Name: ניתוח צומת glycan: גישה מלמטה למעלה כדי glycomics (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: למד ניתוח glycan מלמטה למעלה לזיהוי שינויים ב-glycans הקשורים למחלות באמצעות GC-MS. שיטה זו משפרת תפוקות ומסייעת באבחון מוקדם של סרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכללה לאמנויות ומדעים ליברליים של אוניברסיטת אריזונה סטייט בצורה של קרנות סטארט-אפ מעבדתיות ל-CRB. הוא נתמך גם על ידי מענק מקרן פלין (מענק מס' 1977) ועל ידי המכון הלאומי לסרטן של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר R33CA191110. JA נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות (PREP) תחת פרס מספר R25GM071798. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

<ol><li>Li, M., Song, L., Qin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+changes%3A+cancer+metastasis+and+anti-cancer+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Glycan changes: cancer metastasis and anti-cancer vaccines.</a> J Biosciences. 35 (4), 665-673 (2010).</li>
<li>Stanley, P., Schachter, H., Taniguchi, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStanley%2C+P+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 8: N-Glycans(2009).</li>
<li>Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+frequency+of+protein+glycosylation%2C+as+deduced+from+analysis+of+the+SWISS-PROT+database%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database.</a> Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).</li>
<li>Brockhausen, I., Schachter, H., Stanley, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrockhausen%2C+I+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 9: O-GalNAc Glycans (2009).</li>
<li>Rini, J., Esko, J., Varki, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRini%2C+J+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 5: Glycosyltransferases and Glycan-processing Enzymes (2009).</li>
<li>Gercel-Taylor, C., Bazzett, L. B., Taylor, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+aberrant+tumor-reactive+immunoglobulins+in+the+circulation+of+patients+with+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Presence of aberrant tumor-reactive immunoglobulins in the circulation of patients with ovarian cancer.</a> Gynecol Oncol. 81 (1), 71-76 (2001).</li>
<li>An, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+glycans+in+serum+for+the+discovery+of+potential+biomarkers+for+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Profiling of glycans in serum for the discovery of potential biomarkers for ovarian cancer.</a> J Proteome Res. 5 (7), 1626-1635 (2006).</li>
<li>Kanoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+serum+IgG+oligosaccharide+chains+with+prostate+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Changes in serum IgG oligosaccharide chains with prostate cancer progression.</a> Anticancer Res. 24 (5B), 3135-3139 (2004).</li>
<li>Kyselova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+serum+glycome+due+to+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Alterations in the serum glycome due to metastatic prostate cancer.</a> J Proteome Res. 6 (5), 1822-1832 (2007).</li>
<li>Okuyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fucosylated+haptoglobin+is+a+novel+marker+for+pancreatic+cancer%3A+a+detailed+analysis+of+the+oligosaccharide+structure+and+a+possible+mechanism+for+fucosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fucosylated haptoglobin is a novel marker for pancreatic cancer: a detailed analysis of the oligosaccharide structure and a possible mechanism for fucosylation.</a> Int J Cancer. 118 (11), 2803-2808 (2006).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+microarrays+with+multi-lectin+detection%3A+unique+lectin+binding+patterns+as+a+tool+for+classifying+normal%2C+chronic+pancreatitis+and+pancreatic+cancer+sera%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein microarrays with multi-lectin detection: unique lectin binding patterns as a tool for classifying normal, chronic pancreatitis and pancreatic cancer sera.</a> J Proteome Res. 6 (5), 1864-1874 (2007).</li>
<li>Comunale, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+serum+associated+fucosylated+glycoproteins+in+the+development+of+primary+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of serum associated fucosylated glycoproteins in the development of primary hepatocellular carcinoma.</a> J Proteome Res. 5 (2), 308-315 (2006).</li>
<li>Goldman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Hepatocellular+Carcinoma+Using+Glycomic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of Hepatocellular Carcinoma Using Glycomic Analysis.</a> Clin Cancer Res. 15 (5), 1808-1813 (2009).</li>
<li>Aurer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+glycosylation+of+Igg+heavy+chain+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Coll+Antropol%22%5BJournal%5D)">Aberrant glycosylation of Igg heavy chain in multiple myeloma.</a> Coll Antropol. 31 (1), 247-251 (2007).</li>
<li>Abd Hamid, U. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+to+reveal+potential+glycan+markers+from+serum+glycoproteins+associated+with+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">A strategy to reveal potential glycan markers from serum glycoproteins associated with breast cancer progression.</a> Glycobiology. 18 (12), 1105-1118 (2008).</li>
<li>Kyselova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+diagnosis+and+prognosis+through+quantitative+measurements+of+serum+glycan+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Breast cancer diagnosis and prognosis through quantitative measurements of serum glycan profiles.</a> Clin Chem. 54 (7), 1166-1175 (2008).</li>
<li>Hongsachart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoproteomic+analysis+of+WGA-bound+glycoprotein+biomarkers+in+sera+from+patients+with+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Glycoproteomic analysis of WGA-bound glycoprotein biomarkers in sera from patients with lung adenocarcinoma.</a> Electrophoresis. 30 (7), 1206-1220 (2009).</li>
<li>Arnold, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+glycan+biomarkers+for+the+detection+of+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Novel glycan biomarkers for the detection of lung cancer.</a> J Proteome Res. 10 (4), 1755-1764 (2011).</li>
<li>Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+performance+liquid+chromatographic+profiling+of+serum+N-glycans+for+fast+and+efficient+identification+of+cancer+associated+alterations+in+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation.</a> Anal Chem. 82 (24), 10208-10215 (2010).</li>
<li>Kodar, K., Stadlmann, J., Klaamas, K., Sergeyev, B., Kurtenkov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+G+Fc+N-glycan+profiling+in+patients+with+gastric+cancer+by+LC-ESI-MS%3A+relation+to+tumor+progression+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin G Fc N-glycan profiling in patients with gastric cancer by LC-ESI-MS: relation to tumor progression and survival.</a> Glycoconj J. 29 (1), 57-66 (2012).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgG+Fc-glycosylation+profiling+reveals+associations+with+age%2C+sex%2C+female+sex+hormones+and+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Human IgG Fc-glycosylation profiling reveals associations with age, sex, female sex hormones and thyroid cancer.</a> J Proteomics. 75 (10), 2824-2834 (2012).</li>
<li>Takeda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fucosylated+haptoglobin+is+a+novel+type+of+cancer+biomarker+linked+to+the+prognosis+after+an+operation+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Fucosylated haptoglobin is a novel type of cancer biomarker linked to the prognosis after an operation in colorectal cancer.</a> Cancer. 118 (12), 3036-3043 (2012).</li>
<li>Parekh, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+rheumatoid+arthritis+and+primary+osteoarthritis+with+changes+in+the+glycosylation+pattern+of+total+serum+IgG%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG.</a> Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).</li>
<li>Mehta, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+levels+of+galactose-deficient+anti-Gal+immunoglobulin+G+in+the+sera+of+hepatitis+C+virus-infected+individuals+with+fibrosis+and+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Increased levels of galactose-deficient anti-Gal immunoglobulin G in the sera of hepatitis C virus-infected individuals with fibrosis and cirrhosis.</a> J Virol. 82 (3), 1259-1270 (2008).</li>
<li>Horvat, T., Zoldoš, V., Lauc, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutional+and+clinical+implications+of+the+epigenetic+regulation+of+protein+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Evolutional and clinical implications of the epigenetic regulation of protein glycosylation.</a> Clinical Epigenetics. 2 (2), 425-432 (2011).</li>
<li>Zoldoš, V., Novokmet, M., Bečeheli, I., Lauc, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+and+epigenomics+of+the+human+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Genomics and epigenomics of the human glycome.</a> Glycoconj J. 30 (1), 41-50 (2013).</li>
<li>Lowe, J. B., Marth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+approach+to+Mammalian+glycan+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">A genetic approach to Mammalian glycan function.</a> Annu Rev Biochem. 72, 643-691 (2003).</li>
<li>Tuccillo, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+Glycosylation+as+Biomarker+for+Cancer%3A+Focus+on+CD43%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Aberrant Glycosylation as Biomarker for Cancer: Focus on CD43.</a> Biomed Res Int. , (2014).</li>
<li>Varki, A., Kannagi, R., Toole, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVarki%2C+A+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 44: Glycosylation Changes in Cancer (2009).</li>
<li>Brockhausen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucin-type+O-glycans+in+human+colon+and+breast+cancer%3A+glycodynamics+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Mucin-type O-glycans in human colon and breast cancer: glycodynamics and functions.</a> EMBO reports. 7 (6), 599-604 (2006).</li>
<li>Ohtsubo, K., Marth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+in+cellular+mechanisms+of+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease.</a> Cell. 126 (5), 855-867 (2006).</li>
<li>Bertozzi, C. R., Sasisekharan, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBertozzi%2C+CR+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch 48 Glycomics (2009).</li>
<li>Borges, C. R., Rehder, D. S., Boffetta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+surrogate+analysis+of+glycotransferase+activity+in+whole+biospecimens%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiplexed surrogate analysis of glycotransferase activity in whole biospecimens.</a> Anal Chem. 85 (5), 2927-2936 (2013).</li>
<li>Mcinnes, A. G., Ball, D. H., Cooper, F. P., Bishop, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+Carbohydrate+Derivatives+by+Gas-Liquid+Partition+Chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Separation of Carbohydrate Derivatives by Gas-Liquid Partition Chromatography.</a> J Chromatogr. 1 (6), 556-557 (1958).</li>
<li>Ciucanu, I., Caprita, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Per-O-methylation+of+neutral+carbohydrates+directly+from+aqueous+samples+for+gas+chromatography+and+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Per-O-methylation of neutral carbohydrates directly from aqueous samples for gas chromatography and mass spectrometry analysis.</a> Anal Chim Acta. 585 (1), 81-85 (2007).</li>
<li>Ciucanu, I., Kerek, F. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/0008621584852428">A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates.</a> Carbohydr Res. 131, 209-217 (1984).</li>
<li>Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+permethylation+of+glycans+for+mass+spectrometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Sp%22%5BJournal%5D)">Solid-phase permethylation of glycans for mass spectrometric analysis.</a> Rapid Commun Mass Sp. 19 (23), 3421-3428 (2005).</li>
<li>Kang, P., Mechref, Y., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+solid-phase+permethylation+of+glycans+prior+to+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Sp%22%5BJournal%5D)">High-throughput solid-phase permethylation of glycans prior to mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Sp. 22 (5), 721-734 (2008).</li>
<li>Goetz, J. A., Mechref, Y., Kang, P., Jeng, M. H., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomic+profiling+of+invasive+and+non-invasive+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Glycomic profiling of invasive and non-invasive breast cancer cells.</a> Glycoconj J. 26 (2), 117-131 (2009).</li>
<li>Goetz, J. A., Novotny, M. V., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic%2Fchemical+release+of+O-glycans+allowing+MS+analysis+at+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzymatic/chemical release of O-glycans allowing MS analysis at high sensitivity.</a> Anal Chem. 81 (23), 9546-9552 (2009).</li>
<li>Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMulloy%2C+B+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. Ch. 47: Structural Analysis of Glycans (2009).</li>
<li>Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silanizing+glassware%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Silanizing glassware.</a> Curr Protoc Immunol. 21, A.3K.1-A.3K.2 (1997).</li>
<li>Stellner, K., Saito, H., Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+aminosugar+linkages+in+glycolipids+by+methylation.+Aminosugar+linkages+of+ceramide+pentasaccharides+of+rabbit+erythrocytes+and+of+Forssman+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Determination of aminosugar linkages in glycolipids by methylation. Aminosugar linkages of ceramide pentasaccharides of rabbit erythrocytes and of Forssman antigen.</a> Arch Biochem Biophys. 155 (2), 464-472 (1973).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ככלל, ההפקה המוצלחת של acetates alditol מפוגל חלקית (PMAAs) מ hexoses כרוך בקשיים פחות היא איתנה יותר מאשר ייצור מוצלח של -acetylhexosamine N (HexNAc) PMAAs. המנגנון המדויק מאחורי התופעה כפי שהיא משחקת בחוץ בכל שלב של הליך זה אינו ידוע, אך יש להתייחס הכימיה הייחודית של קבוצת N -acetyl (ולא קבוצת הידרוקסיל) כי היא ייחודית ביחס HexNAcs כדי hexoses. המנגנון מאחורי תופעה זו כפי שהיא מתייחסת הידרוליזה חומצית מוסבר במקום אחר. 43 בקיצור, הקיבולת עבור -methyla...

Glycolipids, גליקופרוטאינים, proteoglycans, ו glycosaminoglycans מהווים ארבעת הסוגים העיקריים של פחמימות מורכבות, הטרוגניות הידוע קולקטיבי גליקנים. כמו רכיבים בכל מקום ובלתי נפרדים של קרום הפלזמה, glycocalyx, ואת תאי מטריקס ונוזלים, גליקנים להתכבד תהליכי ביוכימיים מגוונים כגון אנדוציטוזה, סחר תאי, תנועתיות תא, אות תמרה, הכרה מולקולרית, הפעלת קולטן, הידבקות תא, אינטראקציה לפתוגן המארח , תקשורת, immunosurveillance אינטר, וייזום התגובה החיסונית. 1 הווה כמעט בכל תחום של החיים, אנזימים המכונה glycosyltransferases הבונות לפעול פולימרים glycan בד בבד עם hydrolases glycoside (הידוע גם בשם glycosidases, אשר לשבור גליקנים) לבנות, לשפץ, ובסופו של דבר לייצר סופית פולימרים glycan 2. למרות שכל glycosyltransferase יכול לפעול על glycoconjugates אחר, glycosyltransferaseבדרך כלל קרנות קשר glycosidic ספציפי אנומר linkage- ועל ידי העברת מחצית monosaccharide של תורם סוכר בפרט מופעל נוקלאוטיד (למשל, תוצר-פוקוז) לפי קטגוריה מסוימת של acceptors nucleophilic (למשל, חומצת שומנים, פוליפפטיד, גרעין, או גדלנו oligosaccharide). הערכה הוא כי יותר מ -50% של חלבונים (במיוחד הממברנה וחלבוני הפרשה) הם פוסט-translationally שונה על ידי glycosylation 3 חישובים קומבינטורית בסיסיים לספק הערכת ההשתנות הניכרת, הצדדית, וספציפיות מוענקות גליקופרוטאינים ידי glycosylation.; למשל, אם מצע פוליפפטיד יש רק 10 אתרים glycosylation וכל אתר יכול ליצור הצמדה glycosidic עם 1 מתוך 3 רק הקצוות צמצום monosaccharide שונה, אם כן, באופן תיאורטי, גליקופרוטאין הסופי ניתן להניח 3 10 = 59,049 זהויות נפרדות. בשנת גליקופרוטאינים, קשרים glycosidic יוצרים בדרך כלל עם o חנקן-שרשרת הצדשאריות f asparagine ברצף ASN-X-שירו / Thr (X יכול להיות כל חומצת אמינו למעט פרולין) להניב N -glycans 2 ו-שרשרת הצד hydroxyls של שאריות סרין ו תראונין להניב O -glycans 4. הרכב של של glycome תא (כלומר, המשלים שלו של מוצרי glycosylation) הוא ייחודי ומוגבל כי, עם כמה יוצא מן הכלל, glycosyltransferases להפגין תורם קפדן, acceptor, וספציפיות הצמדה. 5 גליקופרוטאינים פלזמה בדם חשובים ורב סובלים glycosylation סוטה כתוצאה במורד זרם ביטוי ופעילות glycosyltransferase החריגים בשל במצבים פתולוגיים רבים, במיוחד סרטן ומחלות דלקתיות. 6-24 בעיקר בשל גורמים אפיגנטיים, את glycome הוא משמעותי יותר מגוון, דינאמית, ומורכב מאשר proteome ו transcriptome. 25,26 בעוד כ 1% של הגנום היונק המקודד את ההיווצרות, השינוי,הרכבה של גליקנים, 27 תמורת glycosylation בתוך בניגוד בולט-באופן מונחה שאינה תבנית פוליפפטיד וביוסינטזה חומצות גרעין. משחק הגומלין בין כמות הפעילות היחסית של אנזימי glycosylation וגורם סביבתיים כגון זמינות תזונתיות מבשרות שקובע בסופו של דבר את האופי, שיעור, והיקף של glycosylation. 5,28 עובר (למשל, נחישות בידול), הפעלה סלולרית, והתקדמות דרך גן ביטוי השפעת תא המחזור (כלומר, שעתוק ותרגום) ולשנות את הזהות וכמות הזמין glycosyltransferases, שפעילותם היא הגורם המכריע נגד הזרם המיידי של פרופיל glycan של התא. בגלל (חלק) את השגשוג, דבק, ומאפיינים פולשנית של תאים סרטניים דומים לאלה של תאי embryogenic רגילים, שינויים ספציפיים במסלולי biosynthetic glycan (למשל, הצטברות מבשרת, ביטוי ושוחרר, aberranשינוי t, עיצור מבני, או היווצרות רומן) לשרת סמנים לסרטן אוניוורסלי המציינים בשלבים שונים של היווצרות גידולים, התקדמות, הגירה, ופלישה 29 למרות glycosylation הוא מורכב מאוד, כנראה רק כמה שינויים glycosylation יכולים לאפשר היווצרות סרטן וגרורות.; כנראה, מוצרי glycosylation &quot;סוטים&quot; מסוימים אכן נהנים תאים סרטניים בכך שהיא מאפשרת להם להתחמק הכרה חיסונית לשרוד את הדרישות של הגירה בסביבות intravascular ו גרורתי ועוין. 28,30,31 באופן לא מפתיע, ניסויים חשפו כי לשבש או למנוע דפוסי שינה ביטוי גנים והיווצרות glycan סוטה יכולים לעצור tumorigenesis. 29 עם זאת, גליקנים הסוטים זוהו מדגם biofluid (למשל, שתן, רוק, פלזמת דם או בסרום) לא יכולים להיות אינדיקטורים ישיר של הסרטן (או מחלה אחרת), אלא במורד זרם תוצאות של עדין אך משמעותישינויים במערכת החיסונית או השלכות לכימות של מצב הרסני באורגן צפוי. 32 למרות שהם מספקים מידע אוניוורסלי על glycome, טכניקות glycomics מבוסס אינטראקציה מולקולריות רבות (למשל, לקטינים / מערכי נוגדן ומטבוליות / תיוג קוולנטיים) תלוי זיהוי של מבני glycan כולו ואל תספקו מידע מבני מפורט על גליקנים פרט. בניגוד בולט, ספקטרומטריית מסה (MS) יכולה לעזור לזהות ולכמת ומבני glycan פרט לחשוף מידע מבני כגון אתרים מצורפים ליבות פוליפפטיד. ביטוי או פעילות פיקוח ממשלתי של glycosyltransferase רק אחד יכול ליזום מפל של אירועים מולקולריים מזיקים במסלולי glycosylation מרובים. מכיוון שכל glycosyltransferase יכול לפעול על יותר מ המצע glycoconjugate אחד ועל פני פולימרים glycan גדל שונים, מפלי biosynthetic deregulated להניב disproportionally כמויות גדולות יותר של המוצר glycan אבל כמה היחיד בכיתות הטרוגניות של גליקנים סוטה בנוזלי התוך או תאיים. 33 עם זאת, גליקנים סוטה ייחודי כזה לפעמים נחשבים מעשי כסמנים ביולוגיים לסרטן או פתולוגיות glycan-רגשיים אחרים, שכן בהשוואה הבריכה הגדולה של היטב מוסדר גליקנים, גליקנים הסוטים אלה מייצגים רק חלק קטן מאוד היא, לעתים קרובות להישאר לגילוי אפילו בטכנולוגיות כגון רגישות גבוהה כמו ספקטרומטריית מסה. לדוגמא, בנוזלי גוף תוך תאיים, ספקטרום חלבון-הריכוז הרחב (אשר משתרע על פני שמונה סדרי גודל) יכול למנוע זיהוי של גליקופרוטאינים נדירים כי הם רעולים פנים על ידי המינים שופעים יותר. 32 יתר על כן, בקביעת פעילות glycosyltransferase נשארה ניכר מעשי ואתגר תיאורטית כיוון glycosyltransferases רב נעדר biofluids הקליני או להיות פעיל vivo לשעבר. למרות הקושי של consistently גילוי וכימות כמויות אולטרה-דקות של גליקנים שלם ייחודי, מתרגלים של ספקטרומטריית מסה עשו צעדים עצומים כלפי העסקת גליקנים שלמים כסמנים קליניים. פתחנו לאחרונה גישה משלים לניתוח של גליקנים שלם כי, העסקת GC-MS, מקלה על זיהוי של כל סניף נקודות המכוננות מונוסכרידים ספציפי הצמדה ( &quot;צומת glycan&quot;) שיחד להקנות ייחודיים לכל glycan ובהרבה במקרים ישירות לשרת פונדקאי מולקולרית כמו זה לכמת את הפעילות היחסית של glycosyltransferase האשם (הים). מאז שלה דיווח לראשונה בפנייה ישירה ניתוח glycan בשנת 1958, גז כרומטוגרפיה (GC) הוכיחה טכניקה רבת עוצמה כדי לנתח שידורי מפוגל מונו ו disaccharides, 34 לקבוע anomericity שלהם ותצורה מוחלט, ולהפריד אותם לניתוח spectrometric הבאים המוני. 35 בין השנים 1984 ו -2007, Ciucanu ועמיתיוהציג ומעודן טכניקה permethylation glycan-שלב מוצק שהעסיקה הידרוקסיד נתרן iodomethane, ואחריו מיצוי נוזלי נוזלי / של גליקנים permethylated באמצעות מים כלורופורם. 35,36 בין השנים 2005 ו -2008, קאנג ועמיתים לעבודה משולבת ספין חוסך זמן הגישה -column לתוך צעד permethylation. 37,38 בשנת 2008, קבוצת המחקר גץ המציאו-שלב מוצק כמותית permethylation שיטת glycan-פרופיל משתמש יינון-desorption לייזר בסיוע מטריקס (MALDI) ספקטרומטריית מסה כדי להשוות ואפשרות להבחין פולשנית ובלתי תאי -invasive סרטן השד; 39 אז, בשנת 2009, האנזימטית גץ צוות המשולבת וטכניקות שחרור כימיות לדבוק O -glycans מ גליקופרוטאינים שלם בתכנית permethylation מוצק שלב בסיסית מאוד 40 למרות הליך גץ הקל permethylation סימולטני ושחרור כימי. של O -glycans, יושם זה רק כדי glyco טרום מבודדחלבונים. שינינו את הטכניקה הזו בשנת 2013 והתאימה אותו עבור biofluids unfractionated כולו דגימות רקמה הומוגני ידי שילוב חומצה trifluoroacetic (TFA) הידרוליזה, הפחתה, ואת acetylation צעדים. 33 צעדים נוספים אלה גם לשחרר גליקנים מ glycolipids ו- N -linked גליקנים מ גליקופרוטאינים ולהמיר אותם acetates alditol מפוגל חלקית (PMAAs, איור 1), שדפוסי מתילציה-ו-acetylation ייחודי להקל על ניתוח על ידי GC-MS ייחודי לאפיין את בלוטות glycan מכוננת בפולימר glycan ללא פגע המקורי 41 (איור 2). 33 בסופו של דבר, זה הליך מייצר דיוקן מורכב של כל גליקנים בתוך biofluid מורכב הבוסס על ישירה, כימות יחסית של תכונות glycan ייחודיות כגון &quot;ליבת fucosylation&quot;, &quot;6-sialylation&quot;, &quot;שחצה GlcNAc&quot;, ו &quot;בטא 1-6 הסתעפות&quot; - כל נגזר chromatograp GC-MS יחידשיא יק. מאמר זה מציג אופטימיזציה נוספת של permethylation, acetylation, בידוד, ושלב לנקות יחד עם שיפורים במצב של כימות יחסית.

<table><tbody><tr><td>חרוזי נתרן הידרוקסיד&nbsp;</td><td>367176</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>20-40 רשת, דרגת ריאגנט 97%</td></tr><tr><td>0.9 מ"ל עמוד ספין</td><td>69705</td><td>חטיבת פירס של ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>כולל&nbsp; פלאגים ופריטי פוליאתילן&nbsp;</td></tr><tr><td>בקבוקון דגימה אוטומטית GC-MS (סילני)*</td><td>C4000-9</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Target DP בקבוקון התאוששות גבוהה, 1.5&nbsp; מ"ל, 12&nbsp; מ"מ x 32&nbsp; מ"מ, כולל כובעי פירסציה מרופדים טפלון</td></tr><tr><td>1.5 מ"ל מבחנות פוליפרופילן</td><td>05-402-25</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>מכסה עם מכסה הצמד</td></tr><tr><td>מבחנות פוליפרופילן 2 מ"ל</td><td>05-408-138</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>מכסה עם מכסה הצמד</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td> <td>D8418</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>BioReagent לביולוגיה מולקולרית, דרגת ריאגנט >99.0%</td></tr><tr><td>יודומתאן&nbsp;</td><td>I8507</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>מכיל נחושת כמייצב, ריאגנט פלוס 99%</td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>A955-4</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>אופטימה LC/MS</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>75002436: Sorvall Legend Micro 17 צנטריפוגה</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>רוטור 24 x 1.5/2.0 עם מכסה הכלה ביולוגית ClickSeal. מספר קטלוגי רוטור: 75003424</td></tr><tr><td>מבחנה מזכוכית 13 x 100 (סילנית)*</td><td>53283-800</td><td>VWR</td><td>13 מ"מ x 100 מ"מ מבחנות זכוכית בורוסיליקט בגימור מכסה הברגה</td></tr><tr><td>מכסים למבחנות זכוכית</td><td>14-930-15D</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>קימבל וסחר; מכסי בורג פנוליים שחורים; 13&nbsp; חוט מ"מ-415 GPI; תוחם גומי עם פני PTFE.</td></tr><tr><td>נתרן כלורי&nbsp;</td><td>S7653</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>>99.5% טהור</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>4440-08</td><td>מקרון כימיקלים עדינים&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>חומצה טריפלואורואצטית&nbsp;</td><td>299537</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>99% מטוהרים על ידי זיקוק מחדש לריצוף חלבונים&nbsp;</td></tr><tr><td>נתרן בורוהידריד</td><td>71321</td><td>פלוקה אנליטיקל&nbsp;</td><td>99%</td></tr><tr><td>תמיסת אמוניום הידרוקסיד&nbsp;</td><td>320145</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>תכולת NH3: 28.0-30.0%</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>AH230-4</td><td>Honeywell Burdick & חומצה</td> אצטית <td>בדרגת ג'קסון HPLC</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>320099</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>99.70%</td></tr><tr><td>מייבש ואקום מפלסטיק&nbsp;</td><td>כל דגם בגודל הולם</td><td>FoodSaver</td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhydride&nbsp;</td><td>539996</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>99.50%</td></tr><tr><td>דיכלורומתאן&nbsp;</td><td>D143SK-4</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>דרגת HPLC מיוצבת</td></tr><tr><td>אצטון&nbsp;</td><td>9006-03</td><td>J.T.Baker</td><td>Baker מנותח&nbsp;</td></tr><tr><td>סעפת אידוי מחוממת (יחידה ראשית)</td><td>pi18823</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>מודול חימום וערבוב Thermo Scientific* Reacti-Therm*; דגם משולש עם פונקציית חימום וערבוב</td></tr><tr><td>סעפת אידוי מחוממת (מאייד תקורה)</td> <td>pi18826</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>מאייד ThermoScientific* Reacti-Vap, 27 יציאות; לשימוש עם מודול חימום Reacti-Therm משולש בלוק</td></tr><tr><td>בלוקים של מחזיק מדגם אלומיניום לסעפת אידוי</td><td>pi18816</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>בלוק, אלומיניום, Reacti-Block S-1, מחזיק 13&nbsp; מבחנות מ"מ קוטר, 13 חורים (14&nbsp; קוטר מ"מ x 45&nbsp; עומק מ"מ</td></tr>) <tr><td>כרומטוגרף גז</td><td>דגם A7890</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>מצויד בדגימה אוטומטית CTC PAL</td></tr><tr><td>ספקטרומטר מסה&nbsp;</td><td>GCT Premier (זמן טיסה)</td><td>Waters&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>תוחם במצב מפוצל (מושבת / סילאני)</td><td>5183-4647</td><td>Agilent</td><td>מכיל פקק קטן של צמר זכוכית סילאני</td></tr><tr><td>DB-5ms GC עמודה</td><td>122-5532</td><td>Agilent</td><td>30 מ' x 0.25 מ"מ קוטר פנימי x 0.25 מיקרון עובי סרט</td></tr><tr><td>כלורוטרימתילסילן</td><td>95541</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מייבש ואקום זכוכית (לסילאניזציה של כלי זכוכית)</td> <td>EW-06536-30</td><td>Cole-Parmer</td><td>ברוחב 12 אינץ'; גודל צלחת 230 מ"מ</td></tr><td colspan="4">*סילאניזציה של כלי זכוכית מתבצעת בבית, בן לילה באמצעות אדי כלורוטרימתילסילן במייבש ואקום זכוכית גדול.<tr></td></tr></tbody></table>

ניתוח צומת glycan: גישה מלמטה למעלה כדי glycomics

Glycan Node Analysis: A Bottom-up Approach to Glycomics

מסונתז בתהליך שאינו מונע על ידי תבניות על ידי אנזימים הנקראים גליקוזילטרנספראזות, גליקנים הם שחקני מפתח באירועים תוך-תאיים וחוץ-תאיים משמעותיים שונים. מצבים פתולוגיים רבים, במיוחד סרטן, משפיעים על ביטוי הגנים, מה שבתורו יכול להפחית את השפע היחסי ורמות הפעילות של אנזימי גליקוזיד הידרולאז וגליקוזילטרנספראז. גליקנים שלמים חריגים ייחודיים הנובעים מגליקוזילטרנספראז(ים) לא מוסדרים נמצאים לעתים קרובות בכמויות זעירות בתוך נוזלים ביולוגיים מורכבים, מה שהופך את זיהויים לקשה ולעיתים סטוכסטי. עם זאת, עם הכנת דגימה נכונה, אחת הצורות הוותיקות ביותר של ספקטרומטריית מסה (כרומטוגרפיה גזית-ספקטרומטריית מסה, GC-MS) יכולה לזהות באופן שגרתי את אוסף החד-סוכרים הספציפיים לנקודת הסתעפות והצמדה ("צמתים גליקניים") הקיימים בנוזלים ביולוגיים מורכבים. כהשלמה לטכניקות הגליקומיקה המסורתיות מלמעלה למטה, הגישה הנדונה כאן כוללת איסוף ועיבוי של כל צומת גליקן מרכיב בדגימה לאות אנליטי עצמאי יחיד, המספק מידע מבני וכמותי מפורט על שינויים בגליקום בכללותו וחושף גליקוזילטרנספראזות שעלולות להיות לא מוסדרות. שיפורים בפרמתילציה ובשלבי מיצוי הנוזל/נוזל הבאים המפורטים כאן משפרים את יכולת השחזור והתפוקה הכוללת על ידי הקלה על חשיפה מינימלית של גליקנים פרמתיליים לתנאים מימיים אלקליין. שינויים בשלב האצטילציה מגדילים עוד יותר את היקף התגובה ואת התשואה הכוללת. למרות יכולת השחזור שלהם, התשואות הכוללות של N-acetylhexosamine (HexNAc) אלדיטול אצטטים פרמתיליים חלקית (PMAAs) הוכחו כנמוכים מטבעם מהערך התיאורטי הצפוי שלהם ביחס ל-PMAAs הקסוזה. חישוב היחס בין השטח מתחת לכרומטוגרמה של היונים המופקים (XIC) עבור כל הקסוז PMAA בודד (או HexNAc PMAA) לסכום אזורי XIC כאלה עבור כל ההקסוזות (או HexNAcs) מספק שיטת נורמליזציה חדשה המאפשרת כימות יחסי של בלוטות גליקן בודדות בדגימה. למרות שכיום היא מוגבלת מבחינת גבולות הזיהוי המוחלטים שלה, שיטה זו מזרזת את הניתוח של נוזלים ביולוגיים קליניים ומראה הבטחה ניכרת כגישה משלימה לגליקומיקה המסורתית מלמעלה למטה.

הכרומתוגרמה שוטף יון (TIC) מראה permethylation המוצלח, הידרוליזה, הפחתה, ואת acetylation של דגימות פלזמת דם אדם ביחס למקרים בם שני צעדי permethylation קריטיים הוצאו להורג באופן שגוי מוצגת באיור 3. מוחלטים תשואה של HexNAcs יחסית Hexoses: <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;d...

מאמר זה מציג צורה משופרת של טכניקת גליקומיקה חדשה מלמטה למעלה שנועדה לנתח את פרופיל ההרכב המאוגד של גליקנים בנוזלים ביולוגיים לא מפוצלים באמצעות פירוק כימי של גליקנים לחד-סוכרים ספציפיים לקישור המרכיב אותם לזיהוי על ידי GC-MS. יישומים פוטנציאליים כוללים גילוי מוקדם של סרטן והפרעות אחרות הנוגעות לגליקן.

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לפרק את כל הגליקנים בדגימה ביולוגית תוך שימור הרכב המונוסכרי ומידע על הקישוריות. הדבר מאפשר זיקוק של מאפייני גליקן מעניינים, כגון סיאליציה (sialylation) ו-N-Acetylglucosamine חוצה (bisecting), לאותים אנליטיים בודדים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות ישירות לשאלות מפתח בתחום הגליקומיקה, כגון אילו מאפייני גליקן ייחודיים משתנים במצבי מחלה ספציפיים.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שמאפייני גליקנים הנוטים להשתנות במחלה, כגון beta 1-6 branching ו-core fucosylation, מזוקקים לאותים אנליטיים בודדים במקום להיות מפוזרים על פני מספר גליקנים שלמים. בדרך כלל, אנשים המבצעים שיטה זו מתמודדים עם תנובה נמוכה של N-Acetylcysteines עקב עיבוד שגוי של גליקנים שעברו permethylation טריים. הכין את הדגימות על ידי העברה של 9 µL מכל אנליט ביולוגי לשפורות מבחנה נפרדות בנפח 1.5 mL.לכל דגימה, יש להוסיף 1 µL של מים דה-יוניים ו-270 µL של DMSO בדרגת טוהר גבוהה. לאחר מכן, יש לערבב בעוצמה באמצעות וורטקס. לאחר הכנת הדגימות, יש להרכיב את עמודי הספין הטעונים בנתרן הידרוקסיד כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.בעזרת מזרק אנליטי, הוסיפו 105 µL של iodomethane לכל אנליט וסגרו מיד את השפופרות באמצעות פקקים. ערבבו את הדגימות היטב במכשיר vortex. הוציאו את פקקי התחתית של עמודי הספין שהוכנו קודם לכן וסובבו אותם בצנטריפוגה למשך 15 שניות ב-2,400 Gs. לאחר השלכת שפופרות האיסוף והנוזל שירד, החזירו את הפקקים לעמודים והניחו אותם בתוך סט חדש של שפופרות, המסומנות עבור כל אנליט.השתמש בקצה פיפט של 1000 micro-liter כדי להעביר כל תמיסת אנליט לעמודת ספין המתאימה. לאחר הוספת תמיסת האנליט, כופף כ-2 milliliters מקצהו של טיפ פיפט של 200 micro-liter והשאר את הטיפ בעמודה כדי שישמש כמערבל. השתמש בטיפי הפיפט כדי לערבב בעדינות את העמודות אחת לכל שתיים עד שלוש דקות.לאחר 11 דקות, נתקו את העמודות וסובבונן אותן במערך צנטריפוגה למשך 15 שניות ב-2,400 Gs. הסירו מיד את עמודי הספין והניחו אותם במבחנות איסוף חדשות, תוך שמירת תמיסת המעבר (flow-through) והשלכת הפקקים. הוסיפו לעמודות 300 µL של acetonenitrile וסובבנו אותן למשך 30 שניות ב-9,600 Gs. כעת העבירו את תמיסות המעבר שעברו פרמתיליציה ראשונה למבחנות זכוכית סילניזיות המכילות 3.5 mL של sodium phosphate buffer. ודאו שהנוזל שהועבר צלול ושלא הועבר חומר מוצק.בקרקעית השפרוres הפלסטיים ייווצר כדור קטן ולבן. הימנעו מהעברה של כל חומר מוצק גלוי. אי ביצוע פעולה זו יוביל לתפוקות נמוכות של N-Acetylcysteine-glucosamine glycan notes.בצע ערבוב מהיר (vortex) לכל הדגימות בסדרה מיד לאחר שהועברו כל הדגימות. לאחר מכן, שלב את תמיסות המעבר (flow-through) של ה-acetonenitrile עם יתר הנוזל במבחנות המתאימות. שוב, הימנע מהעברה של כל שארית מוצקה ולבנה במהלך שלב זה.סגרו את המכסה, נערו וערבבו במכשיר וורטקס (vortex) את התמיסות המאוחדות מיד לפני המעבר לדגימה הבאה. לאחר הפרמתיליציה, הוסיפו 1.2 milliliters של כלורופורם לכל מבחנה בתוך מבתור כימי. לאחר מכן, סגרו את המבחנות וערבבו את התוכן בעוצמה.כדי להפריד בין השכבות, סבב את התמיסות במ centri-fuge לזמן קצר ב-3,000 Gs. השתמש בפיפטת פסטור כדי לשאוב ולהשליך את רוב השכבה המימית העליונה, כך שיישארו כ-three milliliters מהשכבה. הוסף 3.5 milliliters של בופר נתרן פוספט ריכוז 0.2 molar, ולאחר מכן סגור את המבחנה, ערבב וסבב אותה ב-centrifuge. בצע את שלב מיצוי הנוזל/נוזל הזה שלוש פעמים בסך הכל.השאירו כ-1 מיליליטר מהשכבה המימית בסוף התהליך של השליפה האחרונה. כעת, השתמשו בקצה של פיפטה נקייה ומסילנזת כדי להעביר בזהירות את שכבת הכלורופורם למבחנה מזכוכית נקייה, מסומנת ומסילנזת, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. בתוך מערכת אידוי (evaporation manifold) שחוממה מראש ל-75 °C, ייבשו את הדגימות תחת זרימה עדינה של גז חנקן.יש לוודא שזרימת הגז מפריעה לפני השטח של הנוזל אך ללא התזתו. לאחר שהדגימות יתייבשו, הן יהיו מוכנות להידרוליזה. הוסיפו 325 µL של חומצה טריפלואוורו-אצטית (TFA) בריכוז 2 M לכל דגימה וערבבו היטב.סגרו היטב את מכסה כל מבחנת דגימה מיד לאחר ההוספה לכל הדגימות, כדי למנוע התאיידות של TFA ואובדן של דגימה במהלך שלב החימום הבא. דגרו את הדגימות ב-121 degrees celsius למשך שעתיים כדי להמיס את הגליקנים. בזמן שהדגימות מדגרות, הכינו שוב את סביבת האידוי ב-75 degrees celsius.לאחר הדגירה, ייבשו את הדגימות תחת זרם קבוע של חנקן במגוון האידוי (evaporation manifold). בדקו את הדגימות לעיתים קרובות כדי לוודא שהן מיובשות במינימום זמן הייבוש האפשרי. לכל דגימה, הוסיפו 475 µL של sodium borohydride בריכוז 10 g/L.לאחר מכן, ערבבו את הדגימות היטב כדי להמיס כל שארית. סגרו את מבחנות הבדיקה והמתינו שפעולת תגובת החיזור תימשך במשך שעה אחת. לאחר מכן, הוסיפו 63 µL של methanol לכל דגימה.ערבבו ולאחר מכן ייבשו את הדגימות בטמפרטורה של 75 °C תחת זרם חנקן. הוסיפו לכל דגימה 125 µL של תמיסת מתנול בחומצה אצטית. ערבבו שוב ואז ייבשו את הדגימות שנית בטמפרטורה של 75 °C תחת זרם חנקן.יש לוודא שהדגימות יבשות לחלוטין על ידי הנחתן תחת ואקום למשך 20 דקות. לאחר הייבוש, יש להוסיף 18 µL של מים דה-יוניים לכל דגימה. לאחר מכן, יש לסובב את הדגימות בצנטריפוגה למשך זמן קצר ולערבב אותן היטב כדי להמיס משקעים.בשלב הבא, הוסיפו 250 µL של acetic anhydride לכל מבחנה. סגרו את המבחנות, ערבבו היטב באמצעות vortex ובצעו סוניקציה לדגימות באמבט מים למשך שתי דקות כדי להבטיח המסה מלאה של כל שארית. לאחר מכן, הדגירו את הדגימות בטמפרטורה של 50 °C למשך 10 דקות.כעת הוסיפו 230 µL של TFA מרוכז לכל דגימה. לאחר סגירת המבחנות וערבוב הדגימות, דגרו אותן למשך 10 דקות בטמפרטורה פנימית של 50 °C. הוסיפו 1.8 mL של dichloromethane לכל דגימה וערבבו היטב.בשלב הבא, הוסיפו שני מיליליטרים של מים דה-יוניים לשפופרת ובצעו מיצוי נוזל/נוזל פעמיים. אספו את שכבת הדיכלורומתאן באמצעות פיפטה מסילניזציה. העבירו למבחנה לדוגם אוטומטי ולאחר מכן ייבשו את הדגימה תחת חנקן בטמפרטורה של 74 °C.לפני ביצוע GC-MS, יש להמיס מחדש את הדגימות, כל אחת עם 120 micro-liters של אצטון, לסגור את הפקקים ולערבב היטב. במצב split, השתמשו במדגמן אוטומטי להזרקת micro-liter אחד מכל דגימה אל תוך ה-liner של ה-GC במצב split. עבור ספקטרומטריות מסה מסוג time of flight, מומלץ להשתמש ביחס split של ארבעים ובגז הליום במצב זרימה קבועה של 0.8 milliliters per minute.נתחו את הדגימה באמצעות גרדיאנט דו-שלבי המגיע ל-325 °C. חשפו את רכיבי הדגימה הנפלטים ליינוני אלקטרונים. עבור מנתח מסה מסוג זמן מעוף (time of flight), נתחו פרגמנטים בטווח M/Z של 40 עד 800 עם קצב סיכום פולסים של 0.1 שניות.כדי להדגים את הרגישות של פרוטוקול זה, דגימה ביולוגית עובדה בקפידה. הכרומטוגרמה שהתקבלה מציגה עוצמה הולמת בין שיאי המוצר הרצויים לצורך הקלה בהשוואה ובניתוח. לאחר מכן, אותה דגימה ביולוגית התחלתית עובדה באמצעות אותו הליך.אולם השארית הלבנה בתמיסת הפרמתילאציה, שעברה סבוב דרך עמודת ה-NAOH, נשאה עימה את החומר לתערובת הבאה עבור מיצוי נוזל/נוזל. הכרומטוגרמה מראה יחס שונה של עוצמת שיאי הפסגות עבור אותם מוצרי דגימה מרכזיים. כאשר משווים ביניהם באופן ישיר, ההבדל הוא בולט.הירידה הבולטת בשיא ה-N-acetylglucosamine מקושר בעמדה 4 בכרומטוגרמה השנייה היא מאפיין מובהק של פרמתיליציה ומיצוי שלא הצליחו. כדי להעריך את התועלת של גישה זו לזיהוי הבדלים בהרכב הגליקנים במצבי מחלה, כרומטוגרמות של יוני חילוץ מדגימה של פלזמה מדם נורמלי ומדגימה של פלזמה מדם של חולה סרטן, מנורמלות עבור מנוזות מקושרות בעמדה 2 ומונחות אחת על השנייה. הבדלים כמותיים במאפייני גליקן ייחודיים, כגון הסתעפות beta 1-6 וכן סיאלילציה, ניכרים בקלות.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן ביצוע ניתוח צמתי של גליקנים בגישת גליקומיקה מלמטה למעלה (bottom up glycomics). הדבר יסייע בזיקוק של מאפייני גליקן מעניינים, כגון core fucosylation, sialylation ו-bisecting glycanite, לכדי אותות אנליטיים בודדים.

glycan-node-analysis-a-bottom-up-approach-to-glycomics

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

שיטה ספציפית ורגישה לגיבוש תובנה לפרופיל הביטוי של אנטיגנים glycosphingolipid באיברים ותאי חיסון מתוארת. השיטה מנצלת את ספקטרומטריית מסות מלכודת היונים המאפשר פיצול צעד חכם של מולקולות glycosphingolipid לניתוח מבני בהשוואה לסטנדרטים מסונתזים כימי.

ניתוח ספקטרומטריה של אנטיגנים Glycosphingolipid

Profiling glycan של פולימרי דופן תא צמח באמצעות מערכים

על מנת לחקור באופן מקיף את המגוון של גליקנים מקושרים O, הליך חדש לסילוק β רדוקטיבי בתוך הג'ל, בשילוב עם פרמתילציה ושיטת חלוקת פאזה מהירה, מיושם לניתוח גליקנים מקושרים O המשתחררים ישירות מגליקופרוטאינים שנפתרו על ידי SDS-PAGE וניתנים לניתוח גליקומי לאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה.

השתפר בג&#39;ל Sulfo-glycomics β-ביעור עבור מקיף O צמוד וReductive ידי ספקטרומטריית מסה

פרוטוקול בעל תפוקה גבוהה פותח לטיהור משולב של פרוטאומיקה וגליקומיקה וכימות LC-MS/MS בפלזמה. ניתוח Deamidation של מוטיבים של גליקוזילציה המקושרים ל-N היה ספציפי לאתרים דה-גליקוזיליים. כימות מדויק של N-גליקנים הושג על ידי צימוד הפרדת N-גליקן בסיוע מסנן לנורמליזציה של האינדיבידואליות בעת תיוג עם אסטרטגיית תגי גליקן הידרזיד.

Glycomics כמוני ואסטרטגית טיהור המשולבת פרוטאומיקה

עבודה זו מציגה את הפוטנציאל של טכנולוגיית מערך (PGA) glycan המודפס על הניתוח של מחזורי נוגדנים אנטי-פחמימות בבעלי חיים קטנים.

מערך Glycan המודפס: טכניקה רגישה לניתוח של הרפרטואר של מחזורי נוגדנים אנטי-פחמימות בבעלי חיים קטנים

חיפוש פתוח מאפשר זיהוי של גליקופפטידים מעוטרים בקומפוזיציות גליקאן שלא היו ידועות קודם לכן. בתוך מאמר זה, גישה יעילה לביצוע חיפוש פתוח וחיפושי גליקופפטיד ממוקדי גליקן הבאים מוצגים עבור דגימות חיידקים באמצעות Acinetobacter baumannii כמודל.

היישום של גישות מבוססות חיפוש פתוח לזיהוי של Acinetobacter baumannii O מקושר Glycopeptides

פרוטוקול זה ממחיש כיצד לחקור, להשוות ולפרש גלייקום חלבון אנושי באמצעות משאבים מקוונים.

משאבי ביואינפורמטיקה לחקר אינטראקציות חלבון בתיווך גליקן

פרופיל פולימר Microarray (MAPP) היא טכניקה בעלת תפוקה גבוהה לניתוח הרכב גליקנים בדגימות ביולוגיות.

פרופיל פולימר Microarray (MAPP) לניתוח גליקן בתפוקה גבוהה

פרוטוקול זה מפרט את שיטת הגליקופרוטאומיקה מונחית הגליקומיקה, טכנולוגיית אומיקס משולבת המציעה תובנות מקיפות על הגליקופרוטאום ההטרוגני במיקרו-סביבות גידוליות מורכבות הדרושות להבנה טובה יותר של הגליקוביולוגיה של סרטן.

גליקופרוטאומיקה מונחית גליקומיקס מאפשרת יצירת פרופיל מקיפה של הגליקופרוטאום במיקרו-סביבות גידוליות מורכבות 

גישה חומרי הקרנה מודרכת לפתח microarrays מסוממת סול ג נגזר חלבון באמצעות שיטת סיכת הדפסה מתפתחת של ייצור מתוארת. מתודולוגיה זו באה לידי ביטוי באמצעות הפיתוח של acetylcholinesterase וmultikinase microarrays, המשמשים להקרנת מולקולה קטנה וחסכונית.

גישת הקרנת חומרים מודרכת לפיתוח Microarrays החלבון כמותי סול ג הנגזר

למד ניתוח glycan מלמטה למעלה לזיהוי שינויים ב-glycans הקשורים למחלות באמצעות GC-MS. שיטה זו משפרת תפוקות ומסייעת באבחון מוקדם של סרטן.

ניתוח צומת glycan: גישה מלמטה למעלה כדי glycomics

גלה סרטונים נוספים