שיטות לחקר Mrp4 המכילים מכלולים Macromolecular בחוק הסדרת פיברובלסטים הגירה
19 במאי 2016
MRP4 מסדיר אירועי איתות נוקלאוטיד תלוי מחזוריים שונים, כולל תפקיד הובהר לאחרונה נדידת תאים. אנו מתארים גישה ישירה, אך רבה לפענח את המטרות המולקולריות במורד הזרם של MRP4 וכתוצאה מכך ההזדהות של interactome MRP4 ייחודי שמנגן תפקידי מפתח בוויסות מכוונת-הקנס של הגירה פיברובלסטים.
המטרה הכוללת של הליך ניסיוני זה היא לצפות בוויסות תלוי AMP מחזורי של נדידת פיברגלסט על ידי MRP4. מיקרוסקופיה עם מגע גבוה יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של התא. לדוגמה, בנוסף להענקת עמידות לנבט, MRP4 יכול גם לווסת תהליכים פיזיולוגיים כגון נדידת תאים על ידי אפנון ריכוז הנוקלאוטידים המחזוריים התוך-תאיים. היתרון העיקרי של הדמיית FRET שאנו הולכים לנסות היום הוא לאפשר ניטור של הדינמיקה התוך-תאית של AMP מחזורי וקינאז תלוי AMP מחזורי בזמן אמת. המשמעות של מיקרוסקופיה במגע גבוה היא שניתן להשתמש בה בגילוי תרופות. לאחר הגדרת המערכת, כל המכשיר מוגדר, אין התערבות אנושית מעורבת במשימה מבוססת צלחת זו. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי נדידת תאים, ניתן ליישם אותה על מערכות אחרות, כגון אי-פרידת תאי שפתיים, הדמיה במגע גבוה של הרג תאי חיסון, דילול קריר יותר, אנגיוגנזה, התפשטות תאים, כימוטקסיס ופיליט טריטי. כדי להכין תאים למיקרוסקופיה במגע גבוה מתחת למכסה המנוע של תרבית תאים, השתמש בתמיסת פיברונקטין של אחוז אחד ב-PBS כדי לצפות את הבארות של צלחת 96 בארות. דגרו את הצלחת בחממת CO2 ב-37
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
MRP4 מעורב בויסות אירועי איתות תלויים בנוקלאוטיד מעגלי וממלא תפקיד מכריע בנדידת תאים. מחקר זה מזהה אינטראקטום ייחודי של MRP4 החיוני לוויסות נדידת פיברובלסטים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- נדידת תאים
- מסלולי איתות
- ביולוגיה של פיברובלסטים
רקע
- MRP4 הוא נשא (transporter) המשפיע על מסלולי איתות שונים.
- הבנת תפקידו של MRP4 עשויה לספק תובנות לגבי מנגנוני נדידה של תאים.
- פיברובלסטים הם שחקני מפתח בתיקון ובהתחדשות של רקמות.
- זיהוי חלבונים המקשרים ל-MRP4 עשוי לחשוף מטרות טיפוליות חדשות.
מטרת המחקר
- לבאר את המטרות המולקולריות במורד המסלול של MRP4.
- לבחון את תפקידו של MRP4 בנדידת פיברובלסטים.
- לאפיין את האינטראקטום של MRP4.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- זיהוי אינטראקטורים של MRP4 באמצעות בדיקות ביוכימיות.
- ניתוח של מסלולי איתות המושפעים מ-MRP4.
- בדיקות נדידת תאים להערכת תוצאות פונקציונליות.
- שימוש בטכניקות של ביולוגיה מולקולרית לחקר אינטראקציות בין חלבונים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי אינטראקטום ייחודי הקשור ל-MRP4.
- הדגמה של תפקידו של MRP4 בבקרת נדידת פיברובלסטים.
- תובנות לגבי מסלולי השהייה המודולים על ידי MRP4.
- השלכות פוטנציאליות לאסטרטגיות טיפוליות המכוונות לנדידת תאים.
מסקנות
- MRP4 הוא רגולטור קריטי של נדידת פיברובלסטים.
- האינטראקטום של MRP4 מספק נתיבים חדשים למחקר.
- הבנת תפקידו של MRP4 עשויה להוביל להתקדמות בטיפולים לשיקום רקמות.
שאלות נשאלות שכיחות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנת הוויסות המתווך על ידי MRP4 של נדידת פיברובלסטים מספקת תובנות מכניסטיות לגבי איתות של נוקלאוטידים ציקליים בהקשרים של תיקון רקמות. עבודה זו תומכת בתיקוף המטרה על ידי מיפוי אינטראקטומים של חלבונים המודולטורים של פנוטיפים של נדידה הרלוונטיים לפיברוזיס ולריפוי פצעים. גישה זו מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית ל-MRP4 כמטרה במודלים פרה-קליניים של אקטיבציה סטרומלית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: זיהוי קומפלקסים של חלבונים הקשורים ל-MRP4 המקשרים תפקודית בין פעילות הנשא לבין עיצוב מחדש של השלד התאי באמצעות F-actin.
- ערך תפעולי: מאפשר בחינה של צמתי סיגנלינג תלוי-MRP4 באמצעות co-immunoprecipitation ומספקטרומטריית מסות לצורך הפחתת סיכונים של מטרות טיפוליות.
- ערך מדעי: הבהרת תפקידו של MRP4 בויסות רמות cAMP/cGMP, תוך קישור תפקוד הנשא לבקרת נדידה תלוית-PKA.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מבסס בדיקות נדידה של פיברובלסטים כקריאה תפקודית לסריקת מודולטורים של MRP4 בפורמט של 96 בארות.
- ערך תפעולי: תומך בתהליכי עבודה של דימוי בעל תוכן גבוה (high-content imaging) להדמיה בזמן אמת של פעילות PKA באמצעות ביו-סנסורים של FRET בתאים נודדים.
- ערך מדעי: מגדיר את שלמות שלד האקטין ואת פעילות ה-PKA כאפקטורים הכרחיים במורד ה-MRP4 בבדיקות נדידה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: ממצב את MRP4 כמודולטור של נדידת פיברובלסטים הרלוונטית להפעלה סטורומלית במודלים של פיברוזיס ותיקון רקמות.
- ערך תפעולי: מספק מערכת רלוונטית למחלה להערכת תרכובות המכוונות ל-MRP4 לצורך ויסות פנוטיפים של נדידה במסגרות פרה-קליניות.
- ערך מדעי: מקשר בין אובדן תפקוד של MRP4 לבין רמות מוגברות של נוקלאוטידים ציקליים ועלייה בנידידה, ובכך תומך בתיקוף מטרה התואם ביומארקרים.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה תומכת בתהליכי עבודה לגילוי מוקדם על ידי קישור בין פרופיל האינטראקטום של MRP4 לתוצאות נדידה תפקודיות, ובכך מאפשרת תרגום של מטרה לבדיקה (target-to-assay) בתוכניות מחקר של ביולוגיה סטרומלית.
- ביולוגיה של הגילוי: מקלה על בדיקת היפותזות של אינטראקטורים של MRP4 במסלולי איתות של cAMP/PKA השולטים בניידות פיברובלסטים.
- סריקה: מאפשרת סטנדרטיזציה של בדיקות באמצעות נדידת פיברובלסטים ומדדי PKA מבוססי FRET לצורך פרופיל של השפעת תרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת נתונים כמותיים של נדידה ואיתות להשוואת מודולציה גנטית או פרמקולוגית של MRP4.
- מחקר תרגומי: תומכת ברצף פרה-קליני על ידי קישור פעילות MRP4 לנדידת פיברובלסטים במודלים רלוונטיים לתיקון רקמות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר לחקר שטף נוקלאוטידים מחזוריים המתווך על ידי נשאים בהקשרי נדידה ואיתות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון מכניסטי בתפקידו של MRP4 בנדידה באמצעות אפקטורים מוגדרים (F-actin, PKA) ובבקרת נוקלאוטידים מחזוריים.
- ערך תפעולי: מספק בדיקות נדידה ודימוי סטנדרטיות וניתנות לשחזור, התואמות לסריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening).
- ערך אסטרטגי: משפר את הביטחון בבחירת מטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בפנוטיפים סטרומליים הקשורים ל-MRP4.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מודולטורים של MRP4 מותאם-סיכון, בהתבסס על נתוני נדידה ומודולציה של מסלולים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות ב-immunoprecipitation, בספקטרומטריה של מסות וב-Ingenuity Pathway Analysis לצורך זיהוי האינטראקטום (interactome).
- תלוי בתשתית של מיקרוסקופיה בתוכן גבוה (high-content microscopy) ובביוסנסורי FRET לניטור בזמן אמת של פעילות PKA.
- מחייב בדיקות סטנדרטיות של נדידת פיברובלסטים באמצעות פלטות מצופות בפיברונקטין ומודולציה מבוקרת של נוקלאוטידים מחזוריים.
- כולל שיקולי התאמה ליישום של מדד הנדידה בסוגי תאים אחרים או במודלים של רקמה תומכת (stromal models).
- מוגבל בשל הצורך במערכות מאושרות של ביטוי יתר (overexpression) וביטול ביטוי (knockout) של MRP4, כדי לבודד השפעות פונקציונליות ואינטראקטומית ספציפיות.
