הערכה סימולטני של DNA Cardiomyocyte סינתזה ploidy: שיטה Assist כימות Cardiomyocyte רגנרציה מחזור
23 במאי 2016
כימות תחלופת הקרדיומיוציטים הוא מאתגר. הפרוטוקול המתואר כאן תורם תרומה חשובה לאתגר זה בכך שהוא מאפשר כימות מדויק ורגיש של יצירת גרעיני ניאו-קרדיומיוציטים וגרעיני פלואידיה.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לכמת את תחלופת הקרדיומיוציטים באמצעות תיוג נוקלאוזידים לטווח ארוך וזרימה ציטומטרית כדי לכמת את גרעיני הקרדיומיוציטים הניאו-קרדיומיוציטים תוך התחשבות בפוליפלואידיזציה של הגרעינים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בתחום התחדשות הקרדיומיוציטים והיא יכולה לשמש ככלי סינון לכימות שינויים בדינמיקה של יצירת קרדיומיוציטים. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא מאפשר כימות רגיש ומדויק של יצירת ניאו קרדיומיוציטים, ללא קשר למקור הסלולרי ובקרה על פוליפלואידים.
24 שעות לאחר זריקת ה-EdU השישית, הניחו את בעל החיים המטופל במצב שכיבה והשתמשו במספריים כירורגיים כדי לבצע חתך בעור מאמצע הבטן לסרעפת. לאחר מכן, הרחיק את עצם החזה מחלל הגוף, חתוך את הסרעפת באופן דו-צדדי כדי לחשוף את הלב. לאחר מכן הרם מעט את הלב וחתוך את כלי הדם העיקריים של דרכי היציאה כדי לנתח את הלב מחלל בית החזה.
מיד עם הקציר, הכניסו את הלבבות לצינורות צנטריפוגות בודדים של 15 מ"ל המכילים 10 מ"ל PBS מקוררים לארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן העבירו את הדגימות לצלחות פטרי בודדות בגודל 10 ס"מ והשתמשו באזמל כדי לחתוך כל לב לשני חלקים בכיוון סגיטלי. לאחר מכן, סחטו בעדינות את חלקי הלב בעזרת זוג מלקחיים.
מוציאים את שתי חתיכות הלב ומניחים אותן בצלחת פטרי המכילה 20 מ"ל PBS טרי. חזור שוב עם צלחת פטרי חדשה ו -20 מ"ל PBS טרי. הנח את שני חלקי הלבבות באותו צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל והשתמש במחט בגודל 25 כדי ליצור חור קטן במכסה של כל צינור כדי למנוע את פתיחת המכסה כאשר הלב מעובד.
לאחר מכן סמן כל צינור והקפיא את רקמות הלב במיכל של חנקן נוזלי. עבור כל לב שיש לנתח, דגרו 36 מ"ל של אחוז אחד BSA ו-PBS בצינור אולטרה צנטריפוגה. השלך את התמיסה לאחר 30 דקות.
כאשר הצינורות התייבשו באוויר, הוסף 10 מ"ל של תמיסת שיפוע סוכרוז לכל צינור. לאחר טחינה בנפרד של דגימות הלב הקפואות בחנקן נוזלי עם האזמל, העבירו את שברי הרקמה מכל לב לצינורות חרוטיים בודדים של 50 מ"ל המכילים 15 מ"ל של מאגר ליזה של תאים. הומוגניזציה של הדגימות למשך 15 שניות ב-25,000 סל"ד עם הומוגנייזר בדיקה בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן הוסף עוד 15 מ"ל של מאגר ליזה לכל צינור והעביר את הדגימות אחת בכל פעם ל-40 מ"ל עם עלי מרווח גדול. בצע 10 משיכות עם העלי וסנן את תמיסות התאים דרך מסננת של 100 מיקרון ואחריה מסננת תאים של 40 מיקרון לצינורות צנטריפוגה בודדים של 50 מ"ל. לאחר מכן אסוף את כדורי הלב הגרעיניים על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את התאים ב-25 מ"ל של תמיסת שיפוע סוכרוז כל אחד.
שכב את התאים על גבי שיפוע הסוכרוז החופשי מהגרעינים בצינורות האולטרה צנטריפוגה המוכנים וצנטריפוגה את השכבות באמצעות רוטור צינור מתנדנד החוצה. לאחר הצנטריפוגה, השעו מחדש את כדורי הגרעינים ב-1,300 מיקרוליטר של מאגר אחסון גרעינים והעבירו את הגרעינים לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל המסומן PCM1. העבירו 300 מיקרוליטר מכל תרחיף מצינורות ה-PCM1 לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה חדש והוסיפו 700 מיקרוליטר של מאגר אחסון גרעינים טריים ובקרת ISO של תווית.
לאחר מכן סמן את גרעיני ה-PCM1 עם נוגדן נגד PCM1 ואת גרעיני בקרת ISO עם נוגדן בקרת איזוטיפ IGG מהיר בן לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת סובבו את הדגימות והשעו מחדש את הכדורים במ"ל אחד של מאגר אחסון גרעינים טריים לצנטריפוגה שנייה באותם תנאים. לאחר הסיבוב השני, השעו מחדש את הכדורים במ"ל אחד של מאגר אחסון גרעינים טריים ודגרו על הגרעינים עם מיקרוליטר אחד של מקטע מצומד F(ab'2) מנוגדני IGG נגד כלבת עז למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס בחושך.
כדי להעריך את מידת שילוב ה-EdU, צנטריפוגה, בקרת PCM1 ו-ISO סימנה מתלי גרעינים והשעיה מחדש של הכדורים במ"ל אחד של 1%BSA PBS פעמיים לשתי שטיפות רצופות. לאחר הכביסה השנייה, החלף את הסופרנטנט ב -100 מיקרוליטר של מקבע EdU ודגר את הדגימות למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. בתום הקיבוע יש לשטוף את הגרעינים פעמיים נוספות במ"ל אחד של PBS BSA ואז לדגור את הדגימות עם 100 מיקרוליטר של תמיסת חדירה מבוססת ספונין בטמפרטורת החדר.
לאחר 15 דקות, הוסף 500 מיקרוליטר של קוקטייל תיוג EdU טרי שהוכן לכל צינור לדגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר. בתום הדגירה, סובב את הדגימות שלוש פעמים ושטיפת הגרעינים במ"ל אחד של PBS BSA במהלך שתי הצנטריפוגות השנייה. לבסוף, סמן את הדגימות ב-400 מיקרוליטר של תמיסת צביעת DNA.
ניתוח אימונוהיסטולוגי של הלבבות הפועמים מדגים את נוכחותם של PCM1 המבטא קרדיומיוציטים ששילבו EdU. עם זאת, הנתונים המתקבלים בשיטות אימונוהיסטולוגיות יכולים להתפרש באופן שגוי מכיוון שסוגי תאים אחרים ששילבו EdU יכולים להיות מזוהים בטעות כקרדיומיוציטים. במחקר של mdx ועכברי בקרה, ניתוח ציטומטריית הזרימה המפורט בפרוטוקול זה מאפשר כימות מהיר של יצירת גרעין ניאו קרדיומיוציטים תוך אי הכללת התאים ששילבו EdU לדה-פוליפלואידיזציה.
בדומה לנתונים שפורסמו בעבר, בניסוי מייצג זה נצפתה עלייה בשיעורי יצירת גרעיני ניאו קרדיומיוציטים בלבבות עכברי mdx בהשוואה לבקרות תואמות גיל. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך ארבע שעות במשך יומיים. בעת ביצוע הליך זה חשוב לזכור הן את הפקדים השליליים של EdU והן את PCM1 כדי שניתן יהיה להגדיר את השערים במדויק במהלך הניתוח.
טכניקה זו תואמת גם למספר טכניקות אימונוהיסטולוגיות נוספות במורד הזרם המאפשרות לכמת שילוב נוקלאוציטים במספר סוגים שונים של תאי לב. טכניקה זו שימשה בתחום המחקר הקרדיווסקולרי כדי לחקור שינויים בהתחדשות קרדיומיוציטים במודל mdx של קרדיומיופתיה לא איסכמית. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לכמת במהירות גרעיני קרדיומיוציטים ניאו, צפה בספירה לפוליפלואידים כדי לסנן שינויים בהתחדשות ובתחלופה של קרדיומיוציטים.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מאפשר כימות של תחלופת תאי שריר הלב (cardiomyocytes) באמצעות סימון נוקלאוזידים לטווח ארוך וציטומטריית זרימה. הוא מאפשר מדידה רגישה ומדויקת של יצירת גרעיני תאי שריר לב חדשים, תוך בקרה על פוליפלואידיזציה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מחקר קרדיווסקולרי
- ביולוגיה של התא
- רפואה רגנרטיבית
רקע
- קשה לכמת את תחלופת התאיים השריריים של הלב (Cardiomyocytes).
- הבנת הרגנרציה של התאיים השריריים של הלב היא קריטית לטיפול במחלות לב.
- פוליפלואידיזציה מקשה על הערכת היווצרות התאיים השריריים של הלב.
- בשיטות הקיימות חסרות רגישות ודיוק.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לכימות גרעינים של קרדיומיוציטים חדשים.
- הערכת שינויים בדינמיקה של יצירת קרדיומיוציטים.
- אספקת כלי סריקה למחקרי רגנרציה של קרדיומיוציטים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- סימון ארוך-טווח של נוקלאוזידים באמצעות EdU.
- ציטומטריה זרימתית (Flow cytometry) לכימות גרעינים.
- ניתוח אימונוהיסטולוגי לזיהוי קרדיומיוציטים.
- בקרת פוליפלואידיזציה במהלך הניתוח.
תוצאות עיקריות
- הדגמה של כימות מדויק של גרעיני נאו-קרדיומיוציטים.
- זיהוי שיעורים מוגברים של יצירת נאו-קרדיומיוציטים בלבבות של עכברי mdx.
- תיקוף של השיטה מול ביקורות תואמות גיל.
- תואם לטכניקות אימונוהיסטולוגיות שונות המשך.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה לחקר תחלופה של קרדיומיוציטים.
- הוא משפר את ההבנה של מנגנוני התחדשות של קרדיומיוציטים.
- יישומים עתידיים עשויים לשפר אסטרטגיות טיפוליות למחלות לב.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לבכירים
כימות מדויק של תחלופה של קרדיומיוציטים חיוני להערכה של טיפולים רגנרטיביים בפיתוח תרופות למערכת לב-דם. שיטה זו מאפשרת זיהוי רגיש של גרעיני קרדיומיוציטים חדשים תוך בקרה על פוליפלואידיזציה המבלבלת את התוצאות, ובכך משפרת את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות פרה-קליני. היא תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי הבחנה בין רגנרציה תאית אמיתית לבין ארטיפקטים של רפליקציית DNA במודלים של מחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות כימות של רגנרציה אמיתית של קרדיומיוציטים, ללא השפעה של ארטיפקטים של פוליפלואידיזציה.
- ערך תפעולי: מספק קריאה רגישה ומדויקת לתיקוף פונקציונלי של מטרות במודלים של מחלות קרדיווסקולריות.
- ערך ניבוי: תומך בסינון תיקי פיתוח על ידי הפחתת אותות חיוביים שגויים הנובעים מסנתזה של DNA ללא חלוקת תאים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר נתונים כמותיים וסטנדרטיים של גרעינים המתאימים לסריקת בדיקות של תרכובות המשפיעות על תחלופת תאי שריר לב (cardiomyocytes).
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות סימון נוקלאוזידים מבוקר וגילוי מבוסס ציטומטריה של זרימה.
- יכולת הרחבה: תואם לטכניקות אימונוהיסטולוגיות המשך לצורך בניתוח מולטיפלקסי של סוגי תאי לב.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רצף תרגומי: מגשר בין ממצאי גילוי לתיקוף פרה-קליני על ידי אספקת מערכת רלוונטית למחלה למדידת דינמיקת התחדשות של קרדיומיוציטים.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מבדיל בין היווצרות קרדיומיוציטים חדשים לבין פוליפלואידיזציה, ובכך מפחית עמימות מכניסטית במחקרי מעורבות מטרה.
- ביטחון חיזוי: מאפשר קבלת החלטות על קידום מבוסס התאמת סיכונים, באמצעות כימות תגובות התחדשות אמיתיות במודלים כגון קרדיומיופתיה של mdx.
שילוב זרימה ותהליכי עבודה
השיטה משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, ותומכת באישור מטרות מוקדם ועד לשלבי זיהוי מובילים (lead identification), על ידי אספקת תוצאות כמותיות וספציפיות למנגנון לגבי תחלופה של קרדיומיוציטים.
- ביולוגיית גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי בידוד אירועי סינתזה של DNA ספציפיים לקריומיוציטים מרעשי רקע.
- סריקה: מספקת פלטים כמותיים הניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה, לצורך הערכת השפעת תרכובות על יצירת קריומיוציטים.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות של שילוב נוקליאוסידים ברזולוציית פלואידיות, המאפשרות השוואה אובייקטיבית בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מתחברת לזרימות עבודה פרה-קליניות על ידי אספקת מערכת רלוונטית למחלה להערכת פוטנציאל רגנרטיבי במודלים של אי-ספיקת לב.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר למחקרים לונגיטודיים של תחלופת קריומיוציטים לאורך התערבויות טיפוליות מרובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת אותות שגויים הנובעים מפוליפלואידיזציה.
- ערך תפעולי: מספק כימות סטנדרטי וניתן לשחזור של יצירת גרעיני נאו-קרדיומיוציטים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) באמצעות אספקת נתונים ספציפיים מבחינה מכניסטית על התחדשות קרדיומיוציטים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מבוסס סיכונים של תוכניות התחדשות קרדיווסקולרית באמצעות מדידה מדויקת של שיעור התחלופה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בבידוד גרעינים, ציטומטריה זורמת וטכניקות סימון אימונוהיסטוכימיות.
- תלוי בגישה לציוד אולטרה-צנטריפוגה, ציטומטרים זורמים ומערכות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- מחייב סטנדרטיזציה של משך זמן הסימון ב-EdU ותיקוף של נוגדן PCM1 בין מעבדות שונות.
- יש להתחשב במגבלות הגילוי של קרדיומיוציטים דו-גרעיניים, דבר העשוי להשפיע על הכימות המוחלט במודלים מסוימים.
- דורש אופטימיזציה של זמני עיבוד הרקמות כדי לשמר את שלמות הגרעינים ואת האנטיגניות לצורך ניתוחים המשכיים.
