בניית מודלים לחיזוי הורס של תוכן מרכיב האוכמניות ידי ספקטרוסקופיה האינפרה-אדום הקרוב בהתבסס על מדידות HPLC

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבנות ולאמת מודלים לחיזוי לא הרסני של סך הסוכר, סך החומצה האורגנית ותכולת האנטי-ציאנין הכוללת באוכמניות בודדות על ידי ספקטרוסקופיה קרובה לאינפרא אדום. שיטה זו תענה על בעיות מרכזיות בתחום הערכת תוצרת חקלאית, כגון פירות וירקות. בעיניי, היתרון של טכניקה זו הוא שניתן לבדוק הרבה מהמוצרים שלנו בצורה לא הרסנית על ידי ספקטרוסקופיה.

והמודלים שנבנו באמצעות ההליך המוצג כאן. ספקטרוסקופיה קרובה לאינפרא אדום היא כלי רב עוצמה להערכה לא הרסנית של מוצרים חקלאיים. מודלים לחיזוי נבנים על ידי בחינת המתאם בין הספקטרום לתוכן שנקבע על ידי ניתוח כימי של כל מטרה.

המדגימים את ההליך יהיו יוסוקה קימורה, סטודנט בוגר המעבדה שלי וג'ינגאי צ'ה, מהאוניברסיטה ואחד ממחברי הפרוטוקול הזה. אסוף מספר מספיק וסוגים שונים של אוכמניות דגימה מזני היעד. אוספים רצוי 100 אוכמניות לבניית מודל הכיול.

ולפחות 10 לאימות המודל הבנוי. כדי לבנות מודלים חזקים, אספו דגימות מסוגים שונים, כגון בצבעים, גדלים שונים ובתנאי הבשלה שונים. שקלו כל אוכמניות.

המשקולות הנמדדות משמשות מאוחר יותר לחישוב אחוז התוכן של המרכיבים של כל אוכמניות. לאחר מכן הניחו דגימת אוכמניות במרכז החלון של הספקטרופוטומוטר הקרוב לאינפרא אדום למדידות החזר מפוזר. באמצעות פקודת הערוץ היחיד לדוגמה, מדוד את הספקטרום של כל אוכמניות.

רצוי בכמה נקודות בפרי. שמור את האוכמניות במקפיא, מתחת למינוס 30 מעלות צלזיוס אם אין לנתח אותן מיד לאחר מדידות הספקטרום. כדי להתחיל את הטיפול המקדים, חותכים אוכמניות למספר חתיכות כך שניתן יהיה להומוגני בקלות.

חיתוך האוכמניות מבלי להפשיר כשהיא קפואה. הכניסו את החלקים לכוס של 50 מיליליטר. הוסף לכוס כ -10 מיליליטר מים טהורים במיוחד.

מחממים את האוכמניות החתוכות במים טהורים במיוחד במיקרוגל למשך 20 שניות כדי לנטרל את האנזימים שעלולים לפרק סוכרים במהלך הניתוחים. הוסף לכוס כ -10 מיליליטר מים טהורים במיוחד. הומוגניזציה של התערובת למשך חמש דקות ב 12, 000 סל"ד עם הומוגנייזר המצויד בפיר וגנרטור סטנדרטיים.

צנטריפוגה את התערובת ההומוגנית למשך 10 דקות ב -3, 000 סל"ד. לאחר מכן, אסוף את הסינון על ידי סינון ואקום של הדגימה הצנטריפוגה באמצעות מסנן נייר חמישה B. לאחר חזרה על שלבי ההומוגניזציה פעמיים, מדוד את ה-pH של התסנין והתאם אותו לשבע עם חומצה הידרוכלורית מדוללת ודלל תמיסות מימיות של נתרן הידרוקסיד.

מדללים את המסנן ל -50 מיליליטר במים טהורים במיוחד. חלקו את המדגם לשניים. האחד לניתוח סוכרים והשני לניתוח חומצות אורגניות.

העבירו את פתרון הדגימה הראשון דרך העמודות המחוברות בסדרה כדי לא לכלול פיגמנטים, קטיונים ואניונים. זרוק את המיליליטר הראשון של תמיסת הדגימה מהעמודות. לאחר מכן השתמש בתמיסת הדגימה מהעמודות לניתוח סוכרים על ידי כרומוטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים או HPLC.

צנטריפוגה את התמיסה ב-6, 600 סל"ד למשך 10 דקות במיקרו-צינור המצויד במסנן 0.445 מיקרון עם מיני צנטריפוגה לפני הניתוח על ידי HPLC. מסדרים את מערכת ה-HPLC באמצעות עמודת חדירת ג'ל בתנור העמודים בחום של 40 מעלות צלזיוס. השתמש במים טהורים במיוחד נטולי גז עם קצב זרימה של 0.1 מיליליטר לדקה כחומר הניקוי.

השתמש גם בגלאי מקדם שבירה. מדוד את ספקטרוגרמות ה-HPLC של תמיסות סטנדרטיות על ידי הזרקת מינון של 20 מיקרוליטר לכל מדידה. כאן משתמשים בתוכנת פתרון ארוזה למדידה.

קבל את עוצמת השטח של רצועת הסוכר על הכרומטוגרמה של כל תמיסה סטנדרטית על ידי לחיצה על ניתוח מחדש עם הכפתור הימני של העכבר. לאחר מכן חבר את עוצמות השטח כנגד הריכוזים המתאימים כדי לקבל את עקומת העבודה עבור כל סוכר על ידי רגרסיה ליניארית. מהעקומה מתקבלת המשוואה המייצגת את הקשר בין עוצמת השטח לריכוז עבור כל סוכר.

לאחר השגת העקומה הסטנדרטית, מדוד את ספקטרוגרמות ה-HPLC של תמיסות מדגם על ידי הזרקת כמות של 20 מיקרוליטר לכל מדידה. קבל את עוצמות השטח של רצועות הסוכרים על הכרומטוגרמה של כל תמיסת דגימה כמו קודם. עיין בפרוטוקול הטקסט לשלבים לביצוע מדידות HPLC של חומצות אורגניות.

שמור את האוכמניות במקפיא מתחת למינוס 80 מעלות צלזיוס אם אין לנתח אותן לאנתוציאנינים מיד לאחר מדידות הספקטרום. כדי לבצע טיפול מקדים למדידות HPLC של אנתוציאנינים, יבש כל פרי קפוא עם ליופליזר ואקום למשך 12 שעות. חלץ אנתוציאנין מהאוכמניות המיובשות בתמיסת מתנול של אחוז אחד של חומצה טריפלורוקטית על ידי השארת התערובת במקרר בארבע מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.

צנטריפוגה של התמצית למשך 15 דקות במיקרו-שפופרת של שני מיליליטר באמצעות אולטרה-צנטריפוגה במינוס שמונה מעלות צלזיוס ו-15,000 סל"ד. לאחר מכן סנן את התמצית דרך מסנן 0.45 מיקרון כדי לקבל את הדגימה למדידות HPLC. מסדרים את מערכת ה-HPLC באמצעות עמודת פאזה הפוכה C18 בתנור עמודים בחום של 40 מעלות צלזיוס.

החל את שיטת השיפוע באמצעות חומצה טריפלורואצטית מימית של 0.1 אחוז כ-LUNA. ו-0.5 אחוז חומצה טריפלורואצטית באצטוניטריל כ-LUNB. השתמש בקצב זרימה של 0.1 מיליליטר לדקה כאשר היחס של LUNB עולה משמונה אחוזים ל-15% במהלך אפס עד 50 דקות לאחר ההזרקה.

ומ-15% ל-75% במהלך 50 עד 60 דקות לאחר ההזרקה. השתמש בניטור גלאי מערך דיודות צילום ב-520 ננומטר. מדוד את ספקטרוגרמות ה-HPLC של תמיסות סטנדרטיות על ידי הזרקת כמות של 10 מיקרוליטר דרך הדגימה האוטומטית עבור כל מדידה.

השתמש בתוכנת פתרון LC למדידה. לבסוף, מדוד את ספקטרוגרמות ה-HPLC של תמיסות הדגימה על ידי הזרקת אליקוט של 10 מיקרוליטר דרך הדגימה האוטומטית עבור כל מדידה. בשלב זה, בניית מודלים של כיול לחיזוי תכולת המרכיבים, ואחריה אימות המודלים הבנויים הללו, מתבצעת כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

מודלים לחיזוי נבנים באמצעות הספקטרום הנצפה ותכולת המרכיבים שנקבעו באמצעות ההליך המוצג כאן. דוגמה לתוצאה של אימות צולב של המודל שנבנה לחיזוי תכולת הסוכר הכוללת מוצגת כאן. המתאם בין הערכים שנחזו על ידי ספקטרוסקופיה אינפרא אדום קרוב לאלה שנקבעו על ידי HPLC משביע רצון.

תוצאה דומה נצפתה עבור אימות צולב של המודל עבור תכולת האנתוציאנין הכוללת. שוב, המתאם בין הערכים החזויים לערכים הנצפים משביע רצון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשיג ערכים קודמים של תוכן אוכמניות עם HPLC.

הערכה שונה אפשרית רק על ידי שימוש במודלים שנבנו כראוי על סמך התוכן שנקבע מראש שנמדד על ידי ניתוח כימי הרסני. המשמעות היא שניתוח כימי קודם של מטרה הוא תעלומה לבניית מודלים לחיזוי ביצועים גבוהים. אנא עיין בפרוטוקול הטקסט להליך בניית מודלי חיזוי שאינם מוצגים בסרטון זה.

לאחר שנבנו כראוי, המודלים לחיזוי ישימים לחיזוי סוכר, חומצות אורגניות וכל תוכן של אוכמניות. ספקטרוסקופיה קרובה לאינפרא אדום, כפי שמוצג כאן, צפויה להיות ישימה לקורלציה של סוגים רבים של מוצרים חקלאיים. אל תשכח כי יש צורך לקבל מחסומי תוכן מוגדרים מראש באמצעות ניתוח כימי לבניית מודל טוב בעת יישום ספקטרוסקופיה קרובה לאינפרא אדום להערכה של כל מוצר חקלאי.