ניתוח צומת glycan: גישה מלמטה למעלה כדי glycomics
22 במאי 2016
מאמר זה מציג צורה משופרת של טכניקת גליקומיקה חדשה מלמטה למעלה שנועדה לנתח את פרופיל ההרכב המאוגד של גליקנים בנוזלים ביולוגיים לא מפוצלים באמצעות פירוק כימי של גליקנים לחד-סוכרים ספציפיים לקישור המרכיב אותם לזיהוי על ידי GC-MS. יישומים פוטנציאליים כוללים גילוי מוקדם של סרטן והפרעות אחרות הנוגעות לגליקן.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לפרק את כל הגליקנים בדגימה ביולוגית תוך שימור הרכב חד סוכר ומידע על קישור. הקלה על זיקוק של תכונות גליקן מעניינות כגון ציאלציה חולה וחציית N-אצטיל גלוקוזאמין לאותות אנליטיים בודדים. שיטה זו יכולה לעזור לענות ישירות על שאלות מפתח בתחום הגליקומיטים כגון אילו תכונות גליקן ייחודיות משתנות במצבי מחלה מסוימים.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתכונות גליקן הנוטות להשתנות במחלה כגון הסתעפות בטא 1-6 וקורפולקוסולציה מזוקקות לאותות אנליטיים בודדים במקום להתפשט על פני מספר גליקנים שלמים. בדרך כלל, אנשים צריכים לעשות את השיטה הזו באמת להיאבק עם yeilds גרועים של N-Acetylcysteines עקב עיבוד לא נכון של גליקנים טריים שעברו פרמתיליזציה. הכינו את הדגימות, על ידי העברת תשעה מיקרו-ליטר מכל אנליט ביולוגי למבחנות נפרדות של 1.5 מיליליטר.
לכל דגימה, הוסף מיקרו-ליטר אחד של מים נטולי יונים ו-270 מיקרו-ליטר של טוהר גבוה של DMSO. ומערבבים במרץ על ידי מערבולת שלהם. לאחר הכנת הדגימה, הרכיבו את עמודות הספין הטעונות בנתרן הידרוקסיד כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
באמצעות מזרק אנליטי, הוסף 105 מיקרו-ליטר יודומתאן לכל אנליט וכסה מיד את הצינורות. מערבולת יסודית של הדגימות. נתק את עמודי הסיבוב שהוכנו קודם וצנטריפוגה למשך 15 שניות ב-2, 400 Gs.לאחר השלכת צינורות המאגר והאמידים, חבר מחדש את העמודים והנח אותם בתוך סט צינורות טרי, המסומן עבור כל אנליט.
השתמש בראש צינור של 1000 מיקרו-ליטר כדי להעביר כל תמיסת אנליט לעמודת הסיבוב המתאימה. לאחר הוספת תמיסת האנליט, לחץ כשני מיליליטר מקצה ראש צינור של 200 מיקרו ליטר והשאיר את הקצה בעמודה לשימוש כמערבל. השתמש בקצות ראש הצינור כדי לערבב בעדינות את העמודים אחת לשתיים-שלוש דקות.
לאחר 11 דקות, נתק את העמודים וצנטריפוגה למשך 15 שניות ב-2, 400 Gs.הסר מיד את עמודי הסיבוב והנח אותם בצינורות מאגר חדשים, תוך חיסכון בתמיסת הזרימה אך השלכת התקעים. לעמודות, הוסף 300 מיקרו-ליטר אצטוניניטריל וצנטריפוגה אותם 30 שניות ב-9, 600 גרם.כעת העבירו את תמיסות הזרימה הפרמתיליות הראשונות למבחנות זכוכית סילניות המכילות 3.5 מיליליטר של מאגר נתרן פוספט. ודא שהסופרננד המועבר ברור ושלא מועבר חומר מוצק.
כדור לבן קטן ייווצר בתחתית צינורות הפלסטיק. הימנע מהעברת חומר מוצק ברור. כישלון לעשות זאת יגרום לתשואות ירודות של תווי N-אצטילציסטאין-גלוקוזאמין גליקן.
מערבול מיד כל דגימה באצווה לאחר העברת כל הדגימות. לאחר מכן שלב את תמיסות זרימת האצטוניניטריל עם שאר הנוזל במבחנות המתאימות. שוב, הימנע מהעברת שאריות מוצקות ולבנות במהלך שלב זה.
מכסים, מנערים ומערבלים את התמיסות המשולבות מיד לפני המעבר לדגימה הבאה. לאחר פרמתילציה, הוסף 1.2 מיליליטר כלורופורם לכל מבחנה בתוך מכסה אדים. לאחר מכן מכסים את הצינורות ומערבבים את התוכן במרץ.
כדי להפריד בין השכבות, צנטריפוגה קצרה את התמיסות ב-3,000 Gs.השתמש בראש צינור מרעה כדי לחלץ ולהשליך את רוב השכבה המימית העליונה ולהשאיר כשלושה מיליליטר מהשכבה מאחור. הוסף 3.5 מיליליטר ממאגר הנתרן פוספט המולרי 0.2 ולאחר מכן מכסה, מערבב וצנטריפוגה את המבחנה. בצע שלב מיצוי נוזלי/נוזלי זה בסך הכל שלוש פעמים.
השארת כמיליליטר אחד מהשכבה המימית במיצוי הסופי. כעת השתמש בראש צינור מרעה נקי בסילאן כדי להעביר בזהירות את שכבת הכלורופורם למבחנה נקייה ומסומנת מזכוכית סילנית כמתואר בפרוטוקול הטקסט. בסעפת אידוי שחוממה מראש, מוגדרת ל -75 מעלות צלזיוס, יבש את הדגימות תחת זרם עדין של גז חנקן.
וודאו שזרימת הגז מפריעה למשטח הנוזל אך מבלי להתיז אותו. לאחר שהדגימות יבשות, הן מוכנות להידרוליזה. הוסף 325 מיקרו-ליטר של 2 חומצה אצטית טריפלואורו טוחנת או TFA לכל דגימה וערבב היטב.
מכסה היטב כל צינור דגימה מיד לאחר הוספה לכל הדגימות כדי למנוע אידוי TFA ואובדן דגימה במהלך שלב החימום שלאחר מכן. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי להידרוליזציה של הגליקנים. בזמן הדגירות, שוב, הכינו את סעפת האידוי ב-75 מעלות צלזיוס.
לאחר הדגירה, יבש את הדגימות תחת זרם קבוע של חנקן בסעפת האידוי. בדוק לעתים קרובות דגימות כדי לוודא שהן מיובשות תוך שימוש במינימום זמן הייבוש האפשרי. לכל דגימה יש להוסיף 475 מיקרו-ליטר של 10 גרם לליטר נתרן בורוהידריד.
ואז מערבבים דגימות היטב כדי להמיס שאריות. כסו את המבחנות ואפשרו לתגובת ההפחתה להימשך שעה. לאחר מכן, הוסף 63 מיקרו-ליטר מתנול לכל דגימה.
מערבבים ולאחר מכן מייבשים את הדגימות בחום של 75 מעלות צלזיוס מתחת לחנקן. הוסף 125 מיקרו-ליטר מתנול לתמיסת חומצה אצטית לכל דגימה. מערבבים ואז מייבשים שוב את הדגימות בחום של 75 מעלות צלזיוס מתחת לחנקן.
ודא שהדגימות יבשות לחלוטין על ידי הנחת הדגימות מתחת לוואקום למשך 20 דקות. לאחר הייבוש, הוסף 18 מיקרו-ליטר מים נטולי יונים לכל דגימה. לאחר מכן צנטריפוגה קצרה את הדגימות וערבב אותן היטב כדי להמיס משקעים.
לאחר מכן, הוסף 250 מיקרו-ליטר אנהידריד אצטי לכל צינור. מכסים את הצינורות, מערבולת היטב וסוניקציה של הדגימות באמבט מים למשך שתי דקות כדי להבטיח פירוק מוחלט של כל שאריות. לאחר מכן דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
כעת הוסף 230 מיקרו-ליטר TFA מרוכז לכל דגימה. לאחר מכסה וערבוב הדגימות, דגרו אותן למשך 10 דקות בטמפרטורה פנימית של 50 מעלות צלזיוס. מוסיפים 1.8 מיליליטר דיכלורומתאן לכל דגימה ומערבבים היטב.
לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר מים מיונים לצינור ובצע מיצוי נוזלי/נוזלי פעמיים. שחזר את שכבת הדיכלורומתאן עם ראש צינור מרעה סילני. מעבירים לבקבוקון דגימה אוטומטית ולאחר מכן מייבשים את הדגימה מתחת לחנקן ב-74 מעלות צלזיוס.
לפני GC-MS, הרכיבו מחדש את הדגימות כל אחת עם 120 מיקרו-ליטר אצטון, מכסים ומערבבים אותן היטב. במצב מפוצל, השתמש בדגימה אוטומטית כדי להזריק מיקרו-ליטר אחד מכל דגימה לתוך תוחם ה-GC במצב מפוצל. עבור ספקטרומטר מסת זמן טיסה, מומלץ מנה מפוצלת של ארבעים וגז הליום במצב זרימה קבועה ב -0.8 מיליליטר לדקה.
נתח את הדגימה באמצעות שיפוע דו-שלבי שמגיע ל-325 מעלות צלזיוס. לחשוף את רכיבי הדגימה החומקים ליינון אלקטרונים. עבור מנתח מסת טיסה בזמן טיסה, נתח שברים M מעל Z 40 עד 800 עם קצב סיכום דופק של 0.1 שניות.
כדי להדגים את הרגישות של פרוטוקול זה, דגימה ביולוגית עובדה בקפידה. הכרומטוגרמה המתקבלת נותנת עוצמה נאותה בין פסגות המוצר הרצויות כדי להקל על ההשוואה והניתוח. אותה דגימה ביולוגית התחלתית עובדה לאחר מכן באותו הליך.
אבל השאריות הלבנות בתמיסת הפרמתילציה שסובבה דרך עמודת ה-NAOH הועברו לתערובת שלאחר מכן למיצוי נוזל/נוזלי. הכרומטוגרמה נותנת יחס שונה של עוצמת שיא של אותם תוצרי דגימה מרכזיים. בהשוואה ישירה, ההבדל בולט.
השקע הברור של שיא ה-N-אצטיל-גלוקוזאמין המקושר ל-4 מצבים בכרומטוגרמה השנייה הוא תכונה מוכרת של פרמתילציה ומיצוי לא מוצלחים. כדי להעריך את התועלת של גישה זו לזיהוי הבדלים בהרכב הגליקן במצבי מחלה, כרומטוגרמות יונים שחולצו מדגימת פלזמת דם רגילה ודגימת פלזמת דם של חולה סרטן, מנורמלות עבור מנוסים מקושרים ושכבת-על. הבדלים כמותיים בתכונות גליקן ייחודיות כגון הסתעפות בטא 1-6 כמו גם ציאלציה חולנית ניכרים בקלות.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ניתוח גליקום מלמטה למעלה גליקן גליקן. הקלה על זיקוק של תכונות גליקן מעניינות כגון קורפולקוסולציה, ציאלציה חולה וחציית גליקניט לאותות אנליטיים בודדים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג טכניקת גליקומיקה משופרת בגישת bottom-up לניתוח גליקנים בנוזלים ביולוגיים, באמצעות פירוקם למונוסכרידים ספציפיים לקשרים לצורך גילוי באמצעות GC-MS. שיטה זו נועדה להקל על זיהוי מאפייני גליקנים המשתנים במצבי מחלה, ובכך לסייע פוטנציאלית לגילוי מוקדם של סרטן.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- גליקומיקה
- אנליזה ביולוגית
- מחקר סרטן
רקע
- הטכניקה משמרת את הרכב המונוסכריד ואת מידע הקישור.
- היא נותנת מענה לאתגרים בניתוח מאפייני גליקנים במחלה.
- שיטות קודמות הובילו לעיתים קרובות לתשואות נמוכות של גליקנים חשובים.
- הבנת שינויים בגליקנים יכולה לספק תובנות לגבי מנגנוני מחלה.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה המזקקת מאפייני גליקן לאותים אנליטיים בודדים.
- זיהוי שינויים ייחודיים בגליקנים הקשורים למחלות ספציפיות.
- שיפור היבול והדיוק של ניתוח גליקנים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פירוק גליקנים לסוכרים đơn-סכריים (monosaccharides) מרכיבים.
- שימוש ב-GC-MS לזיהוי סוכרים đơn-סכריים ספציפיים לקשרי קישור.
- הכנת דגימות ביולוגיות במבחנות בנפח 1.5 milliliter.
- סבסוד ניתוח של מאפייני גליקנים, כגון הסתעפות beta 1-6.
תוצאות עיקריות
- השיטה מזקקת בהצלחה מאפייני גליקן לאותים בודדים.
- היא מזהה שינויים במאפייני גליקן הקשורים למחלות.
- נצפו תשואים משופרים של N-Acetylcysteines.
- מאפייני גליקן מרכזיים נותחו ביעילות.
מסקנות
- טכניקת הגליקומיקה המשופרת נראית מבטיחה עבור ניתוח מחלות.
- היא יכולה לסייע בזיהוי מוקדם של סרטן והפרעות המשפיעות על גליקנים.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב למצבי מחלה אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
גישה זו לגליקומיקה מהסוף להתחלה (bottom-up) מאפשרת זיהוי של שינויים בגליקנים הקשורים למחלה על ידי זיקוק של מבני גליקנים מורכבים לאותים של מונוסכרידים ספציפיים לקשרים. היא תומכת בתיקוף מטרות (target validation) ובצמצום סיכונים מכניסטיים באונקולוגיה ובגילוי סמנים ביולוגים, באמצעות אספקת תוצאות כמותיות וניתנות לשחזור של שינויים בגליקום. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי גילוי מוקדמים על ידי קישור של הפרות בקוצבי הגליקנים (glycan node dysregulation) לפעילות של גליקוזילטרנספראז במצבים פתולוגיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות חשיפת גליקוזילטרנספראזים שביכולתם להיות לא מווסתים, הודות לזיהוי צומת גליקאן אבנורמלי.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף של מטרות פונקציונליות על ידי הקשר בין שינויים בצומת הגליקאן לבין פעילות אנזימטית במודלים של מחלות.
- ערך מדעי: תומך בביטחון חיזוי על ידי זיהוי מאפייני גליקאן ייחודיים שהשתנו בסרטן ובפתולוגיות אחרות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות עוקשבות עבור תהליכי עבודה המשכיים על ידי יצירת פרופילים עקביים של צמתי גליקן מנוזלים ביולוגיים מורכבים.
- ערך תפעולי: נותן מענה לסטנדרטיזציה של בדיקות ולשחזוריות באמצעות פרוטוקולים משופרים של פרמתיליזציה (permethylation) ומיצוי נוזל/נוזל.
- ערך מדעי: מקל על הערכה אמינה של תרכובות על ידי אספקת מדידות כמותיות של צמתי גליקן באמצעות יחסי שטחים של XIC.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: דן ברלוונטיות למחלה על ידי הדגמת התועלת בהשוואת דגימות פלזמה של מטופלים בריאים ומטופלים עם סרטן לצורך זיהוי שינויים בגליקנים.
- ערך תפעולי: מתאר רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי אפשור מעקב אחר שינויים בצמתים של גליקנים במערכי דגימות שונים.
- ערך מדעי: מתמקד בהפחתת סיכונים חזויה על ידי חשיפת קשרים מכניסטיים בין הפרה של glycosyltransferase לבין שינויים בגליקום.
שילוב תהליכי עבודה (Workflow) וצינורות עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ועד לזיהוי מובילים (leads), על ידי מתן אפשרות לזיהוי ותיקוף של מטרות המונחים על ידי גליקנים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי בידוד מאפייני גליקנים ששנו עקב מחלה לאותות אנליטיים בודדים.
- סריקה: מתארת את מוכנות הבדיקה ואת השחזוריות שלה באמצעות הכנה משופרת של הדגימות, הממזערת את אובדן הגליקנים ומשפרת את הנצילות.
- אנליטיקה: מדגישה פלטים כמותיים באמצעות נורמליזציה של יחס שטחי XIC לצורך כימות יחסי של צמתי גליקנים בין דגימות.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני על ידי אפשור השוואה בין דגימות של שינויים בגליקנים במצבי מחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציגה את השיטה כבסיס הניתן לשימוש חוזר לסריקת גליקומיקה במודלים מרובים של מחלות ובתוכניות של סמנים ביולוגיים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: ביטחון במידע ניבוי, תיקוף מטרות, וצמצום העמימות המכניסטית בקשרים שבין גליקנים למחלות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה באמצעות שלבי פרמתיליזציה, מיצוי ואצטילציה מותאמים.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך התהליך (go/no-go), יעילות הון וצמצום סיכונים ביולוגיים בשלבים מאוחרים על ידי מתן אפשרות לגילוי מוקדם של סממנים ביולוגיים מבוססי גליקן.
- השפעה על פורטפוליו: תעדוף וקבלת החלטות על קידום פרויקטים מותאמי סיכונים באמצעות פרופיל גליקום כמותי במודלים של מחלות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בכימיה של גליקנים, ספקטרומטריית מסות והכנת דגימות לשלבי הנגזרת והמיצוי.
- נדרש ציוד GC-MS עם יינון אלקטרוני ויכולת לגרדיאנטים תרמיים דו-שלביים עד 325°C.
- נדרש סטנדרד אחיד בין צוותים בטיפול בדגימות כדי למנוע העברה של שאריות מוצקות הפוגעת בתשואות של N-acetylhexosamine.
- כולל שיקולי התאמה לסוגים שונים של נוזלים ביולוגיים בשל שונות במורכבות הגליקנים ובהפרעות.
- כולל מגבלות מעשיות כגון תשואות נמוכות מטבען של N-acetylhexosamine PMAAs בהשוואה ל-hexose PMAAs, המשפיעות על גבולות הגילוי המוחלטים.
שאלות נפוצות בנושאי ביו-פרמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:01
Biological Sample Permethylation
3:58
Liquid/Liquid Extraction and Glycan Purification
5:24
Trifluoroacetic Acid (TFA) Hydrolysis of Glycans
6:19
Glycan Reduction
7:13
Glycan Acetylation
8:36
Gas Chromatography – Mass Spectrometry (GC-MS)
9:35
Results: Optimized Route for Permethylation
11:03
Conclusion
