Name: שילוב קרינה זוגית באתרו כלאה עם Immunolabelling עבור איתור של הביטוי של שלושה גנים בסעיפי מוח עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: למד שילוב של היברידיזציה זוגית באתרו עם אימונולייבלינג לאיתור ביטוי שלושה גנים במוח עכבר. שיטה זו מאפשרת מיפוי גני לתאים ספציפיים ללא צורך בנוגדנים לכל המטרות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה במעבדות המחברים נתמכה על ידי מועצת המחקר הבריטית לביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה (BB/J006602/1 ו-BB/L003236/1), קרן וולקאם (WT100269MA) ומועצת המחקר האירופית (ERC, תוכנית "רעיונות" 293544). SJ נתמך על ידי מלגה ארוכת טווח של EMBO. המחברים מודים לסטיבן גרנט על עזרתו הטכנית.

משפט ואתיקה: בעלי וטיפול Mouse הם בהתאם לתקנות משרד הפנים בבריטניה והנחיות ועדת האתיקה UCL, עולות בקנה אחד עם בעלי חיים (הליכים מדעיים) Act 1986 של הממלכה המאוחדת ותקנות תיקון ל -2012. הערה: כל הפתרונות צריכה להיעשות עם diethyl pyrocarbonate (DEPC) - מים מטופלים להרוס כל RNase שיורית. לטיפול DEPC, להוסיף DEPC (1 מ&quot;ל לליטר), לנער במרץ עד שכל כדוריות DEPC נעלמו אז החיטוי כדי לבזות את DEPC. סינתזה 1. RNA Probe <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות: בעת טיפול לפוראמיד, ללבוש ציוד מגן אישי (PPE) ולהשתמש בארון בטיחות. הכן חיץ הכלאה: מים ללא יונים DEPC שטופלו עם 50% (v / v) לפוראמיד deionized, 200 מ&quot;מ NaCl, 5 מ&quot;מ EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 מ&quot;מ לאא 2 4 PO, 5 מ&quot;מ Na 2 HPO 4, 0.01 מ&quot;ג / tRNA שמרים מיליליטר, 1 × soluti של Denhardtעל, ו -10% w / v סולפט dextran. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר שיבוט DNA המכיל את רצף cDNA של הגן של עניין פלסמיד עם היזמים RNA פולימראז. בדוגמה זו, השתמש שיבוט pCMV-SPORT6, IRAVp968C0654D (GenBank accessionBC024934), עם T7 ומקדמי פולימראז SP6 רנ&quot;א עבור Aspa (איור 1 משלים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ה- DNA פלסמיד לינארית כתבנית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את שיבוט DNA, לחלץ את הפלסמיד עם ערכת טיהור פלסמיד בקנה מידה קטן פי פרוטוקול ורצף של היצרן עם T7 ו פריימרים אוניברסלי SP6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקציר פלסמיד דנ&quot;א 1,020 מיקרוגרם עם אנזים הגבלה שחותך בסוף &#39;5 של גדיל תחושה של cDNA. בדוגמה זו, השתמש 100 יחידת סאל לי לעכל את הפלסמיד Aspa pCMV-SPORT6-. דגירה של 1.5 שעות ב 37 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל aliquot קטן על ג&#39;ל agarose לבדוק כי פלסמיד לינארית לגמרי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר אתהפלסמיד לינארית באמצעות כלורופורם פנול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1/10 נפח של נתרן אצטט M 3, כרך אחד של 10 מ&quot;מ טריס HCl (pH 8.0) - פנול equilibrated ונפח אחד של כלורופורם / isoamyl אלכוהול (רש&quot;ת) (24: 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 16,000 דקות 1 ב RT (20 - 25 ° C, RT) ולחלץ בשלב מימי עליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף נפח אחד של כלורופורם / רשות עתיקה, צנטריפוגות ב XG 16,000 דקות 1 ולחלץ בשלב מימי עליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 1.4.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 2 כרכים של אתנול ולהשאיר ב -20 o צלזיוס במשך שעה 1. או O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 16,000 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הכדור עם אתנול קר 70% מחדש להשעות ב cDNA approximatively 1 מיקרוגרם לכל 2.5 μl ב TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7.5). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז את שתי בדיקות, אחת שכותרתו עם Digoxigenin (DIG) והשני עם isothiocyanate והעמסת (FITC). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את RNA פולימראז המתאימה לעשות את-se אנטיחללית NSE (משלימה היעד mRNA). בדוגמה זו, השתמש RNA פולימראז T7 לעשות בדיקה Aspa. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בתגובה שעתוק במבחנה: להוסיף 1 מיקרוגרם של ה- DNA לינארית, 4.0 μl 5 חיץ שעתוק x, 6.0 μl של 100 מ&quot;מ DTT, 2.0 μl של 10x תערובת תיוג RNA DIG או FITC dNTPs המכיל, 1 מעכב RNase μl, ו 20 - 40 יחידות של RNA פולימראז; להפוך את עוצמת הקול הסופי עד 20 μl במים שטופלו DEPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלסיוס במשך 1.5 שעות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> μl Run1 של תגובת השעתוק על ג&#39;ל agarose 1.0% לבדוק שהתגובה עבדה. הג&#39;ל צריך להראות את התבנית לינארית להקה בהירה של החללית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את עוצמת הקול עד 100 μl עם חיץ הכלאה ולאחסן 10 aliquots μl ב -80 ° C. </li></ol> 2. זלוף, קיבוע אוסף רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות: בעת טיפול paraformaldehyde (PFA), הן מוצקותמימית, ללבוש PPE ולהשתמש בארון בטיחות. כן פתרון פורמלדהיד ידי המסת 4% (w / v) PFA לתוך 1x בופר פוספט (PBS) פתרון באמצעות חום (55 מעלות צלזיוס). סנן פתרון פורמלדהיד עם נייר סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן תמיסת סוכרוז על ידי המסת 20% (w / v) סוכרוז במים מזוקקים ולהוסיף 0.1% (v / v) פתרון DEPC. השאר O ​​/ N ב RT עם מכסה רופף ולאחר מכן חיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סופני לטשטש עכבר ידי הזרקה תוך הצפק של pentobarbitone (50 מ&quot;ג / ק&quot;ג). להעריך את עומק ההרדמה על ידי צביטת בוהן והיעדר רפלקס נסיגה מצביע הרדמה עמוקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העכבר הוא בהרדמה עמוקה, עושה חתך מתחת לבית החזה וחתך דרך כלוב הצלעות משני הצדדים, להרים אותו כדי לחשוף את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחט 25-G לתוך החדר השמאלי של הלב. ביצוע חתך קטן העלייה הימנית של הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse החיה עם 20 מ&quot;ל PBS ולאחר מכן 40 בתמיסת פורמלדהיד מ&quot;ל. עבור P30 ומעלהעכברים, השתמש שיעור זלוף של 12 מ&quot;ל / דקה אלא גם לבעלי חיים צעירים להשתמש בשיעור נמוך יותר (7 - 10 מ&quot;ל / דקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנתח את המוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את ראש העכבר עם מספרי כירורגיות על ידי יצירה אחורית לחתוך מהאוזניים. ביצוע חתך קו אמצע זנב בעור ולעבוד rostrally להסיר את העור מפני גולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מחלק הזנב, לחתוך דרך החלק העליון של הגולגולת לאורך קו אמצע בין העיניים עם מספרי איריס. הסר את הקודקודית וצלחות עצם הפרונטלית ידי הטיית צד אחד של לוחית עצם בכל פעם ומאכל את זה עם פינצטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להטות את המוח כלפי מעלה מהחלק הקדמי עם פינצטה וחותכי עצבי הראייה ואת עצבי גולגולת אחרים. הרם בעדינות את המוח מתוך הגולגולת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את המוח לתוך מטריצת מוח עטרת עכבר. פורסים את המוח לחתיכות 3 כ 4 מ&quot;מ עם סכין גילוח נוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את פרוסות לתוך פתרון 4% PFA דגירה O / N ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוח העברהפרוסות DEPC שטופלו 20% תמיסת סוכרוז דגירה O / N ב 4 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח כל פרוסת מוח לתוך cryomould יבש, להקיף עם מדיום טמפרטורת חיתוך אופטימלי (אוקטובר) ו הקפאת קרח יבש. חנות ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> 3. Cryosectioning <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 15 מיקרומטר חלקים של הרקמה הקפואה בתוך cryostat ולאסוף את החלקים על גבי שקופיות מיקרוסקופ. במידת הצורך, להרטיב את החלקים עם PBS DEPC שטופלו ולשטח אותם עם מכחול בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את השקופיות להתייבש במשך כ 1 hr על מנת להבטיח כי הרקמה שומרת על השקופית. </li></ol> הכלאה 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 65 ° C לשטוף חיץ: 150 מ&quot;מ NaCl, 15 מ&quot;מ Na 3 C 3 H 5 O (COO) 3 (= נתרן ציטרט מלוחים 1x), 50% (v / v) לפוראמיד ו -0.1% (v / v) Tween- 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ MABT: 100 חומצה maleic מ&quot;מ, 150 מ&quot;מ NaCl, 0.1% (v / v) Tween-20, pH 7.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את שתי חלליות (DIG שכותרתו FITC-Labelleד) 1 / 1,000 במאגר הכלאה מחומם מראש ל 65 מעלות צלזיוס ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בסביבות 300 μl של תערובת הכלאה על כל שקופית, coverslipwith אפויים בתנור (200 מעלות צלסיוס) coverslips דגירה O / N ב 65 מעלות צלזיוס בתא humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שקופיות לתוך צנצנת Coplin המכיל חיץ לשטוף מחומם מראש. שטפו את השקופיות למשך 30 דקות פעמיים ב 65 מעלות צלזיוס עם חיץ לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השקופיות עבור 10 דקות שלוש פעמים עם MABT ב RT. </li></ol> ויזואליזציה 5. של החללית FITC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין חיץ חסימה שאני עורך: MABT עם מגיב חסימת 2% ו -10% בסרום כבשי חום מומת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: להשתמש בעט הידרופובי לצייר עיגולים סביב קטעי רקמה בשקופית כדי לצמצם את היקף פתרונות נוגדנים הנדרשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות במשך שעה 1 ב RT עם ISH חיץ חסימת בתא humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות O / N ב 4 ° C עם peroxidase חזרת (POD) - המצומדנוגדן אנטי FITC ד בדילול 1/500 (v / v) ב ISH חסימת חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות לתוך צנצנת Coplin המכיל PBS עם 0.1% (v / v) Tween-20 (PBST). לשטוף 3 פעמים במשך 10 דקות ב PBST ולהחליף PBST טרי בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לפני השימוש, להכין את tyramide ניאון על ידי דילול 100 פעמים לתוך diluent הגברה. בדוגמה זו, השתמש FITC-tyramide. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את זה את השקופיות ולהשאיר למשך 10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות לתוך צנצנת Coplin לשטוף 3 פעמים ב PBST במשך 10 דקות. </li></ol> ויזואליזציה 6. של החללית DIG <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 0.1 M כמה העצוב HCl pH 8.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת השקופיות עם חיץ חסימה שאני עורך עבור שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות O / N ב 4 ° C עם phosphatase אלקליין (AP), מצומדות נוגדן אנטי DIG בדילול 1/1500 (v / v) ב ISH חסימת חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם MABT במשך 10 דקות שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו פעמיים עם 0.1 M Tris-HCl pH 8.2 במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">מייד לפני השימוש, להכין פתרון אדום מהיר על ידי המס את הטבליות 0.1 M טריס pH 8.2. סנן את הפתרון דרך פילטר 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת השקופיות ב 37 ° C עם פתרון אדום מהיר בתא humidified. ככל שהזמן לפיתוח אופטימלי משתנה, לבדוק את השקופיות באופן קבוע באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לפקח על היווצרות של המשקע. בדוגמה זו, לעצור את התגובה לאחר 2 - 3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם PBST במשך 10 דקות שלוש פעמים. </li></ol> 7. אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ חסימת IHC: 10% (V / V) בסרום (מזן אחר לארח נוגדן ראשוני) ב PBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שקופיות עם IHC חסימת חיץ במשך שעה 1 ב RT בתא humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין נוגדן ראשוני: לדלל את הנוגדן הראשוני על דילול מתאים ב PBST עם 5% בסרום (מזן אחר לארח נוגדן ראשוני). בדוגמה זו, השתמש נוגדן אנטי Olig2 הארנב 1/400 (v / v) דילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">מדגירים את הפתרון נוגדן ראשוני על 4 מעלות CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם PBST במשך 10 דקות שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן נוגדנים משני: לדלל נוגדנים משני fluorophore מצומדות ב דילול מתאים ב PBST עם 5% (v / v) בסרום (מזן אחר לארח נוגדן ראשוני) ו -0.1% (v / v) Hoechst 33258. לדוגמה זה , להשתמש חמור ארנבת אנטי Alexa647 נוגדנים משני ב 1 / 1,000 (v / v) דילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגירים את הפתרון נוגדנים משני ב RT עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם PBST במשך 10 דקות שלוש פעמים. </li></ol> שמה 8. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקית לייבש את השקופיות ב RT, ולעגן עם הרכבה בינוני קרינה. השאירו את השקופיות להתייבש ואז התמונה מיקרוסקופ confocal תחת 10X, 20X ו 63X מטרות באמצעות 4 ערוצים שונים עם אורכי גל עירור הבאים: 570 ננומטר עבור Fast האדום, 488 ננומטר עבור FITC, 647 ננומטר עבור immunolabelling Olig2 ו -350 ננומטר עבור Hoechst . </li></ol>

<ol><li>Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+as+intrinsic+components+of+non-cell-autonomous+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease.</a> Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).</li>
<li>Baslow, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylaspartate+in+the+vertebrate+brain%3A+metabolism+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function.</a> Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).</li>
<li>Hoshino, H., Kubota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canavan+disease%3A+clinical+features+and+recent+advances+in+research%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Int%22%5BJournal%5D)">Canavan disease: clinical features and recent advances in research.</a> Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).</li>
<li>Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+the+human+aspartoacylase+cDNA+and+a+common+missense+mutation+in+Canavan+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease.</a> Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).</li>
<li>Divry, P., Mathieu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartoacylase+deficiency+and+N-acetylaspartic+aciduria+in+patients+with+Canavan+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease.</a> Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).</li>
<li>Bartalini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+diagnosis+of+Canavan+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Childs+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">Biochemical diagnosis of Canavan disease.</a> Childs Nerv Syst. 8 (8), 468-470 (1992).</li>
<li>Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Acetylaspartate+in+the+CNS%3A+from+neurodiagnostics+to+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology.</a> Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).</li>
<li>D'Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+occurrence+of+N-acetylaspartate+amidohydrolase+%28aminoacylase+II%29+in+the+developing+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat.</a> J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).</li>
<li>Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+regional+distribution+of+aspartoacylase+in+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue.</a> J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).</li>
<li>Sommer, A., Sass, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+aspartoacylase+%28ASPA%29+and+Canavan%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan.</a> Gene. 505 (2), 206-210 (2012).</li>
<li>Klugmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+distribution+of+aspartoacylase+in+the+postnatal+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain.</a> Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).</li>
<li>Madhavarao, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+localization+of+aspartoacylase+in+the+rat+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system.</a> J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).</li>
<li>Hershfield, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartoacylase+is+a+regulated+nuclear-cytoplasmic+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme.</a> Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).</li>
<li>Moffett, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+aspartoacylase+expression+in+the+rat+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system.</a> Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).</li>
<li>Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartoacylase+is+restricted+primarily+to+myelin+synthesizing+cells+in+the+CNS%3A+therapeutic+implications+for+Canavan+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Mol+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease.</a> Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).</li>
<li>Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+increase+of+aspartoacylase+in+oligodendrocytes+parallels+CNS+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination.</a> Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia%2C+neurons%2C+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

פרוטוקול זה מספק הליך צעד-אחר-צעד עבור RNA כפול הכלאה באתרו ואחריו immunostaining. השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לאשר Aspa מתבטא oligodendrocytes בוגרת בכמה אזורים במוח. יש הליך רב שלבים זה בעיות פוטנציאליות רבות שיכולים להשפיע רגישות וכן יש להימנע. ראשית, כל הפתרונות ואת מאגרים לאחסון התגובה שעתוק צריך להיות RNase חינם. שנית, הבחירה של תבניות cDNA חשובה ואנחנו מעדיפים תבניות כ 1KB באורך. יש צורך לנק...

תאי גלייה, אשר הוא התאים הנפוצים ביותר במערכת העצבים המרכזית (CNS), מהווים oligodendrocytes (תאי myelinating של CNS), מבשרי oligodendrocytes (OPS, הידוע גם בשם &quot;תאי NG2&quot;), האסטרוציטים ו microglia. יש עניין הולך וגובר את הפונקציות של תאי גלייה ותפקידים הפוטנציאל שלהם במחלות נוירולוגיות 1. לדוגמה, מחלת קנבן (CD) היא הפרעה תורשתית ניוונית של מערכת העצבים מתחיל מוקדם בינקות עם leukodystrophy ע&quot;ש וכן אובדן מתמשך של נוירונים, המובילה למוות בדרך כלל לפני גיל 10 2,3. מוטציות בגן Aspartoacyclase (ASPA) שמובילות באופן דרסטי פעילות ASPA 4 ב CD זוהה. ASPA הוא אנזים catalysing deacetylation של N-acetylaspartate (NAA), מולקולה מאוד מרוכז במוח, אצטט שהניבו ו aspartate 5-7. חולי CD רבים מראים רמות גבוהות יותר של NAA בשל חוסר ASPA activity. כמה מחקרים משער כי יצטט נגזרות NAA יכול להיות מקור עיקרי של חומצות שומן / שומנים במוח במהלך פיתוח CD לנבוע ירד סינתזה המיאלין במהלך ההתפתחות שנגרמה על ידי הכישלון של NAA להיות מפורק 3,5,6. ASPA נמצא בעיקר בכליות, בכבד בחומר הלבן של המוח, ולנוכח התפקיד החשוב של ASPA ב CD, הביטוי התאי של אנזים זה במוח נחקרה על ידי מספר מעבדות. על ידי הסתכלות על הפעילות האנזימטית ASPA במוח, מחקרים קודמים מצאו כי העלייה בפעילות ASPA במהלך התפתחות המוח מקביל את מהלך הזמן של מעטפת המיאלין 8-10. ברמה התאית, מבחני עבור הפעילות האנזימטית וכן הכלאה באתרו (שאני עורך) אימונוהיסטוכימיה (IHC) ניתוחי מראים כי ASPA מתבטאת בעיקר oligodendrocytes במוח אבל לא בנוירונים או האסטרוציטים 11-16. מספר מחקרים מצאו כי ASPA אולי גםלהתבטא microglia במערכת העצבים המרכזית 12,14. אז נתונים כה על הביטוי ASPA ב OPS מוגבלים. על פי מחקר שנערך לא מכבר ובו transcriptomes של תאים מסוגים שונים בקליפת המוח העכבר כולל נוירונים, האסטרוציטים, OPS, oligodendrocytes שהוקמה זה עתה, oligodendrocytes myelinating, microglia, תאי אנדותל, ואת pericytes נותחו על ידי רצף RNA 17, ASPA מתבטא באופן בלעדי oligodendrocytes , בפרט ב myelinating oligodendrocytes (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). למרות המחקרים הללו על דפוס הביטוי ASPA במוח, מספר הוודאות להישאר. ניתן להשתמש בטכניקות שונות כדי ללמוד דפוסי ביטוי גנים. IHC היא שיטה נפוצה לאיתור המוצר הפונקציונלי (כלומר, חלבון) של ביטוי גנים בסעיפי רקמות. למרות השירות שלה גדול, טכניקה זו יש מגבלות כיישום והספציפי שלה כפופה to הזמינה הספציפי של הנוגדן הצורך. לשם השוואה, שאני עורך יש את היתרון של להיות מסוגל לחשוף את הביטוי של כל גן ברמת mRNA. עם זאת, זה יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית להשתמש כמה בדיקות בו זמנית על מנת למקם ביטוי גני סוגי תאים ספציפיים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול המשלב RNA קרינה הכפולה הכלאה באתרו עם הקרינה immunolabelling של חלבון. השתמשנו זו קבוצה של טכניקות כדי לבחון את דפוס הביטוי של Aspa במוח העכבר. שיטה זו מאפשרת המחקר המדויק של ביטוי גנים באמצעות מיקרוסקופ confocal.

<table><tbody><tr><td>QIAprep Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>פורממיד דה-יונים</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td>לחסימת ISH מאגר</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>VWR International</td><td>20252.290</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט חד בסיסי</td> <td>נטול מיםSigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט די-בסיסי דיהידראט</td><td>סיגמא</td><td>30435</td><td></td></tr><tr><td>שמרים tRNA</td><td>Roche</td><td>10109495001</td><td></td></tr><tr><td>50x הפתרון של דנהרדט</td><td>Life Technologies</td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>דקסטרן סולפט</td><td>סיגמא</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Aspa cDNA שיבוט</td><td>מקור Bioscience</td><td>IRAVp968C0654D</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>סיגמא</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>פנול מאוזן</td><td>סיגמא</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>אלכוהול איזואמיל</td><td>אולדריץ'</td><td>496200</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>VWR International</td><td>20821.321</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA פולימראז</td><td>Promega</td><td>P4074</td><td></td></tr><tr><td>מאגר שעתוק</td><td>Promega</td><td>P118B</td><td></td></tr><tr><td>100 mM DTT</td><td>Promega</td><td>P117B</td><td></td></tr><tr><td>UTP-DIG NTP mix</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin</td><td>Promega</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון</td><td>פישר מדעי</td><td>005479470</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא</td><td>59378</td><td></td></tr><tr><td>דיאתיל פירוקרבונט</td><td>סיגמא</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>פנטוברביטון</td><td>Animalcare בע"מ</td><td>BN43054</td><td></td></tr><tr><td>מספריים לניתוח</td><td>מכשירים מדויקים בעולם</td><td>15922</td><td></td></tr><tr><td>25 מד מחט</td><td>Terumo</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית</td><td>Cole-Parmer Instrument Co. Ltd</td><td>WZ-07522-30</td><td></td></tr><tr><td>מספריים איריס</td><td>Weiss</td><td>103227</td><td></td></tr><tr><td>מס' 2 פינצטה</td><td>World Precision Instruments</td><td>500230</td><td></td></tr><tr><td>Coronal Brain Matrix</td><td>World Precision Instruments</td><td>RBMS-200C</td><td></td></tr><tr><td>סכין גילוח</td><td>Personna Medical</td><td>PERS60-0138</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>רקמות</td> בינוניות<td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat/microtome</td><td>Bright</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost פלוס שקופיות</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט</td><td>Sigma</td><td>S4641</td><td>עבור 65 מעלות; מאגר כביסה C</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7503</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>VWR International</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Smith Scientific Ltd</td><td>2959</td><td></td></tr><tr><td>מגיב</td><td>חוסם Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>סרום כבשים מושבת בחום</td><td>סיגמא</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>עט הידרופובי</td><td>Cosmo Bio</td><td>DAI-PAP-S</td><td>1:500</td></tr><tr><td>&alpha;-FITC POD נוגדן מצומד</td><td>Roche</td><td>11426346910</td><td></td></tr><tr><td>TSA&trade; בנוסף מערכת פלואורסצאין</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL741001KT</td><td>1:1,500</td></tr><tr><td>&alpha;-DIG מצומד</td><td>AP Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>טבליות אדומות מהירות</td><td>Roche</td><td>11496549001.22</td><td></td></tr> <tr><td>&micro; M filter</td><td>Millex</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Olig2 נמלה ארנב</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; 647-מצומד &אלפא ארנב נוגדן</td><td>Life technologies</td><td>A-31573</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>bisBenzimide H 33258</td><td>sigma</td><td>B2883</td><td></td></tr><tr><td>הרכבה בינונית</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP2 קונפוקלי מיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

שילוב קרינה זוגית<em&gt; באתרו</em&gt; כלאה עם immunolabelling עבור איתור של הביטוי של שלושה גנים בסעיפי מוח עכבר

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

איתור של ביטוי גני סוגים שונים של תאים במוח למשל, נוירונים, האסטרוציטים, oligodendrocytes, מבשרי oligodendrocyte ו microglia, ניתן הקשה על ידי חוסר נוגדנים ספציפיים ראשוניים או משניים עבור immunostaining. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזהות את הביטוי של שלושה גנים שונים באותו סעיף המוח באמצעות קרינה כפולה הכלאה באתרו עם שתי חלליות גן ספציפי ואחריו immunostaining עם נוגדן של סגוליות גבוהות המכוונות נגד החלבון מקודד על ידי גן שלישי. Aspartoacyclase (ASPA) הגן, מוטציות של מה שעלולות להוביל מחל חומר לבנה אנושית נדירה - מחלת קנבן - נחשב להתבטא oligodendrocytes ו microglia אבל לא האסטרוציטים ונוירונים. עם זאת, את דפוס הביטוי המדויק של ASPA במוח טרם הוקם. פרוטוקול זה אפשר לנו לקבוע כי ASPA מתבטא קבוצת משנה של oligodendrocytes הבוגרתnd זה יכול להיות מיושם בדרך כלל מגוון רחב של מחקרי דפוס ביטוי גנים.

מאמר זה מתאר שיטה עבור ISH קרינה כפולה ואחריו immunolabelling בסעיפים במוח עכבר. להלן תיאור קצר של פרוטוקול זה מוצג באיור 1. הצעד הראשון היה לסנתז בדיקות ספציפיות כדי Aspa ו MBP (חלבון המיאלין הבסיסי). כדי לבדוק כי הבדיקות היו מסונתזות, aliquot קטן של כל תגובה נדרס על ג&#39;ל agarose. התבנית ליניארי הקלושה וכמות גדולה של חללית RNA ניתן לראות (איור 2). שאני עורך הקרינה זוגי Aspa ו...

לוקליזציה של ביטוי גנים לסוגי תאים ספציפיים יכולה להיות מאתגרת בשל היעדר נוגדנים ספציפיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי משולש בו זמנית של ביטוי גנים על ידי שילוב של RNA פלואורסצנטי כפול הכלאה באתרו עם צביעה חיסונית.

שילוב קרינה זוגית<em&gt; באתרו</em&gt; כלאה עם Immunolabelling עבור איתור של הביטוי של שלושה גנים בסעיפי מוח עכבר

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לזהות בו-זמנית את הביטוי של שלושה גנים שונים בחתכי מוח, באמצעות היברידיזציה במקום (in situ hybridization) פלורסצנטית כפולה ולאחריה צביעה אימונוהיסטוכימית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון: איזה סוג תא מבטא את הגן הנחקר שלי? היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שאין צורך בנוגדן איכותי עבור הגן הנחקר כדי להיות מסוגל למקם את ביטויו בסוג תא ספציפי.לסיכום נוהל זה, ביום הראשון, נחתכים סגמנטים של רקמה מקובעת ואלו עוברים היברידיזציה עם שני גששים של RNA המסומנים באופן שונה למשך הלילה. ביום השני, הסגמנטים מדגרים למשך הלילה עם נוגדן המכוון לגשש המסומן ב-FITC. נוגדן זה מצומד ל-horseradish peroxidase, המזרז את הוספת Tyramide פלואורסצנטי ביום השלישי.לאחר מכן, משתמשים בנוגדן המצומד לאלקלין פוספטאז כדי לסמן את הגשש המסומן ב-DIG. ביום הרביעי, אנזים זה מקטליז את היווצרות המשק הפלואורסצנטי כאשר הוא מדגיר עם תמיסת Fast Red. לאחר מכן, מדגירים את החתכים למשך לילה עם נוגדן ראשוני המכוון לחלבון העניין.לבסוף, ביום החמישי, החלבון מוצג באמצעות נוגדן שני המצומד לפלואורופור. כדי להתחיל בהליך זה, יש לבחור שיבוב DNA המכיל את רצף ה-cDNA של הגן המבוקש בתוך פלסמיד בעל מקדמי RNA polymerase. לאחר מכן, יש לגדל את שיבוב ה-DNA, להפיק את הפלסמיד באמצעות ערכה לניקוי פלסמידים בקנה מידה קטן, ולבצע לו ריצוף באמצעות פריימרים אוניברסליים T7 ו-SP6.בצעו עיכול של 10 עד 20 מיקרוגרם של DNA פלסמידי באמצעות אנזים הגבלה שחותך בקצה ה-5' של הגדיל המקודד (sense strand) של ה-cDNA. דגרו את התערובת למשך 1.5 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הריצו אליקוט קטן על ג'ל אגרוז כדי לוודא שהפלסמיד לינארי באופן מלא.כדי לטהר את הפלסמיד הליניארי, הוסף 1/10 מהנפח של נתרן אצטט בריכוז 3M, נפח אחד של פנול מאוזן ב-10mM Tris-HCl, ונפח אחד של כלורופורם איזואמיל אלכוהול. סבב בצנטריפוגה ב-16,000 Gs למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, והוצא את הפאזה המימית העליונה. לאחר מכן, הוסף נפח אחד של כלורופורם IAA.סבבו במערך צנטריפוגה ב-16,000 Gs למשך דקה אחת, והוציאו את הפאזה המימית העליונה. חזרו על שלב זה פעם נוספת. לאחר מכן, הוסיפו שני נפחים של אתנול, ושמרו את הדגימה בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס למשך שעה אחת, או למשך הלילה.לאחר מכן, סבבו בצנטריפוגה ב-16,000 Gs בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. השליכו את הנוזל העליון (supernatant), ושטפו את המשקע ב-70% ethanol קר. לאחר מכן, השביו אותו לתמיסה ב-TE בריכוז של מיקרוגרם אחד של cDNA ל-2.5 µL.כדי לסנתז את שתי הגששים, בחרו תחילה את ה-RNA polymerase המתאים. לאחר מכן, הכינו את תגובת השעתוק in vitro, והביאו את הנפח הסופי ל-20 µL באמצעות מים שעובדו ב-DEPC. דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 1.5 שעות.לאחר מכן, הרץ מיקרוליטר אחד של תגובת השעתוק על ג'ל agarose בריכוז 1% כדי לבדוק אם התגובה הצליחה. הג'ל אמור להראות את התבנית הליניארית ופס בהיר של הגשושית. בהליך זה, חתוך חתכים בעובי 15 מיקרומטר של רקמה קפואה בתוך קריוסטט.אספו את החתכים על גבי זכוכיות מיקרוסקופ, והשאירו את הזכוכיות לייבש במשך שעה אחת כדי להבטיח שהרקמות ייצמדו לזכוכיות. הגורם החשוב ביותר להצלחת הליך זה הוא איכות החתכים. הדבר תלוי בחלקו ברקמה שעברה פרפוזיה וקיבוע תקינים, ובחלקו בטכניקת החיתוך כדי להשיג חתכים שטוחים הנקיים מזיהום של RNase.לאחר מכן, דללו את שני הגשושים (probes) בבופר היברידיזציה שחומם מראש ל-65 °C, וערבבו היטב. טפטפו 300 µL מתערובת ההיברידיזציה על כל זכוכית, וכסו בכיסוי זכוכית (cover slip) שנאפה בתנור. לאחר מכן, הדגירו את הזכוכיות למשך הלילה בטמפרטורה של 65 °C בתא לח. ביום למחרת, העבירו את השקופיות לצנצנת קופלין (Coplin jar) המכילה באפר שטיפה שחומם מראש, ושטפו את השקופיות במשך 30 דקות, פעמיים, בטמפרטורה של 65 °C. לאחר מכן, שטפו את השקופיות במשך 10 דקות, שלוש פעמים, עם תמיסת שטיפה MABT בטמפרטורת החדר. בשלב זה, השתמשו בטוש הידרופובי כדי לצייר עיגולים מסביב לחתכי הרקמה.לאחר מכן, דגרו את השקופיות למשך שעה אחת בטמפר חסימה ל-ISH בטמפרטורת החדר, בתוך תא לח. לאחר מכן, דגרו את השקופיות למשך לילה ב-4 degrees Celcius עם נוגדן anti-fitc המשורשר ל-horseradish peroxidized. לבסוף, העבירו את השקופיות לצנצנת Coplin המכילה PBST.שטוף אותם ב-PBST שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם, והחלף ל-PBST טרי בכל פעם. לאחר מכן, הוסף tiromide פלואורסצנטי לסליידים והשאר אותם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הנח את הסליידים בצנצנת קופלין (coplin jar) ושטוף ב-PBST במשך 10 דקות, שלוש פעמים.לאחר מכן, דגרו את השקופיות עם תמיסת חסימה ל-ISH למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דגרו את השקופיות למשך לילה בטמפרטורה של 4°C עם נוגדן anti-dig המשורשר לאלקליין פוספטאז. לאחר מכן, שטפו אותן עם MABT שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם.בשלב הבא, שטפו את העששיות פעמיים ב-0.1 molar tris HCL ב-pH 8.2 למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. סננו את תמיסת ה-fast red, והדגירו את העששיות ב-37 degrees Celcius עם תמיסת fast red בתא לח. כיוון שהזמן לפיתוח אופטימלי משתנה, בדקו את העששיות באופן קבוע באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לעקוב אחר היווצרות המשקע.לאחר מכן, שטפו אותן שלוש פעמים עם PBST למשך 10 דקות בכל פעם. לביצוע אימונוהיסטוכימיה, הדגירו את השקופיות עם תמיסת חסימה (blocking buffer) ל-IHC למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בתא לח. לאחר מכן, הדגירו את השקופיות בתמיסת הנוגדן הראשוני בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך לילה.ביום למחרת, שטפו את הנסקיות עם PBST במשך 10 דקות, שלוש פעמים. הדגירו אותן בתמיסת הנוגדן המשני בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לאחר מכן, שטפו אותן עם PBST שלוש פעמים, למשך 10 דקות בכל פעם.לאחר מכן, ייבשו חלקית את הנספיחים בטמפרטורת החדר והצמידו אותם באמצעות מדיום הצמדה לפלואורסצנציה. השאירו את הנספיחים להתייבש לפני הדמייתם במיקרוסקופ קונפוקלי. מוצגות כאן תמונות מייצגות מ-ISH עבור Aspa ו-Mbp, ולאחריהן צביעה אימונו-היסטוכימית עבור OLIG2 בשילוב עם צביעת hook.Aspa התבטא בחלק מהתאים החיוביים ל-MBP ול-OLIG2 בקורטקס ובגוף הקורפוס קלוסום. חלק מהתאים החיוביים ל-Mbp ול-OLIG2 אינם מבטאים Aspa. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמור על הפרוסות ועל כל התמיסות נקיים מזיהום של RNase.לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של האופן שבו ניתן לחקור דפוסי ביטוי גנים באמצעות עיכוב N-citrine ואימונוהיסטוכימיה. ניתן להתאים טכניקה זו למגוון רקמות ממקורות שונים ומשלבים התפתחותיים שונים.

combining-double-fluorescence-situ-hybridization-with-immunolabelling

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פעמיים פלואורסצנטי באתרו הכלאה בסעיפים המוח טריים

שילוב של טכניקות שונות על מנת למקסם את איסוף הנתונים מרקמות העכבר מוצג.

שילוב של צבע lipophilic, באתרו</emהכלאה>, אימונוהיסטוכימיה ו היסטולוגיה

מקור: Jolly, S., et.al. שילוב של פלואורסצנציה כפולה  בהכלאה באתר עם תיוג חיסוני לזיהוי ביטוי של שלושה גנים במקטעי מוח של עכברים. J. Vis. Exp. (2016). סרטון זה מדגים את השימוש בפלואורסצנציה כפולה בהכלאה באתרה כדי לדמיין את הביטוי של שתי מטרות RNA במקטעי מוח של עכברים. הפרוטוקול כולל זיהוי רציף של RNA באמצעות בדיקות המסומנות בפלואורסצאין איזותיוציאנט ודיגוקסיגנין, ואחריו הגברת אות אנזימטית להגברת הרגישות. הקרינה המתקבלת מאפשרת ניתוח לוקליזציה משותפת של רנ"א המטרה בתוך הרקמה.

 ביצוע הכלאה של פלואורסצנציה כפולה באתרה לאיתור ביטוי גנים במקטעי מוח של עכבר

מקור: Baleriola, J., et. al., זיהוי mRNAs מקומיים אקסונליים בחלקי מוח באמצעות הכלאה ברזולוציה גבוהה באתר.  J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים את זיהוי ה-mRNA בתוך אקסונים כולינרגיים בפרוסות היפוקמפוס קבועות של עכבר באמצעות הכלאה פלואורסצנטית באתרה וצביעת נוגדנים. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית חושפת את הלוקליזציה המרחבית של mRNAs מתויגים בבדיקה וכולין אצטילטרנספראז בנוירונים כולינרגיים.

צביעה חיסונית של נוירונים בפרוסות מוח של עכבר בעקבות הכלאה פלואורסצנטית באתרה

פרוטוקול רמת מבוא זה מתאר את הריאגנטים, הציוד והטכניקות הנדרשים להשלמת צביעה אימונוהיסטוכימית של מוחות מכרסמים, תוך שימוש בסמנים למיקרוגליה ואלמנטים עצביים כדוגמה.

פריימר לאימונוהיסטוכימיה על רקמות Cryosectioned מוח חולדה: דוגמא להכתמת Microglia ונוירונים

אנו מתארים הליך רב-יעד chromogenic כל הר הכלאה באתר (MC-תרצה) בעוברים שלמים תסיסנית מאפשרים זיהוי סימולטני וספציפי של שלושה דפוסי הפצת mRNA שונים על ידי מנוגד משקעים צבע.

רב-יעד Chromogenic כל הר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

פרוטוקול זה מתאר את תהליך העבודה צעד אחר צעד עבור אימונוofluoroocoooooooiood של IBA1 ו TMEM119, בנוסף ניתוח של צפיפות microglial, הפצה, מורפולוגיה, כמו גם חדירת תאים מיאלואידית היקפית ברקמת המוח העכבר.

Immunofluorescence צביעת באמצעות IBA1 ו TMEM119 עבור צפיפות Microglial, מורפולוגיה וניתוח הסתננות מיאלואידית תא היקפית במוח העכבר

פרוטוקול זה מתאר שיטה לשילוב הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) ואימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית (IHC) באזורי מוח עכבר טריים קפואים וקבועים, במטרה להשיג FISH רב-תוויות ואות IHC פלואורסצנטי. IHC התמקד בחלבונים ציטופלזמיים וחלבונים המחוברים לממברנה.

שילוב של הכלאה פלואורסצנטית באתרו עם אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית על חלקי מוח טריים של עכברים קפואים או קבועים

היכולת לסמן באופן קבוע תאי גזע וצאצאיהם באמצעות פלואורופור באמצעות קו עכברים מהונדס בלתי ניתן להשראה מאפשרת ניתוח מרחבי וזמני של הפעלה, התפשטות, נדידה ו/או התמיינות in vivo. מעקב אחר שושלת יכול לחשוף מידע חדש על מחויבות לשושלת, תגובה להתערבויות ורב-תחומיות.

מעקב אחר שושלת של תאי גזע בעלי תווית פלואורסצנטית אינדוקטיבית במוח העכבר הבוגר

Expand-Assisted Fluorative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) היא טכניקה חזקה המשלבת מיקרוסקופ הרחבה עם הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) כדי לזהות ביטוי של גנים מרובים ברקמה עבה. פרוטוקול זה מתאר את ההתקדמות האחרונה בשיטה ואת התאמתה לתיוג מערכת העצבים המרכזית של דרוזופילה השלמה.

זיהוי מולטיפלקס של ביטוי גנים במוח הדרוזופילה השלם באמצעות פלואורסצנציה איטרטיבית בסיוע הרחבה בהכלאה באתרה

למד שילוב של היברידיזציה זוגית באתרו עם אימונולייבלינג לאיתור ביטוי שלושה גנים במוח עכבר. שיטה זו מאפשרת מיפוי גני לתאים ספציפיים ללא צורך בנוגדנים לכל המטרות.

שילוב קרינה זוגית

גלה סרטונים נוספים