A Guide to מיקרוסקופית TIRF תאורה מובנית ב- High Speed עם צבעים מרובים
30 במאי 2016
מאמר זה מספק מדריך מעמיק להרכבה ותפעול של מיקרוסקופ תאורה מובנה הפועל עם תאורה פלואורסצנטית השתקפות פנימית כוללת (TIRF-SIM) כדי לדמות תהליכים ביולוגיים דינמיים עם רזולוציית על אופטית במספר צבעים.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבנות וליישר מיקרוסקופ תאורה מובנה המתאים להדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים חיים במהירות גבוהה המסוגל לפעול במצבי TIRF וחתך אופטי עם מספר צבעים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של התא שלא ניתן לענות עליהן כיום באמצעות מיקרוסקופ TIRF מוגבל עקיפה סטנדרטי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא רזולוציית הזמן המהירה שלה בהשוואה לטכניקות מיקרוסקופיה אחרות ברזולוציה גבוהה, מה שהופך אותה למתאימה היטב להדמיית תהליכים דינמיים בתאים חיים.
למרות שפרוטוקול זה מתאר את השלבים לבניית מיקרוסקופ TIRF-SIM, ההתקנה גמישה ומשתנה בקלות כדי ליישם שיטות הדמיה כגון 3D-SIM, SIM מולטיפוקאלי ו-SIM לא-ליניארי. כדי לסדר וליישר את נתיב העירור עבור מיקרוסקופ תאורה מובנה, התחל בסימון מיקומי הרכיבים על השולחן האופטי כפי שמצוין כאן. לאחר הכנסת המראה הדיכרואית הראשונה, DM4, לצריח קוביית המסנן של מסגרת המיקרוסקופ, הכנס את המראה הדיכרואית השנייה, DM3, לתושבת מראה קינמטית מרובעת בגודל אינץ' אחד ומקם אותה במרחק אורך מוקד אחד מעדשת הקבל, L5. לאחר מכן, כדי להגדיר במדויק את הגישה האופטית למערכת, הסר את עדשת האובייקטיב, OB, מהצריח, ובמקום זאת הברג כלי יישור.
לאחר מכן, השתמש במראה הדיכרואית DM3 ובמראת יישור זמנית הממוקמת במיקום הסופי המשוער של ה-SLM כדי לנווט קרן ייחוס קולימית מלייזר אחד דרך מרכז החורים בשני דיסקי היישור. באמצעות שלוש מראות ומראה דיכרואית DM2 כפי שמתואר כאן, כוון את הקרן מהלייזר הראשון למראה הזמנית. לאחר קביעת הציר האופטי הגס, הסר את כלי היישור.
לאחר מכן הכנס קשתית לנתיב האלומה לפני שהיא נכנסת לגוף המיקרוסקופ ומרכז אותה על הקורה. חבר חתיכת כרטיס לבן עם חור קטן שבמרכזו הקשתית, ולאחר מכן הכנס מחדש את עדשת האובייקטיב. לאחר מכן, בצע התאמות זוויתיות איטרטיביות למראות DM3, ובמיקום SLM כדי למרכז את ההשתקפות האחורית על הכרטיס עם הקרן הנכנסת.
לאחר מכן הסר זמנית את עדשת האובייקט וסמן את נקודת הלייזר על התקרה כדי ליצור מיקום ייחוס. הכנס את עדשת הצינור, L5, במרחק של בערך אורך מוקד אחד מהמטרה, והרכיב אותה על שלב תרגום ליניארי המוגדר לתרגום לאורך כיוון קרן הייחוס. כוונן את המיקום והזווית של עדשת הצינור כך שהקרן היוצאת מהמטרה תהיה מקולמת ותפגע בנקודת הייחוס בתקרה.
בדוק שהעדשה מאונכת לקרן על ידי בדיקה חוזרת של ההשתקפות האחורית עם הקשתית והכרטיס הלבן. לאחר מכן הסר את עדשת האובייקט והכנס את העדשה השנייה של טלסקופ ממסר התמונה, L4. השתמש בתרגום הליניאריtagה כדי להתאים את המיקום והזווית של עדשה זו כדי לשמור על קולימציה, וכדי להבטיח שקרן הייחוס עדיין פוגעת בנקודה המסומנת בתקרה. החלף את עדשת האובייקט והכנס את העדשה הראשונה של הטלסקופ, L3. התאם את המיקום והזווית של עדשה זו כדי להבטיח קולימציה ואי סטייה כמתואר קודם לכן.
לאחר הרכבת שבב ה-SLM בהתאם לפרוטוקול הטקסט, כשהעדשות מיושרות, הכנס את ה-SLM במקום המראה. התאם את מיקום ה-SLM כך שקרן הייחוס ממוקמת במרכז שבב ה-SLM, והתאם את הזווית כך שהקרן תעבור דרך שתי עדשות הממסר. לאחר מכן בדוק שקרן הייחוס עדיין מרוכזת בנקודה המסומנת.
התקן את המעכב המשתנה של הגביש הנוזלי, או LCVR, עם הציר המהיר שלו ב-45 מעלות לקיטוב האירוע. לאחר מכן, לאחר השלמת היישור של מסובב הקיטוב על פי פרוטוקול הטקסט, תוך שימוש באור המועבר דרך העיניים, התמקד ברשתית וקבע את עדשת האובייקט במיקום זה. לאחר מכן הכינו שכבה חד-שכבתית של חרוזי פלורסנט על ידי פיזור טיפה של 100 ננומטר חרוזים צבעוניים על זכוכית כיסוי מספר 1.5.
השאירו את החרוזים לייבוש כדי לספוג את החרוזים לכוס לפני הטבילה מחדש במים. בעזרת שמן טבילה, הנח את דגימת החרוזים על המטרה. כוונן בעדינות את מיקום המצלמה כך ששכבת החרוזים הפלואורסצנטיים תהיה בפוקוס.
לאחר יצירת דפוסי סורג בינאריים של SIM כקבצי מפת סיביות והעלאתם ל-SLM בהתאם לפרוטוקול הטקסט, טען את תוכנת הבקרה SLM ולחץ על התחבר. בלשונית "רפרטואר", לחץ על "טען"כדי לפתוח את קובץ הרפרטואר, ולבדוק את מספר הפקודות השוטפות הכלולות בקובץ. לחץ על שלח ללוח" כדי להעלות את קובץ הרפרטואר ל-SLM.
לאחר מכן, בחר בכרטיסייה סטטוס והזן את מספר ההזמנה הפועלת. לחץ על בחר"כדי לשנות את סדר הריצה לסורג היישור. הכנס מסכה מרחבית, או SM, המותקנת על שלב XY לנתיב האלומה במיקום המוקד של L3, ותרגם את מיקומה ביחס לציר האופטי כך שרק הפקודות הראשונות הרצויות מועברות.
מיד לאחר המסנן המרחבי, רק שתי אלומות עגולות ייראו לעין. בדוק את התמונה של שכבת החרוזים הפלואורסצנטיים במצלמה. אם שתי הקורות העגולות אינן חופפות כפי שמתואר כאן, מקם מחדש את מישור הדגימה, תוך התאמה איטרטיבית של עדשת האובייקט ומיקום המצלמה.
לאחר כוונון עדין של המיקוד והגדרת מישור הדגימה בהתאם לפרוטוקול הטקסט, אשר את תאורת ה-TIRF על ידי הדמיה, למשלample, תמיסה של 10 צבע רודמין מיקרו-מולרי 6G על ידי הבאת הצבע למיקוד. אם שתי הקרניים מתרחשות בזווית ה-TIRF הנכונה, אז מולקולות בודדות יהיו גלויות ללא רקע גבוה, וקצוות הצמצם העגול יהיו בפוקוס. ניתן לבצע התאמות עדינות למיקום הקורות על ידי התאמת מראה דיכרואית DM3.
כדי לסנכרן ולכייל את המערכת, הנח את דגימת החרוז חד-שכבתית על המטרה והבא למיקוד. השתמש בתוכנת הבקרה SLM כדי לתכנת את ה-SLM להציג כל אחת מתמונות השינוי התלת-פאזי בתורה עבור כיוון התבנית הראשון. לאחר מכן עבור לסדר הפעלה רביעי של הרפרטואר לדוגמה.
בתוכנת הרכישה, הגדר את המצלמה לתקופת החשיפה הגלובלית על ידי בחירת מאפייני מצלמה מתקדמים "והגדרת Output Trigger Kind 1" לחיובי, ו-Output Trigger Kind 2 "לשלילי. בחלונית הרצף תחת Scan Type, בחר Hard Disk Record והגדר את ספירת הפריימים לשלוש. לאחר מכן לחץ על התחל "כדי לרכוש שלוש מסגרות.
דפוס ה-SLM ישתנה עם כל חשיפה. לאחר קריאת המערכת על פי פרוטוקול הטקסט, בתוכנת הבקרה SLM, העבר את סדר ההפעלה של SLM לסדרה המלאה של תשע תמונות סורג בינאריות הנדרשות ל-TIRF-SIM. זהו סדר ריצה אפס ברפרטואר לדוגמה.
לאחר רכישת תשע תמונות של דגימת החרוז, בחלונית הרצף של תוכנת המצלמה, בחר Hard Disk Record"כסוג הסריקה, ושנה את ספירת הפריימים לתשע. לאחר מכן לחץ על התחל "כדי לרכוש תמונות. לבסוף, תחת Save Buffered Images, בחר TIFF כסוג התמונה ולחץ על OK. שחזר תמונה ברזולוציה גבוהה בהתאם לפרוטוקול הטקסט.
מוצג כאן, חרוזים פלואורסצנטיים צבעוניים בקוטר 100 ננומטר צולמו כדי להשוות TIRF סטנדרטי ל-TIRF-SIM. ל-TIRF-SIM הייתה בבירור רזולוציה רוחבית גבוהה משמעותית בהשוואה ל-TIRF. הרזולוציה המשוערת של המיקרוסקופ היא 90 ננומטר ו-120 ננומטר עבור 488 ו-640 ננומטר TIRF-SIM, בהתאמה.
זה מתאים לשיפור של פי שניים ברזולוציה הרוחבית עבור שני אורכי הגל בהשוואה למקרה המוגבל של העקיפה התיאורטית. כפי שניתן לראות כאן, סיבי עמילואיד עם תווית פלואורסצנטית נוצרו במבחנה ושימשו גם כדגימת בדיקה להדגמת רזולוציה כפולה. מבנים תת-תאיים עם ניגודיות גבוהה, כגון מיקרו-צינורות עם תווית emGFP או LifeAct-GFP הם אידיאליים להדמיית TIRF-SIM, ומניבים תמונות בניגודיות גבוהה וברזולוציה סופר.
הדמיית TIRF-SIM באמצעות המערך המודגם מאפשרת תצפית על תת-אוכלוסייה של מיקרו-צינורות הממוקמים בקרבת קליפת המוח של תאי הבסיס, וניתן לראות פילמור ודה-פולימריזציה של מיקרו-צינוריות לאורך זמן. דגימות ניגודיות נמוכות ללא מבנים בדידים חסרות מידע ברזולוציה גבוהה למעט בקצוות קרום הפלזמה, ולכן הן לא אופטימליות להדמיית TIRF-SIM. לבסוף, ניגודיות אפנון גבוהה חיונית להדמיית SIM מוצלחת.
כפי שמודגם כאן, התמרת פורייה של התמונה המשוחזרת מאפשרת הדמיה של פונקציית ההעברה האופטית של ה-SIM. לאחר השליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך כשבוע, אם נרכשו כל החלקים הדרושים. כאשר מנסים הליך זה, יש להיות מודעים לנושאים הקריטיים ביותר ליישום מוצלח של TIRF-SIM.
ראשית, יישור מדויק של הקורות הוא חיוני. זה יכול להיות קשה, מכיוון שהם חייבים להיות ממוקמים בקצוות צמצם העדשה האובייקטיבית. שנית, זה קריטי שמצב הקיטוב של האור יסתובב יחד עם התבנית.
בלי זה, ניגודיות הדפוס של המדגם תהיה נמוכה ובניית התמונה לאחר מכן תהיה בלתי אפשרית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב את השלבים החשובים ביותר בבנייה ויישור של מיקרוסקופ TIRF-SIM מבוסס SLM. אל תשכח שעבודה עם לייזרים מסוג 3B עלולה להיות מסוכנת ביותר.
יש לשמור על עוצמת הלייזר ברמות בטוחות לעין תוך ביצוע תהליך היישור עם מטרת ה-TIRF במקום.
סקירה כללית
מאמר זה מספק מדריך מעמיק להקמה ולכיול של מיקרוסקופ הארה מובנית (structured illumination microscope) עבור דימות ברזולוציה גבוהה של תאים חיים במהירות גבוהה באמצעות TIRF-SIM. שיטה זו יתרונית לדימות של תהליכים ביולוגיים דינמיים במספר צבעים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- טכניקות מיקרוסקופיה
- דימוי ברזולוציה גבוהה (Super-Resolution Imaging)
רקע
- למיקרוסקופיית TIRF סטנדרטית יש מגבלות ברזולוציה של תהליכים דינמיים.
- טכניקות של רזולוציה-על (Super-resolution) משפרות את יכולות ההדמיה.
- מיקרוסקופיית הארה מובנית (SIM) מציעה רזולוציית זמן מהירה יותר.
- פרוטוקול זה מאפשר ביצוע שינויים גמישים בהגדרות המיקרוסקופ.
מטרת המחקר
- להקים מיקרוסקופ TIRF-SIM עבור דימוי מתקדם.
- לאפשר חקר של תהליכים ביולוגיים הדורשים רזולוציה זמנית גבוהה.
- לספק פרוטוקול מפורט עבור חוקרים לשחזור המערך.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- יישור רכיבים אופטיים, כולל מראות דיכרואיות ועדשות.
- שימוש במשהה משתנה של גביש נוזלי (liquid crystal variable retarder) לצורך בקרת קיטוב.
- הכנת דגימות של חרוזי פלואורסצנציה לצורך כיול.
- הטמעת תוכנת בקרת SLM ליצירת תבניות.
תוצאות עיקריות
- יישור מוצלח של מיקרוסקופ ה-TIRF-SIM.
- הדגמה של יכולות ההדמיה באמצעות חרוזי פלואורסצנציה.
- אימות של תנאי ההארה ב-TIRF.
- ביסוס פרוטוקול למחקרי הדמיה עתידיים.
מסקנות
- מערך ה-TIRF-SIM מאפשר דימות במהירות גבוהה של תהליכים דינמיים.
- שיטה זו יכולה להשיב על שאלות בביולוגיה של התא שלא ניתן היה להגיע אליהן בעבר.
- גמישות המערך מאפשרת שימוש במגוון שיטות דימות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
דימות ברזולוציה גבוהה (super-resolution) רב-צבעי ומהיר נותן מענה לצורך בוויזואליזציה של תהליכים דינמיים בבדיקות של תאים חיים, ומאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של מטרות טיפוליות באמצעות תצפית ישירה על דינמיקה סוב-צלולרית. TIRF-SIM מספק ביטחון ניבוי בתיקוף מטרות על ידי הפרדה של אינטראקציות חלבונים ואירועי תעתוע (trafficking) בקנה מידה ננומטרי ובדיוק זמני גבוה, ובכך תומך בקבלת החלטות של go/no-go בשלבי הגילוי המוקדמים. יכולת זו משפרת את פיתוח הבדיקות לסריקות פנוטיפיות על ידי אספקת תוצאות כמותיות עם רזולוציה מרחבית, המשפרות את הביטחון במטרה ומפחיתות תוצאות חיוביות שגויות בזיהוי מובילים (lead identification).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של לוקליזציית חלבונים ודינמיקה ברזולוציה של 90-120 nm בתאים חיים.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות תצפית ישירה על פולימריזציה ודפולימריזציה של מיקרוטובוליים סמוך לקורטקס הבזאלי.
- ערך חיזוי: מגביר את הביטחון במחקרי מעורבות מטרה (target engagement) על ידי הפרדה של תתי-אוכלוסיות של מיקרוטובוליים וסיבי עמילואיד עם רזולוציה לטרלית כפולה מזו של מגבלות הדיפרקציה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות לתהליכי עבודה המשכיים על ידי כיול עם שכבות מונו-מולקולריות של חרוזי פלואורסצנציה להגדרת מדדי ייחוס לרזולוציה.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה וסבירות לשחזור של הבדיקה באמצעות יצירת תבניות SLM מסונכרנת, בקרת אורך גל והפעלת מצלמה לרכישת פריימים עקבית.
- יכולת הרחבה: מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה עבור אורכי גל של עירור (488 nm, 640 nm) ואמצעי דימיון הכוללים TIRF ומצבי חיתוך אופטי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רצף תרגומי: מקשר בין תצפיות גילוי של מבנים תת-תאיים (למשל, microtubules של emGFP, LifeAct-GFP) לבין תיקוף פרה-קליני באמצעות דימוי ברזולוציית-על ובניגודיות גבוהה.
- קידום מותאם סיכונים: מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי ויזואליזציה של תהליכים דינמיים בתאים חיים שאינם נראים ב-TIRF סטנדרטי, ובכך מסייע בבחירת מטרה.
- מערכת רלוונטית למחלה: מדגים ישימות למודלים של תאים חיים, ותומך בהתאמת סמנים ביולוגיים לתהליכים כגון דינמיקה של microtubule בניוון עצבי או בסרטן.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
ממקמת את השיטה בשלב שבין הגילוי המוקדם לזיהוי מובילים (lead identification), שבו רזולוציה בקנה מידה ננומטרי של תהליכים דינמיים מספקת מידע לתיקוף המטרה ולמוכנות הבדיקה לסריקת תרכובות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבחינת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי פתרון התפלגויות ודינמיקה של חלבונים בקנה מידה ננומטרי במודלים של תאים חיים.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות דימוי כמותי בקצב פריימים גבוה (עד 10 Hz) עם יכולת רב-צבעית להערכה מהימנה של תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת פלטים סטטיסטיים באמצעות תמונות רזולוציה-על משוחזרות ותיקוף של פונקציית העברה אופטית מבוססת התמרת פוריה להשוואת תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשרת להמשכיות פרה-קלינית באמצעות דימוי רלוונטי למחלה של מבנים תת-תאיים בניגודיות ורזולוציה גבוהות.
- שימוש חוזר ארגוני: מגדירה את המערכת כיכולת ניתנת לשימוש חוזר עבור שיטות דימוי מרובות (TIRF-SIM, 3D-SIM, multifocal SIM) לאורך פרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי, תיקוף מטרה, וצמצום עמימות מכניסטית בדימות תאים חיים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה באמצעות בקרה אוטומטית של קיטוב, מבנה מרחבי וסנכרון אורכי גל.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך הפיתוח (go/no-go), יעילות הון וצמצום סיכונים ביולוגיים בשלבים מאוחרים באמצעות ויזואליזציה מוקדמת של דינמיקת המטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף וקבלת החלטות קידום מותאמות לסיכון, המבוססות על תצפית ישירה על התנהגות המטרה הטיפולית בהקשרים רלוונטיים פיזיולוגית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בכיול אופטי, בטיחות בלייזר (Class 3B), ויצירת תבניות מבוססות SLM עבור הארה מובנית.
- נדרשת סבב מכשירים לבקרת קיטוב (liquid crystal variable retarder), טריגר למצלמה במהירות גבוהה, ושילוב לייזרים רב-אורכי גל.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית להקמת שולחן אופטי, מיקום רכיבים ופרוטוקולי כיול באמצעות שכבות מונו-מולקולריות של חלקיקי פלואורסצנציה.
- כולל שיקולי התאמה לסוגי דגימות שונים, שכן דגימות בעלות ניגודיות נמוכה חסרות מידע ברזולוציה גבוהה למעט בקצוות הממברנה.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הצורך בניגודיות מודולציה גבוהה לצורך הדמיית SIM מוצלחת וכיול מדויק של הקרן במפתח של עדשת העדשה.
