שילוב קרינה זוגית באתרו כלאה עם Immunolabelling עבור איתור של הביטוי של שלושה גנים בסעיפי מוח עכבר
26 במרץ 2016
לוקליזציה של ביטוי גנים לסוגי תאים ספציפיים יכולה להיות מאתגרת בשל היעדר נוגדנים ספציפיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי משולש בו זמנית של ביטוי גנים על ידי שילוב של RNA פלואורסצנטי כפול הכלאה באתרו עם צביעה חיסונית.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לזהות בו זמנית את הביטוי של שלושה גנים שונים בחלקי המוח, באמצעות פלואורסצנציה כפולה במקום הכלאה ואחריה צביעה חיסונית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון איזה סוג תא מבטא את הגן המעניין שלי? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאינך זקוק לנוגדנים טובים כדי שהגן המעניין שלך יוכל למקם את הביטוי שלו לסוג תא ספציפי.
לסיכום הליך זה, ביום הראשון, קטעי רקמה קבועים נחתכים ומוכלאים עם שני בדיקות RNA עם תוויות שונות בן לילה. ביום השני, החלקים מודגרים למשך הלילה עם נוגדן המכוון לבדיקה המסומנת FITC. נוגדן זה מצומד לחזרת פרוקסידאז, המזרז תוספת של טירמיד פלואורסצנטי ביום השלישי.
לאחר מכן, נעשה שימוש בנוגדנים מצומדים של פוספטאז אלקליין כדי למקד את הגשושית המסומנת ב-DIG. ביום הרביעי, אנזים זה מזרז את היווצרות המשקעים הפלואורסצנטיים כאשר הוא מודגר בתמיסה אדומה מהירה. לאחר מכן החלקים מודגרים למשך הלילה עם נוגדן ראשוני המכוון לחלבון מעניין.
לבסוף, ביום החמישי, חלבון זה מודגם עם נוגדן משני מצומד פלואורופור. כדי להתחיל בהליך זה, בחר שיבוט DNA המכיל את רצף ה-cDNA של הגן המעניין בפלסמיד עם מקדמי RNA פולימראז. לאחר מכן, גדל את שיבוט ה-DNA, חלץ את הפלסמיד עם ערכת טיהור פלסמיד בקנה מידה קטן, ורצף אותו עם פריימרים אוניברסליים T7 ו-SP6.
עכל 10 עד 20 מיקרוגרם של DNA פלסמיד עם אנזים הגבלה החותך את חמשת הקצה הראשוני של גדיל החישה של ה-cDNA. דגרו אותו למשך 1.5 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הפעל אליקוט קטן על ג'ל אגרוז כדי לבדוק שהפלסמיד ליניארי לחלוטין.
כדי לטהר את הפלסמיד הליניארי, הוסף 1/10 מהנפח של שלוש נתרן אצטט מולארי, נפח אחד של 10 מילי-מולארי Tris-HCl פנול מאוזן ונפח אחד של אלכוהול איזואמיל כלורופורם. צנטריפוגה ב -16, 000 גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, ולחלץ את השלב המימי העליון. לאחר מכן הוסף נפח אחד של כלורופורם IAA.
צנטריפוגה ב -16, 000 גרם למשך דקה אחת, וחלץ את השלב המימי העליון. חזור על שלב זה שוב. לאחר מכן, הוסיפו שני נפחים של אתנול, ושמרו אותו על 20 מעלות צלזיוס שליליות למשך שעה, או למשך הלילה.
לאחר מכן, צנטריפוגה ב -16, 000 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט ושטפו את הגלולה עם אתנול קר 70%. לאחר מכן השעו אותו מחדש ב-TE בריכוז של מיקרוגרם אחד של cDNA לכל 2.5 מיקרוליטר.
כדי לסנתז את שני הבדיקות, בחר תחילה את ה-RNA פולימראז המתאים. לאחר מכן, הכינו את תגובת השעתוק במבחנה, והביאו את הנפח הסופי עד 20 מיקרוליטר עם מים שטופלו ב-DEPC. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי.
לאחר מכן, הפעל מיקרוליטר אחד של תגובת השעתוק על ג'ל אגרוז 1% כדי לבדוק אם התגובה עבדה. הג'ל צריך להראות את התבנית הליניארית ורצועה בהירה של הגשושית. בהליך זה, חותכים חלקים בעובי 15 מיקרומטר של רקמה קפואה בקריוסטט.
אסוף את החלקים על שקופיות המיקרוסקופ, והשאיר את השקופיות לייבוש למשך שעה כדי להבטיח שהרקמות נדבקות לשקופיות. הגורם החשוב ביותר לכך שהליך זה יעבוד היטב הוא איכות החלקים. זה תלוי בחלקו ברקמה מקובעת היטב, ובחלקו בטכניקת החיתוך להשגת חתכים שטוחים נקיים מזיהום RNase.
לאחר מכן, יש לדלל את שני הבדיקות במאגר הכלאה שחומם מראש ל-65 מעלות צלזיוס, ולערבב היטב. מרחו 300 מיקרוליטר של תערובת הכלאה על כל שקופית, וכסו בגלישת כיסוי אפויה בתנור. לאחר מכן, דגרו את המגלשות למשך הלילה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס בתא לח.
למחרת, העבירו את השקופיות לצנצנת קופלין המכילה מאגר כביסה מחומם מראש, ושטפו את המגלשות במשך 30 דקות, פעמיים, בחום של 65 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את השקופיות למשך 10 דקות שלוש פעמים עם תמיסת כביסה MABT בטמפרטורת החדר. בשלב זה, השתמש בעט הידרופובי כדי לצייר עיגולים סביב חלקי הרקמה.
לאחר מכן דגרו את המגלשות למשך שעה בטמפרטורת החדר עם מאגר חוסם ISH בתא לח. לאחר מכן, דגרו את המגלשות למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם נוגדן אנטי-פיטק מצומד מחומצן חזרת. לאחר מכן, הניחו את השקופיות בצנצנת קופלין המכילה PBST.
שטפו אותם ב-PBST שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם, והחליפו ב-PBST טרי בכל פעם. לאחר מכן, הוסיפו טירומיד פלואורסצנטי לשקופיות והשאירו אותן למשך 10 דקות בחדר ממוזג. מניחים את השקופיות בצנצנת קופלין ושוטפים ב-PBST למשך 10 דקות שלוש פעמים.
לאחר מכן, דגרו את המגלשות עם מאגר חוסם ISH למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דגרו את המגלשות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם נוגדן נגד חפירה מצומד פוספטאז אלקליין. לאחר מכן, שטפו אותם עם MABT שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם.
לאחר מכן, שטפו את המגלשות פעמיים עם 0.1 טריס HCL מולארי ב-pH 8.2 למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מסננים את התמיסה האדומה המהירה, ומדגרים את המגלשות ב-37 מעלות צלזיוס עם תמיסה אדומה מהירה בתא לח. ככל שהזמן להתפתחות אופטימלית משתנה, בדוק את השקופיות באופן קבוע במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לעקוב אחר היווצרות המשקעים.
לאחר מכן, שטפו אותם שלוש פעמים עם PBST למשך 10 דקות בכל פעם. כדי לבצע אימונוהיסטוכימיה, דגרו את המגלשות עם מאגר חוסם IHC למשך שעה בטמפרטורת החדר בתא לח. לאחר מכן, דגרו את השקופיות בתמיסת הנוגדנים העיקרית בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.
למחרת, שטפו את השקופיות עם PBST למשך 10 דקות שלוש פעמים. דגרו אותם בתמיסת הנוגדנים המשנית בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן, שטפו אותם עם PBST שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם.
לאחר מכן, יבש חלקית את השקופיות בטמפרטורת החדר והרכיב עם מדיום הרכבה פלואורסצנטי. השאירו את השקופיות לייבוש לפני הדמיית אותן במיקרוסקופ קונפוקלי. מוצגות כאן התמונות המייצגות מ-ISH עבור Aspa ו-Mbp, ואחריהם צביעה חיסונית עבור OLIG2 בשילוב עם צביעת וו.
אספה התבטא בכמה תאים חיוביים ל-MBP חיוביים ל-OLIG2 בקליפת המוח ובקורפוס קלוסום. חלק מהתאים החיוביים ל-OLIG2 חיוביים ל-Mbp אינם מבטאים Aspa. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמור על הפרוסות וכל התמיסות נקיות מזיהום RNase.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחקור דפוסי ביטוי גנים על ידי עיכוב N-ציטרין ואימונוהיסטוכימיה. ניתן להתאים טכניקה זו למגוון רקמות ממקורות ושלבי התפתחות שונים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לזיהוי סימולטני של ביטויים של שלושה גנים שונים בחתכי רקמת מוח. השיטה משלבת היברידיזציה של פלואורסצנציה באתר (FISH) כפולה עם צביעה אימונוהיסטוכימית, ובכך מאפשרת לחוקרים למקם את ביטוי הגנים בסוגי תאי מוח ספציפיים גם כאשר אין נוגדנים מתאימים לכל אחת מהמטרות. הפרוטוקול מודגם באמצעות חקר הביטוי של הגן Aspartoacyclase (ASPA) באוליגודנדרוציטים ובתאי מוח אחרים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה מולקולרית
- היסטולוגיה
רקע
- ניתוח ביטוי גנים ברקמת מוח מוגבל לעיתים קרובות על ידי זמינותם של נוגדנים ספציפיים לצביעה אימונוהיסטוכימית.
- היברידיזציה במקום (In situ hybridization) מאפשרת זיהוי של תמלילי mRNA, ובכך מספקת חלופה לשיטות המבוססות על נוגדנים.
- שילוב של FISH עם צביעה אימונוהיסטוכימית מאפשר ויזואליזציה סימולטנית של תוצרי גנים מרובים באותו נתח רקמה.
- הגן ASPA מעורב במחלת קנבן (Canavan disease) ונחשב למבוטא באוליגודנדרוציטים ובמיקרוגליה, אך תבנית הביטוי המדויקת שלו במוח לא הייתה ברורה בעבר.
מטרת המחקר
- פיתוח והדגמה של פרוטוקול לזיהוי ביטוי של שלושה גנים שונים באותו נתח מוח.
- קביעת דפוס הביטוי הספציפי לסוג התא של הגן ASPA במוח.
- אספקת שיטה בעלת יישום רחב למחקרי ביטוי גנים ברקמות שונות ובשלבים התפתחותיים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת חתכי רקמת מוח מקובעים וחיתוך באמצעות קריוסטט.
- סינתזה של שתי גששים (probes) של RNA ספציפיים לגנים, המסומנים בתגיות שונות (FITC ו-DIG), באמצעות תמלול חוץ-תאי (in vitro transcription).
- היברידיזציה כפולה באתר (Double fluorescence in situ hybridization) באמצעות שני הגששים, כאשר כל אחד מהם מזוהה באמצעות נוגדנים מצומדים לאנזים ותסריפים פלואורסצנטיים (Tyramide ו-Fast Red).
- צביעה אימונוהיסטוכימית עוקבת עם נוגדן ספציפי מאוד נגד חלבון שלישי, המדגים ויזואלית באמצעות נוגדן משני מצומד לפלואורופור.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית לדימוי וניתוח של דפוסי ביטוי גנים.
תוצאים עיקריים
- הפרוטוקול אפשר בהצלחה זיהוי סימולטני של שלושה תוצרי גנים באותו נתח מוח.
- ביטוי של ASPA מוקם בתת-קבוצה של אוליגודנדרוציטים בוגרים, כפי שהודגם על ידי סימון משותף עם סמני MBP ו-OLIG2.
- חלק מהתאים החיוביים ל-MBP ול-OLIG2 לא ביטאו ASPA, דבר המעיד על הטרוגניות בין האוליגודנדרוציטים.
- השיטה הוכחה כניתנת להתאמה לסוגי רקמות ולשלבי התפתחות שונים.
מסקנות
- פרוטוקול זה מאפשר מיפוי מדויק של ביטוי גנים לסוגי תאי מוח ספציפיים ללא צורך בנוגדנים עבור כל המטרות.
- הוא מספק תובנות חדשות לגבי הביטוי של ASPA במוח באופן ספציפי לסוג התא.
- הטכניקה ישימה באופן רחב לחקר דפוסי ביטוי גנים בהקשרים ביולוגיים מגוונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בגילוי תרופות למדעי העצבים, זיהוי מדויק של ביטוי גנים בסוגים ספציפיים של תאי מוח הוא קריטי לתיקוף מטרה (target validation) ולהפחתת סיכונים מכניסטיים. שיטה זו מאפשרת זיהוי סימולטני של שלושה גנים ללא הסתמכות על נוגדנים באיכות גבוהה, ובכך נותנת מענה לצוואר בקבוק מרכזי באישור המטרה. באמצעות אספקת נתוני ביטוי גנים מרובים עם רזולוציה מרחבית, היא תומכת בבדיקת השערות מוקדמת ובתעדוף פורטפוליו בפיתוח טיפולים למערכת העצבים המרכזית (CNS).
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי מיפוי ביטוי גנים לאוליגודנדרוציטים, מיקרוגליה, אסטרוציטים או נוירונים.
- ערך תפעולי: מפחית את התלות בזמינות של נוגדנים, ובכך מאיץ את לוחות הזמנים של תיקוף המטרה.
- ערך חיזוי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה ישירה של דפוסי ביטוי גנים משותף בסוגי תאים הרלוונטיים למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצרת קריאות פלואורסצנטיות סטנדרטיות וניתנות לשחזור עבור שלושה מטרות לכל סבב, מה שמאפשר השוואה כמותית בין תנאים שונים.
- יכולת הרחבה: תואמת לפלטפורמות דימות ברזולוציה גבוהה, ותומכת בניתוח בר-התרחבה של ביטוי גנים במודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: ניתנת להתאמה לאזורי מוח שונים ולשלבי התפתחות שונים, ובכך מקלה על עקביות בין מחקרים בפרופיל הביטוי של המטרות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשרת ממצאים של ביטוי גנים משלב הגילוי למודלים פרה-קליניים על ידי אישור ביטוי ספציפי לסוג תא במוח עכבר.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מבהירה האם מטרה מבוטאת בהקשר התאי המיועד, ובכך מפחיתה את הסיכון לנשירה המבוססת על המכניזם.
- סנכרון עם ביומרקרים: תומכת בזיהוי אותות ספציפיים לסוג תא שעשויים להתרגם לביומרקרים של נוזלים או דימות בשלבים מאוחרים יותר.
אינטגרציית תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, מהשערת המטרה ועד לזיהוי מוביל (lead identification), ומספקת ביטחון מנגנוני לפני סריקת תרכובות.
- ביולוגיה של גילוי: בוחנת היפותזות של ביטוי מטרה באמצעות ויזואליזציה של קו-לוקליזציה של RNA וחלבון באוכלוסיות תאים מוגדרות.
- סריקה: מייצרת פלטים סטנדרטיים ומרובי-סמנים (multiplexed) המאפשרים השוואה מהימנה של ביטוי גנים בין קבוצות ניסוייות.
- אנליטיקה: מספקת קריאות כמותיות המבוססות על פלואורסצנציה ומשקעים התומכות בהשוואה סטטיסטית של רמות ביטוי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים in vitro או in silico לדפוסי ביטוי in vivo ברקמה עצבית הרלוונטית למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת ניתנת לשימוש חוזר לפרופיל ביטוי גנים מרובה-סמנים במספר פרויקטים של מערכת העצבים המרכזית (CNS).
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בביולוגיה של המטרה על ידי צמצום העמימות המכניסטית בביטוי גנים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של זרימת העבודה לזיהוי מרובה (multiplexed), ובכך משפר את השחזוריות בין אתרים וצוותים שונים.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go על ידי אישור ביטוי המטרה בסוגי תאים רלוונטיים, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם סיכונים, בהתבסס על פרופילי ביטוי מתוקפים במערכות הרלוונטיות למחלה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות ב-RNA in situ hybridization, אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- תלוי בסביבה נקייה מ-RNase, בקיבוע איכותי של הרקמה ובדיוק החיתוך.
- נדרשת גישה לתנורי היברידיזציה, למיקרוסקופים פלואורסצנטיים ולריאגנטים לגילוי Tyramide ו-Fast Red.
- יש לבצע אופטימיזציה לריכוז הגשושית (probe) ולטיטרציה של הנוגדנים עבור כל מטרה כדי למזער את הרקע.
- מוגבל על ידי אוטופלואורסצנציה של הרקמה וחפיפה פוטנציאלית של אותים בערוצים מולטיפלקס, דבר המצריך הפרדה ספקטרלית קפדנית.
שאלות נפוצות בביופרמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:42
Overview of Double Fluoresence In Situ Hybridization Followed by Immunostaining
1:44
RNA Probe Synthesis
4:12
Cryosectioning and Hybridization
5:33
Visualization of the FITC Probe and the DIG Probe
7:23
Immunohistochemistry and Mounting
8:16
Results: Expression of Aspa in Oligodendrocytes in the Cortex and the Corpus Callosum
8:45
Conclusion
