניסוי. לאחר מכן יש לדלל טרי בחומצה אצטית של 0.1%.

לעיבוד סטנדרטי, מיד לאחר שאיבת הדם, לתוך צינורות מקוררים המכילים EDTA, העבירו מיליליטר אחד של דם בשפופרת עם 50 מיקרוליטר של תווית רדיו, המכילה 3000 עד 6000 CPM. לעיבוד מהיר, העבירו מיליליטר אחד של דם המכיל EDTA לתוך צינור המכיל תשעה מיליליטר של מאגר RAPID, ו-500 מיקרוליטר של תווית רדיו מכילים 30,000 עד 60,000 CPM. בשל הדילול של אחד עד 10, השתמש בנפח גבוה פי 10 של תווית רדיו לעיבוד מהיר.

מיד לאחר יישום השלבים השונים של שיטת RAPID, הערך את ההתאוששות של פפטידים המסומנים רדיואקטיבית באמצעות מונה גמא. אין לייבש את הדגימות על ידי צנטריפוגה ואקום, ושימו לב לאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. לצורך מדידה, העבירו את הסופרנטנט לצינורות המתאימים למונה הגמא.

והעריכו את הספירה לדקה. מדוד את כל הסופרנטנט בדגימות סטנדרטיות. בדגימות RAPID, נתח עשירית מהנפח הכולל כדי להשיג כמות דומה של תווית רדיו בשימוש.

כסטנדרט של 100%, השתמש בשתי דגימות עם 50 מיקרוליטר של יוד 125 פפטיד עם תווית רדיו שאינן עוברות עיבוד. מדוד את הרדיואקטיביות של כל הדגימות בו זמנית. הוצא דם, בצינורות המכילים EDTA מקורר, והעביר מיליליטר אחד לצינורות המכילים 200 מיקרוליטר של גרלין אציל עם תווית רדיו, המכילים 15,000 עד 20,000 CPM, לעיבוד סטנדרטי.

לעיבוד מהיר, העבירו מיליליטר אחד של דם לתוך צינור המכיל תשעה מיליליטר של חיץ מהיר, ו-200 מיקרוליטר של גרלין אציל המסומן ברדיו המכיל 15,000 עד 20,000 CPM. לאחר מכן, עבד דגימות כמו קודם. לניתוח נוסף על ידי HPLC שלב הפוך, טען ישירות את הדגימות על עמודת קשר יציבה C18 מאוזנת ב-17% אצטוניטריל במים בתוספת 0.1% TFA.

לאחר חמש דקות של שיווי משקל, השתמש בשיפוע מ-17 עד 40% אצטוניטריל, כדי להוציא את הדגימה תוך 40 דקות, במיליליטר אחד לדקה. אסוף שברים של מיליליטר אחד בכל דקה, ונתח רדיואקטיביות באמצעות מונה גמא. בניסוי נפרד, טען 200 מיקרוליטר של גרלין אציל עם תווית רדיו המכילים 15,000 עד 20,000 CPM ישירות על העמודה ובצע HPLC כמו קודם.

לבדיקה רדיו-אימונולוגית, יש להפשיר סופרנטנטים קפואים ואבקה מיובשת בוואקום בטמפרטורת החדר. מיד לפני הבדיקה הרדיו-אימונולוגית, יש להשעות מחדש דגימות RAPID יבשות במים מזוקקים כפולים, בהתאם לנפח המקורי של הפלזמה. העריכו קיספפטין וגרלין כולל כמו גם אציל גרלין, באמצעות בדיקות רדיואימונואס מסחריות על פי פרוטוקולי היצרן.

השתמש בצינורות בורוסיליקט המאפשרים היווצרות פלטה יציבה. ביום הראשון, דגרו את הדגימות עם מאגר בדיקה, ואטיבודי ראשוני, בדילול שסופק על ידי היצרן לתקופה של 24 שעות. ביום השני, הוסיפו את עוקב היוד 125, מערבולת ודגרו לתקופה של 24 שעות.

ביום השלישי, הוסף את המגיב המשקע, המערבולת והדגירה לפי המלצת היצרן. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינורות ב-3,000 גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנטים וספור את הרדיואקטיביות בפלטות, באמצעות מונה גמא.

חשב את ה-desacyl ghrelin, כהפרש של סך הגרלין פחות acyl ghrelin. מעריך את יחס האציל, דסציל גרלין, על ידי צלילה של אציל על ידי דסציל גרלין עבור כל דגימה בודדת. במידת האפשר, עבד את כל הדגימות באצווה אחת, כדי למנוע שונות בין בדיקות.

עיבוד דם מהיר מגדיל את התפוקה של יוד 125 פפטידים מסומנים ברדיו בדם אנושי, בהשוואה לעיבוד דם סטנדרטי. לאחר עיבוד דם סטנדרטי, ההתאוששות של פפטידים עם תווית רדיו נעה בין 48% ל-68% בתשעה פפטידים. עיבוד מהיר שיפר את התפוקה בכל הפפטידים המסומנים ביוד 125, עם התאוששות שנעה בין 71% ל-98%המוצג כאן פרופיל הפליטה של יוד 125 המסומן אציל גרלין בדם אנושי לאחר עיבוד דם סטנדרטי או מהיר.

לאחר עיבוד מהיר, יוד 125 שכותרתו גרלין חמק במיקום הצפוי. בעוד שלאחר ההליך הסטנדרטי, נצפתה שיא מוקדם יותר. ככל הנראה מקביל ל-desacyl ghrelin.

זה ייצג פירוק של 62% של הפפטיד. עיבוד דם מהיר משפר את יחס האציל והדסציל גרלין בהשוואה לעיבוד סטנדרטי. לאחר עיבוד מהיר, יחס האציל והדסציל גרלין בדם של נבדקים במשקל תקין היה אחד לשלוש.

בהשוואה לאחד עד 23 לאחר עיבוד דם סטנדרטי. תוצאות דומות נצפו בתנאים של אנורקסיה והשמנת יתר. עיבוד דם מהיר מביא לעלייה ברמות הקיספפטין האנדוגניות בדם בהשוואה לעיבוד סטנדרטי.

הן בנבדקים אנורקסיים והן במשקל תקין, רמות הקיספפטין האנדוגניות במחזור הדם היו גבוהות משמעותית לאחר RAPID בהשוואה לעיבוד סטנדרטי. ההבדל לא הגיע למשמעות בתנאים של השמנת יתר. לאחר שליטה וביצוע נכון, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות משעה.

שיטה זו חשובה במיוחד כאשר הריכוז הצפוי של הפפטיד נמוך, או שההבדלים בין הקבוצות קטנים. לא ניתן לתת המלצה כללית לפפטידים. יש לבדוק את התועלת הפוטנציאלית של כל פפטיד פעם אחת בהתחלה.

טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחומים שונים לחקור את היבול וחשוב מכך, את הצורה המולקולרית הנכונה של הורמוני פפטיד אנדוגניים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליישם את שיטת RAPID לעיבוד דם בבני אדם.