Name: מנהל Intra-קנה נשימה של אינפלואנזה המופילוס בעכברי מודל לחקר Airway דלקת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: חקור תגובות חיסון בריאות בעכברים באמצעות הזרקה תוך-קניתית של Haemophilus influenzae. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני דלקת בדרכי הנשימה וזיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר קרסון הרוד על הקריאה הביקורתית של כתב היד. אנו מודים גם למר מינג-הווי זנג ולד"ר מאהש קאתניה ופרשאנט קארה על תרומותיהם. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהאגודה האמריקאית לסרטן (מענק חוקר מחקר, 122713-RSG-12-260-01-LIB) ומרכז הסרטן סאמונס (מענק פרויקט פיילוט) ל-K. Venuprasad.

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות של ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדית השתמש (IACUC) של מכון המחקר ביילור. 1. Culturing ללא typeable אינפלואנזה המופילוס (NTHi) ואת הכנת הבידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט NTHi על צלחת אגר שוקולד ולשמור הצלחת הפוכה CO 2 באינקובטור humidified לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. למחרת, התרבות החיידקים במרק עירוי הלב והמוח. לאחר מכן, להוסיף 1 מ&quot;ל של מרק לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 4000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. ואז, לבטל את supernatant מחדש להשעות גלולה ב 1 מ&quot;ל של PBS 1x סטרילי. חזור על פעולה זו פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 100 μl של פתרון מחדש מושעה לתוך 900 μl של 1x PBS ולמדוד את ספיגת התרבות המדוללת ב 600 ננומטר אורך גל ספקטרופוטומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הכדאיות ואת המושבה היחידה להרכיבs (CFUs) של הבידוד על ידי culturing דילולים 1:10 סדרתי על צלחות אגר שוקולד דוגרים לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתבסס על הכדאיות CFUs נקבע מהשלב הקודם, להתאים את הבידוד לריכוז סופי של 20 x 10 6 CFU / ml. </li></ol> 2. Intra-קנה הנשימה (זה) החדרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את העכבר intraperitoneally (IP) עם 0.1 מ&quot;ל / 10 g משקל הגוף של עכבר עם פתרון 150 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​קטמין + 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​xylazine. ההליך צריך להיעשות בשכונה עם מקור אור כדי לשמור על חומו של בעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצבוט את החלל interdigital של העכבר על מנת לוודא כי העכבר הוא מורדם כראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר על גבו. לגלח את האזור הגחון של הצוואר ולחטא עם chlorhexidine ואלכוהול אתיל 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את העור של חלק הגחון העליון של הצוואר באמצעות מלקחיים שיניים חולדה. לעשות חתך קטן (0.5-1.0 ס&quot;מ) מעל התימוס באמצעות אזמללנתח את השריר בזהירות כדי לחשוף את קנה הנשימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק 1 מ&quot;ל עם מחט 27 G, להזריק לאט 0.05 מ&quot;ל אוויר, ואחריו 0.05 מ&quot;ל NTHi המתקבל בסעיף 1 או מלוחים כביקורת, ואחריו עוד אוויר 0.05 מ&quot;ל. שמור חיה אנכי כ 1 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגירת החתך עם דבק כירורגי. שמור את העכבר רוחבי שכיבה וחמה למשך כ -10 דקות. </li></ol> 3. אוסף BALF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העכבר על ידי hr 24 נקע בצוואר הרחם לאחר ההדבקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חלל הבטן של העכבר במספריים אנטומיים וחותכים האאורטה הגחון לדמם. לחשוף את החלק הגחוני של הריאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את קנה הנשימה לצנרר אותו עם קטטר 20 מד. להחדיר 0.8 מ&quot;ל של חיץ BALF (PBS 1x, 0.1% דקסטרוז, 10 הפרין U / ml) לאסוף את שטיפה ידי שאיפה עדינה. חזור על הליך זה שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את המספר הכולל של תאים ב 100 μl של השעיה BALF באמצעות hemocytoמטר בהגדלה 10X עם מכתים כחול Trypan. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן שקופיות עבור מכתים Giemsa שונה. μl Aliquot 100 של BALF לתוך הבארות המתאימות של cytospin ו צנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות. לייבש את השקופיות עבור 10 דקות ו להכתים את התאים באמצעות צביעה גימזה מעודכנת על פי הפרוטוקולים של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש התאים הנותרים לניתוח שלאחר מכן, כגון התא מופעל בתפרחת מיון (FACS), מיקרוסקופיה confocal, ביטוי גנים ומערב כתם 11-13. </li></ol> 4. הכנת Histopathology <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח histopathology, להדביק עכברים עם NTHi כמתואר בשלב 2.4. לאחר 24 שעות של זיהום, להקריב את בעלי החיים באמצעות פריקת צוואר רחם. גזור לפתוח את חלל בית החזה במספריים אנטומיים לחשוף את הריאות ואת קנה הנשימה כפי שהוזכר קודם לכן. לאחר מכן, הכנס את הקטטר 20 מד לתוך קנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את הריאות עם 2 פתרון agarose חם% מוכנים בפורמלין 4%. פעם הריאות מנופחות לחלוטין, במקום קרח על גבי הריאות כדי לחזק פתרון agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, להסיר בזהירות את התקע החזה והכניס אותו בתמיסה 50 מ&quot;ל של פורמלין 4% ב 1x PBS עד שהוא יעובד עבור hematoxylin ו eosin (H &amp; E) סעיפים. </li></ol> 5. FACS מכתים תאים בתוך BALF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 1 x 10 5 תאים מן הנוזל BALF בצלחת כייל מיקרו 96-גם V-התחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם 300 μl של 1X PBS ו ספין קר ב 4000 XG 3 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם התאים עם פתרון כתם תא 100 μl 1x PBS (1: 1,000 דילול) לשמור בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם 300 μl של PBS 1x קר ב 4000 XG 3 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את התאים ב 100 μl של חיץ לשטוף FACS [חיץ לשטוף (PBS 1x, 2% FBS, 1 mM EDTA, אזיד הנתרן 0.1%] המכיל 1: 100 Fc-בלוק בדילול במשך 15 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים צנטריפוגה ב 4000 XG 3 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי כתם עם 100 קוקטייל משטח מכתים μl (1: 100 דילול) במאגר לשטוף FACS למשך 30 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים שלוש פעמים עם 300 μl של חיץ לשטוף FACS ב 4000 XG 3 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים ב 100 μl של paraformaldehyde 4% במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעמיים שטפו תאים עם 300 μl 1x PBS ב 400 XG 3 דקות ב 4 ° C מחדש להשעות ב 300 μl של חיץ לשטוף FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך פקדים מכתימים יחיד צבע באמצעות זרימת cytometry חרוזים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה אחת של חרוזים לתוך צלחת מיקרוליטר V-התחתון 96-היטב ולשטוף עם 200 μl 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של נוגדן מכתים 100 μl 1x PBS וחרוזים לדגור על טמפ &#39;החדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים פעמיים עם 300 μl 1x PBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח שולטת חד מוכתמים ותאים ידי cytometry זרימת 14. </li></ol> המגון 6. של רקמת הריאה כדי לבודד RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההדבקה, לאסוף חתיכה קטנה של הריאות (20-40 מ&quot;ג) ולשמור אותו RNA ייצוב מגיב על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן, ולאחסן אותו ב -80 ° C עד לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את רקמות הריאה ב PBS 1x קר להיפטר של מגיב ייצוב RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את רקמת לתוך המאגר תמוגה המכיל צינור 1.5 מ&quot;ל צנטריפוגה (חיץ תמוגה 1 מ&quot;ל + 10 μl β-mercaptoethanol). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קוצצי הרקמה לחתיכות קטנות באמצעות מספריים מחודדים homogenize באמצעות עלי גלול מנוע אלחוטי עבור 20-40 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על lysate על קרח למשך 5 דקות ולהמשיך עם צעד 7.1. </li></ol> בידוד RNA 7. מן הריאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysate ב 18,000 XG במשך 3 דקות. הסר את supernatant ידי pipetting ובזהירות להעביר אותו צינור 1.5 מ&quot;ל חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 נפח של אתנול 70% על lysate. מערבבים מיד על ידי pipetting ולחכות 2-4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר עד 700 μl של lysate לעמודה ספין להציבבצינור אוסף 2 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 9,600 XG במשך 15 שניות וזורקים את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 350 μl לשטוף חיץ צנטריפוגות קפדני 9,600 XG במשך 15 שניות. מחק את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 80 μl DNase אני ישירות הממברנה טור ספין ולשמור אותו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 350 חיץ לשטוף מחמירים μl לעמודה ספין צנטריפוגות ב 9,600 XG במשך 15 שניות. מחק את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl RNA לשטוף חיץ צנטריפוגות ב 9,600 XG במשך 15 שניות. מחק את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl RNA לשטוף חיץ ספין על 9,600 XG למשך 2 דקות. מחק את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הטור ספין צינור צנטריפוגות הקולקציה החדשה 2 מ&quot;ל ב 9,600 XG דקות 1. מחק את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 30-50 מים RNase ללא μl ישירות לעמודת ספין צנטריפוגות ב 9,600 XG דקות 1. RNA החנות ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע RNA-seq ניתוח 14. </li></ol>

<ol><li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+physiological+roles+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Origin and physiological roles of inflammation.</a> Nature. 454, 428-435 (2008).</li>
<li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+inflammation%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Immunity, inflammation, and cancer.</a> Cell. 140, 883-899 (2010).</li>
<li>Barnes, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+of+asthma+and+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease.</a> Nat Rev Immunol. 8, 183-192 (2008).</li>
<li>Sethi, S., Murphy, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+in+the+pathogenesis+and+course+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease.</a> N Engl J Med. 359, 2355-2365 (2008).</li>
<li>King, P. T., Sharma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lung+Immune+Response+to+Nontypeable+Haemophilus+influenzae+%28Lung+Immunity+to+NTHi%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">The Lung Immune Response to Nontypeable Haemophilus influenzae (Lung Immunity to NTHi).</a> J Immunol Res. 2015, 706376(2015).</li>
<li>Kapur, N., Grimwood, K., Masters, I. B., Morris, P. S., Chang, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+airway+microbiology+and+cellularity+in+children+with+newly+diagnosed+non-CF+bronchiectasis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Pulmonol%22%5BJournal%5D)">Lower airway microbiology and cellularity in children with newly diagnosed non-CF bronchiectasis.</a> Pediatr Pulmonol. 47, 300-307 (2012).</li>
<li>King, P. T., Holdsworth, S. R., Freezer, N. J., Villanueva, E., Holmes, P. W. Microbiologic follow-up study in adult bronchiectasis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKing%2C+PT+%22Respir+Med%22">Respir Med</a>. 101, 1633-1638 (2007).</li>
<li>Shuto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+NF-kappa+B+by+nontypeable+Hemophilus+influenzae+is+mediated+by+toll-like+receptor+2-TAK1-dependent+NIK-IKK+alpha+%2Fbeta-I+kappa+B+alpha+and+MKK3%2F6-p38+MAP+kinase+signaling+pathways+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation of NF-kappa B by nontypeable Hemophilus influenzae is mediated by toll-like receptor 2-TAK1-dependent NIK-IKK alpha /beta-I kappa B alpha and MKK3/6-p38 MAP kinase signaling pathways in epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 8774-8779 (2001).</li>
<li>Moghaddam, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemophilus+influenzae+lysate+induces+aspects+of+the+chronic+obstructive+pulmonary+disease+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Haemophilus influenzae lysate induces aspects of the chronic obstructive pulmonary disease phenotype.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 629-638 (2008).</li>
<li>Rajagopalan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+exposure+to+bacterial+superantigens+induces+airway+inflammation+in+HLA+class+II+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Intranasal exposure to bacterial superantigens induces airway inflammation in HLA class II transgenic mice.</a> Infect Immun. 74, 1284-1296 (2006).</li>
<li>Ganesan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastase%2FLPS-exposed+mice+exhibit+impaired+innate+immune+responses+to+bacterial+challenge%3A+role+of+scavenger+receptor+A%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Elastase/LPS-exposed mice exhibit impaired innate immune responses to bacterial challenge: role of scavenger receptor A.</a> Am J Pathol. 180, 61-72 (2012).</li>
<li>Hogner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-expressed+IFN-beta+contributes+to+apoptotic+alveolar+epithelial+cell+injury+in+severe+influenza+virus+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Macrophage-expressed IFN-beta contributes to apoptotic alveolar epithelial cell injury in severe influenza virus pneumonia.</a> PLoS Pathog. 9, e1003188(2013).</li>
<li>Karisola, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+Natural+Killer+T+Cells+Play+a+Role+in+Chemotaxis%2C+Complement+Activation+and+Mucus+Production+in+a+Mouse+Model+of+Airway+Hyperreactivity+and+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Invariant Natural Killer T Cells Play a Role in Chemotaxis, Complement Activation and Mucus Production in a Mouse Model of Airway Hyperreactivity and Inflammation.</a> PloS one. 10, e0129446(2015).</li>
<li>Theivanthiran, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+E3+ubiquitin+ligase+Itch+inhibits+p38alpha+signaling+and+skin+inflammation+through+the+ubiquitylation+of+Tab1%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">The E3 ubiquitin ligase Itch inhibits p38alpha signaling and skin inflammation through the ubiquitylation of Tab1.</a> Sci Signal. 8, 22(2015).</li>
<li>Venuprasad, K., Zeng, M., Baughan, S. L., Massoumi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+role+of+the+ubiquitin+ligase+Itch+in+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multifaceted role of the ubiquitin ligase Itch in immune regulation.</a> Immunol Cell Biol. , (2015).</li>
<li>Decramer, M., Janssens, W., Miravitlles, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Chronic obstructive pulmonary disease.</a> Lancet. 379, 1341-1351 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בזאת, אנו מתארים הליך ייחודי פולשנית לחסן הריאות של עכברים עם פתוגן ריאות חיידקית. אנו מראים כי הליך זה יכול לשמש כדי לחקור את הפונקציה של גנים שונים באמצעות עכברים כי חסרים גנים של מסלולי איתות דלקתיים. הליך זה יכול לשמש גם כדי ללמוד את התגובות הדלקתיות לזיהומי ריאות ויראלית פטרייתי. היתרונות של הליך זה על פני שיטות אחרות כגון אף או שאיפת תרסיס הם (1) בהליך זה, הבידוד פתוגניים מוטמע ישירות דרכי הנשימה התחתונה; (2) את היכולת לשלוט על גודל הבידוד; ו (3) צמצם את הסיכון של חשיפת חייד...

דלקת היא מנגנון חיסון יסוד של הגנה מפני גורמים מזהמים. זה מקדם מיגור פתוגן ותיקון של רקמות אשר ניזוקו. זה גם מקל על שחזור למצב נורמלי בריא 1. עם זאת, דלקת dysregulated מובילה לעיתים קרובות מחלות דלקתיות כרוניות 2. דלקת דרכי הנשימה היא טריגר ראשוני למחלות ריאה שונים כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), אסטמה פיברוזיס ריאתי 3. אינפלואנזה המופילוס הלא typeable (unencapsulated) (NTHi) קשורה למחלות ריאה דלקתיות העליון כרונית והתחתון 4,5. זהו המין השולט שבודד את דרכי הנשימה התחתונה של ילדים ומבוגרים עם 4,6,7 מחלת ריאות חסימתית כרונית. התגובה הדלקתית לאחר ההדבקה NTHi מתאפיין הגברת הביטוי של ציטוקינים מעודדי דלקת (כגון TNF ו- IL-1β), וזה מתווכת בmitogen y פרוטאין קינאז מופעל (MAPK) גורם-κB גרעיני (NF-κB) באמצעות קולטנים דמוי האגרה (TLRs) 8. מודלי Mouse הם כלים שימושיים מאוד לניתוח הפתולוגיה הבסיסית של מחלה דלקתית ריאות בגלל הזמינות של קווי גן מחסר שונים. כמה שיטות שימשו לחסן חיידקים חיים / נחלש ומוצרים חיידקים, כולל החדרה אפי ו 9,10 משאיפת תרסיס. הנה, אנחנו מדגימים החדרת תוך-קנה נשימה. למרות בשימוש לעתים רחוקות, גישה זו היא יותר יעילה מאוד לשחזור בגלל המשלוח הישיר של הבידוד אל דרך הנשימה התחתונה.

<table><tbody><tr><td>צלחת אגר שוקולד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>CAS50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>דקסטרוז נטול מים</td><td>Themo Scientific</td><td>R01300</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Hospira, Inc</td><td>RL-3010</td><td></td></tr><tr><td>Deft פתרון מהיר</td><td>Sigma</td><td>GS500-500ML</td><td></td></tr><tr><td>מחט מזרק 20/26G&nbsp;</td><td>BD</td> <td>(REF305115/175)</td><td></td></tr> <tr><td>מזרק BD</td><td></td><td>REF 309602</td><td></td></tr><tr><td>קטטר 20GA</td><td>BD</td><td>REF</td><td></td></tr> 381433 <tr><td>מספריים לניתוח, ישר, באורך 10 ס"מ</td><td>kentscientific</td><td>INS600393</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים לאיריס, משוננים, 10 ס"מ</td><td>אורך kentscientific</td><td>INS650915</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה #5 נירוסטה, אורך 11 ס"מ</td><td>kentscientific</td><td></td><td></td>INS600095</tr><tr><td>10% פורמלין</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>CAS 67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>peqlab</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל צינורות פוליסטירן עגולים תחתונים</td><td>BD</td><td>REF 352058</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>Light Labs</td><td>A-7001-R</td><td></td></tr><tr><td>Reasy Mini&nbsp; kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>מנוע הדברה גלולה (הומוגיניזר רקמות)</td> <td>Sigma</td><td>Z359971-1EA</td><td></td></tr><tr><td>96 באר צלחות מיקרוטיטר V תחתון</td><td>תרמו</td><td>2605</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0454-81</td><td>דילול עבודה 1:100</td></tr><tr><td>Ly-6G-eFlor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-5931-82</td><td>דילול עבודה 1:100</td></tr><tr><td>BSA</td><td>HyClone</td><td>SH30574.03</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ליזה RBC (10X)</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>ערכת כתמי תאים מתים חיים / מתים</td><td>Invitrogen</td><td>L-34957</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5M)</td> <td>lifetechnologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>CD16/ CD32 FcBlock</td><td>BD</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Facs צינורות פוליסטירן צינור תחתון עגול</td><td>BD</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>Polyscience</td><td>4018</td><td></td></tr></tbody></table>

מנהל intra-קנה נשימה של<em&gt; אינפלואנזה המופילוס</em&gt; בעכברי מודל לחקר airway דלקת

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

כאן אנו מתארים הליך מפורט ביעילות ישירות לספק אינפלואנזה המופילוס לתוך שטחי הנשימה התחתונות של עכברים. אנו מדגימים את הליך הכנת H. בידוד אינפלואנזה, החדרת תוך-קנה נשימה של H. אינפלואנזה לתוך הריאות, אוסף של נוזל שטיפת broncho-מכתשים (BALF), ניתוח של תאים חיסוניים BALF, ובידוד RNA עבור ניתוח ביטוי גני הפרש. הליך זה יכול לשמש כדי לחקור את תגובת הריאות דלקתית לכל חיידקים, וירוסים או פטריות. החדרה קנה נשימה ישירה היא המועדפת בעיקר על נהלי משאיפת אפים או תרסיס כי זה יותר יעיל מספק את בידוד החיידקים לתוך דרך הנשימה התחתונה עם עמימות פחות.

החדרת Intra-קנה נשימה הביאה מספר גדל במידה ניכרת של לויקוציטים ב BALF (איור 1 א &#39;, פנל משמאל) מ התקנה עם מי מלח. ניתוח ספירת ההפרש של לויקוציטים הראה חדיר נויטרופילים עלו בבירור (איור 1, פנל מימין). הניתוח FACS של התאים BALF עוד חיזק את מספר גדל של נויטרופילים (איור 1B). ניתוח היסטולוגית סעיפים H &amp; E מוכתם של רקמת הריאה והראה הגדילה ודלקות בדרכי הנשימה (איור 1 ג). נתונים אל...

אנו מדגימים את ההליך לחיסון תוך קנה הנשימה של המופילוס אינפלואנזה לדרכי הנשימה התחתונות של עכברים. זהו כלי שימושי מאוד לחקר מסלולי איתות המווסתים דלקת בדרכי הנשימה במודלים של עכברים.

מנהל Intra-קנה נשימה של<em&gt; אינפלואנזה המופילוס</em&gt; בעכברי מודל לחקר Airway דלקת

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לחקור את התגובות החיסוניות בריאה במהלך זיהום חיידקי. נושא זה עשוי לסייע במתן מענה לכמה שאלות מפתח בתחום הדלקת של הריאות, כגון מהם מנגנוני הבקרה והגנים המרכזיים המעכבים או מקדמים דלקת בריאות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יעילה מאוד ובעלת הדירות גבוהה, וזאת בשל ההחדרה הישירה של האינוקולום החיידקי למסיל הנשימה התחתונה.כדי להתחיל, זרעו את ה-NTHi על צלחת אגר שוקולד. דגרו את הצלחת כשהיא הפוכה למשך לילה, ב-37 °C עם 5% carbon dioxide. למחרת, גדלו את החיידקים במצע גידול brain-heart infusion broth.לאחר מכן, הוסיפו למבחנה של מיקרוצנטריפוגה מיליליטר אחד של המצע הנוזלי. סבבו את התערובת במהירות של 4,000 g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השליכו את הנוזל העליון (supernatant) ותלו את המשקע (pellet) במיליליטר אחד של PBS.חזור על שלב שטיפה זה פעם נוספת. לאחר מכן, דלל 100 µL מהתמיסה שהושבה ב-900 µL של PBS, ומדוד את הבליעה של התרבית ב-600 nm. השתמש במידע זה כדי להתאים את האינוקולום ל-20 מיליון CFUs ל-mL.בשלב הבא, קבעו את החיוניות ואת ה-CFUs של האינוקולום. זרעו מהדלול במדורי סדר (serial dilutions) של המצע הנוזלי בין אחת לעשר דלולות על צלחות אגר שוקולדה, והדגירו את הצלחות למשך לילה. התחילו בהרדמת העכבר, וודאו כי הוא מורדם כראוי באמצעות צביטה בבוהן.לאחר מכן, הנח את העכבר במצב גב וגלח את האזור הוונטרלי של הצוואר. חטא את העור החשוף. כעת, הרם את העור של החלק הוונטרלי העליון של הצוואר באמצעות פינצטה לשיני חולדה, ובעזרת סקלפל, בצע חתך של חצי סנטימטר עד סנטימטר אחד מעל הטימוס.לאחר מכן, הפרד בזהירות את השריר כדי לחשוף את הקנה. הזרק לאט אל תוך הקנה 50 µl של אוויר, לאחר מכן 50 µl של NTHi שהוכן, ולאחר מכן 50 µl נוספים של אוויר. לצורך הליך ביקורת שלילית, הזרק תמיסת מלח (saline) במקום NTHi.לאחר ההזרקה, החזיקו את החיה במצב אנכי למשך כדקה. לאחר מכן, סגרו את החתך באמצעות דבק לרקמות והשאירו את העכבר במצב שכיבה על הצד ובסביבה חמה למשך כ-10 דקות. 24 שעות לאחר ההדבקה, בצעו הרדמה למטרת קטילת (euthanize) החיה המודבקת ופתחו את חלל הבטן באמצעות מספרי אנטומיה.לאחר מכן, חתכו את האבי העורקים הגחוני (ventral aorta) כדי לנקז את הדם מהחיה. לאחר מכן, חשפו את החלק הגחוני של הריאה כדי לגשת לקנה הנשימה. בצעו אינטובציה לקנה הנשימה באמצעות קטטר במידה 20 gauge.בעזרת הקטטר, החדירו 0.8 milliliters של באפר BALF ואספו את נוזל השטיפה באמצעות שאיבה דנטלית. חזרו על פעולה זו שלוש פעמים נוספות, ואיחדו את ארבעה דגימות השטיפה לתליה אחת. קחו אליקוט של 100 microliter וסובבו בצנטריפוגה במשך שתי דקות במהירות של 2,000 RPM.הסיר את הנוזל העליון (supernatant) וסספנד מחדש בבופר לליזה של RBC. סבב במהירות גבוהה (Spin down) וסספנד מחדש את המשקע ב-1x PBS. כעת, ספור את מספר התאים הכולל ב-100 microliters של הסספנסיה באמצעות המוציטומטר תחת הגדלה של 10x עם צביעת trypan blue.לאחר מכן, הכינו למשטחים לצביעת התאים. העבירו מזיקה (aliquot) של 100 µL מתלי suspension של BALF לבארים המתאימות של למשטחי cytospin, וסובבו את הלמשטחים ב-500 g למשך חמש דקות. לאחר מכן, ייבשו את הלמשטחים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, וצבעו את התאים באמצעות צבע Giemsa שעבר התאמה בהתאם לפרוטוקולים של היצרן.השתמש בתאים הנותרים עבור אנליזות המשך, כגון FACS, מיקרוסקופיה קונפוקלית וכדומה. לאחר איסוף נוזל השטיפה (lavage) מהריאה המודבקת, קח פיסה של 20-40 milligrams של רקמת ריאה והדגר אותה ב-RNA stabilizing reagent בטמפרטורה של 4 °C למשך לילה, ולאחר מכן שמור אותה לאורך זמן ב-80 °C-. כאשר תהיה מוכן, שטוף את דגימות רקמת הריאה ב-PBS קר כדי להסיר את ה-RNA stabilization reagent.לאחר מכן, העבירו את הרקמה לשפופרת צנטריפוגה של 1.5 milliliter המכילה lysis buffer עם beta mercaptoethanol. בשלב הבא, קצצו את הרקמה לחתיכות קטנות בעזרת מספריים קטנים והומוגניזו את החתיכות באמצעות pestle ממונע למשך 20-40 שניות. השאירו את הליזאט על קרח למשך חמש דקות, ולאחר מכן סובבו אותם בצנטריפוגה ב-18,000 g's למשך שלוש דקות.הסר בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) והעבר אותו למבחנה חדשה. לאחר מכן, הוסף נפח אחד של 70% ethanol וערבב את התערובת באמצעות טריטורציה (trituration). השאר את התערובת במצב מנוחה בטמפרטורה של 25 degrees Celsius למשך שתיים עד ארבע דקות.לאחר מכן, העבירו עד 700 µL לעמודת ספינ (spin column) על שפופרת איסוף של 2 mL וסבבו את העמודה בצנטריפוגה ב-9600 g למשך 15 שניות. השליכו את הנוזל שעבר (flow-through), הוסיפו 350 µL של בופר שטיפה וחזרו על פעולת הסבב. לאחר מכן, דגרו את הממברנה עם 80 µL של תמיסת DNase I למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, הוסף 350 microliters של בופר שטיפה לעמודה וחזור על הסבוב. לאחר מכן, הוסף 500 microliters של בופר שטיפה ל-RNA. חזור על הסבוב הקצר, והשלך את הנוזל שעבר דרך העמודה.בצעו שני שטיפות עם תמיסת שטיפת RNA. לבסוף, מעל מבחנה לאיסוף חדשה, הוסיפו 30-50 µL של מים נקיים מ-RNase ישירות לעמודה וסובבו אותה במשך דקה אחת כדי לאסוף את דגימת ה-RNA בתסנן. הפרוצדורה בוצעה כפי שתואר עם עכברים בריאים ונורמליים.החדרה תוך-קשייתית (Intratracheal installation) הובילה לעלייה ניכרת במספר הלויקוציטים בנוזל שטיפת ברונכ'ו-אלבולארית (BALF) של עכברים שזוהמו ב-NTHi, בהשוואה לקבוצות ביקורת שטופלו בתמיסת סלין. ניתוח ספירה מבדלת של הלויקוציטים מראה בבירור חדירה מוגברת של נויטרופילים. ניתוח עובדתי (Facts analysis) של התאים ב-BALF מאשש עוד יותר את העלייה במספר הנויטרופילים.חתכים של רקמת ריאה שנצבעו ב-HNE מראים דלקת מוגברת בדרכי הנשימה. במבט כולל, נתונים אלו מצביעים על כך שהחדרה תוך-קנה (intratracheal installation) גורמת לדלקת בדרכי הנשימה בעכברים. בניסוי דומה עם עכברי ביקורת ועכברים מוטנטים, RNA מרקמת ריאה נותח באמצעות ריצוף של כל התעתוקים (whole transcriptome sequencing).בהשוואה לבקרי פרא (wild-type), מחסור ב-Itch הוביל לביטוי דיפרנציאלי של מספר גנים. Itch נחשב לווסת של מסלולי איתות דלקתיים, ולכן ניתן להשתמש בתוצאה זו כדי לקדם מחקרים חדשים. לאורך כל התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום מחלות הריאה לבחון איתות תאי בתאי מערכת החיסון במהלך זיהום ודלקת בריאות.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לנקוט באמצעי זהירות מוגברים במהלך שלבים כגון חשיפת הקנה והחדרת חיידקים לקנה. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע את ההחדרה התוך-קנאית (intratracheal installation) תוך עשר דקות, ולאסוף את נוזל הבקבוקון תוך 10-15 דקות. לאחר פרוצדורה זו, ניתן לבצע בדיקות נוספות כגון ריצוף RNA, ציטומטריית זרימה (flow cytometry) וחסימה אימונולוגית (immunoblocking) כדי לענות על שאלות נוספות, כגון אילו גנים מראים ביטוי מוגבר (upregulated) או מופחת (downregulated).

intra-tracheal-administration-haemophilus-influenzae-mouse-models-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: Venuprasad, K., et al. מתן תוך-קנה של המופילוס אינפלואנזה במודלים של עכברים לחקר דלקת בדרכי הנשימה. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים את האספקה התוך-קנה של חיסון חיידקי פתוגני ריאתי לעכבר מורדם כדי להדגים זיהום בדרכי הנשימה התחתונות.

ביצוע אספקת חיידקים תוך קנה הנשימה במודל עכבר

מקור: Venuprasad, K., et al. מתן תוך-קנה של המופילוס אינפלואנזה במודלים של עכברים לחקר דלקת בדרכי הנשימה. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים את האיסוף והעיבוד של נוזל שטיפת הסימפונות מעכבר שעבר המתת חסד שנדבק בהמופילוס אינפלואנזה שאינו ניתן לסוג לניתוח במורד הזרם.

איסוף נוזל שטיפת סימפונות מדגם עכבר נגוע בהמופילוס אינפלואנזה שאינו ניתן לסוג

מקור: לנהרד, א. ואחרים. מודל עכבר למעבר של Streptococcus pneumoniae ממתיישב לפתוגן בעקבות זיהום נגיפי משחזר מחלה שהוחמרה על ידי הגיל. J. Vis. Exp. (2022)הסרטון הזה מדגים מודל זיהום משותף לעכברים, שבו נגיף השפעת מפעיל את המעבר של Streptococcus pneumoniae ממתיישב לפתוגן. הוא מפרט את השלבים המעורבים בהתיישבות חיידקית, זיהום ויראלי והתקדמות מחלה.

מודל עכבר לחקר המעבר הפתוגני של Streptococcus pneumoniae בעקבות זיהום נלווה ויראלי

אנחנו פיתחנו שיטה פשוטה, אמינה, וזולה יחסית לאינטובציה endotracheal בעכברים באמצעות laryngoscopy הישיר באמצעות אוטוסקופ עם ספקולום 2.0 מ"מ. טכניקה זו היא atraumatic ויכולה לשמש למדידות חוזרות בניסויים כרוניים. אנחנו מוצאים את זה מעולה להנשמה או בעבר דיווח טכניקות נזקקה לניתוח.

Endotracheal אינטובציה בעכברים<em&gt; דרך</em&gt; ישיר laryngoscopy באמצעות אוטוסקופ

התגובה החיסונית המארחת לזיהום הפתוגן היא תהליך מוסדר היטב. ניצול מודל חשיפת ריאות lipopolysaccharide בעכברים, ניתן לבצע הערכות ברזולוציה גבוהה של המנגנונים המורכבים הקשורים להיווצרות מחלה.

הניצול של לוע התחתון Intratracheal PAMP מנהל ושטיפה ברונכואלוואולרית כדי להעריך את תגובת מארח חיסון של עכברים

intratracheal החדרת תיווך אינטובציה (IMIT) של חומרים כימיים היא שיטה מצוינת, לא פולשנית ללימוד מחלות בדרכי הנשימה, כמו גם שיטה להחדרת חומרים כימיים טיפוליים ישירות לתוך הריאות. זוהי שיטה מהירה ושחזור ביותר אשר מתאימה לניסויים פרה-קליניים.

Intratracheal החדרת תיווך אינטובציה (IMIT): מערכת לא פולשני, ריאות ספציפי משלוח

יש חוסר ידע כללי על אופן פעולת החיסונים. כאן אנו מציעים שימוש משולב בגנטיקה הפוכה ועכברים כימריים של מח עצם כדי לקבל תובנה לגבי התגובות החיסוניות המוקדמות של המארח לחיסונים עם דגש מיוחד על תאים דנדריטיים וחסינות תאי T.

Intranasal המינהל של החיסונים שפעת רקומביננטי במודלי כימרי עכבר ללמוד חסינות רירית

מספר שיטות תוארו בספרות למידול דלקת ריאות חיידקית בעכברים. בזאת, אנו מתארים לא פולשנית, לא יקר, שיטה מהירה גרימת דלקת ריאות באמצעות שאיפה (כלומר, שאיפה) של בידוד חיידקי pipetted לתוך הלוע התחתון. שיטות Downstream להערכה של התגובה החיסונית המולדת ריאתי הם גם מפורטות.

שיטה לא פולשנית הטכנית ללא עתירי עבור אינדוקצית phenotyping של דלקת ריאות חיידקית הניסויית עכברים

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול לבצע שני הפוטונים intravital הדמיה ותא ניתוח אינטראקציות בין רירית והכו אותי מאתר לאחר ההדבקה בנגיף שפעת. פרוטוקול זה יהיה רלוונטי עבור החוקרים ללמוד את הדינמיקה תא החיסון במהלך זיהומים בדרכי הנשימה.

אינטראקציה תא הדמיה ב רירית והכו אותי במהלך זיהום בנגיף שפעת באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים Intravital

כאן אנו מציגים פרוטוקול אלגנטי ויוו הערכה של חיסון היעילות ומנחה תגובות מערכת החיסון. פרוטוקול זה ניתן להתאים מודלים חיסון ללמוד ויראלי, חיידקי, או טפילים פתוגנים.

הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים

פרוטוקול זה מספק הוראות למתן תוך-אף של IAV וניתוח במורד הזרם של נזק לריאות עכברים ושינויים שעתוק נלווים לסוגי תאי ריאה.

מידול תיקון דיספלסטי ותפקודי של מכתשית ריאות לאחר זיהום בשפעת

חקור תגובות חיסון בריאות בעכברים באמצעות הזרקה תוך-קניתית של Haemophilus influenzae. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני דלקת בדרכי הנשימה וזיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות.

מנהל Intra-קנה נשימה של

גלה סרטונים נוספים