Name: A Guide to מיקרוסקופית TIRF תאורה מובנית ב- High Speed עם צבעים מרובים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: למדו לבנות וליישר מיקרוסקופ TIRF-SIM לדימות תאים חיים ברזולוציית-על במהירות גבוהה ובצבעים מרובים. שיטה זו מאפשרת מחקר תהליכים דינמיים בביולוגיית התא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של האמון Leverhulme, הנדסה המדעים הפיזיקליים מועצת המחקר [EP / H018301 / 1, EP / G037221 / 1]; אלצהיימר Research UK [ערוק-EG2012A-1]; קרן Wellcome [089,703 / Z / 09 / Z] המועצה למחקר רפואי [MR / K015850 / 1, MR / K02292X / 1]. אנו מודים E. Avezov ומ Lu עבור transfection של תאים LifeAct-GFP ו cytosolic-GFP בהתאמה, וו צ&#39;ן להכנת התרבות HEK293. אנו מודים גם ק O&#39;Holleran לסיוע עם העיצוב של המיקרוסקופ, ול &#39;שאו ור Heintzmann לדיונים והצעות שימושיים.

<ol><li>Heintzmann, R., Cremer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laterally+modulated+excitation+microscopy%3A+improvement+of+resolution+by+using+a+diffraction+grating%5BTitle%5D)+AND+%22BiOS+Eur%22%5BJournal%5D)">Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating.</a> BiOS Eur. 3568, 185-196 (1999).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Shim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li>
<li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+Nanoscopy+of+Actin+Dynamics+in+Synapses+Deep+Inside+Living+Brain+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices.</a> Biophys. J. 101 (5), 1277-1284 (2011).</li>
<li>Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Live-Cell+Dynamics+and+Structure+at+the+Single-Molecule+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level.</a> Mol. Cell. 58 (4), 644-659 (2015).</li>
<li>Westphal, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-Rate+Far-Field+Optical+Nanoscopy+Dissects+Synaptic+Vesicle+Movement%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Video-Rate Far-Field Optical Nanoscopy Dissects Synaptic Vesicle Movement.</a> Science. 320 (5873), 246-249 (2008).</li>
<li>Davies, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYK4+Promotes+Antiparallel+Microtubule+Bundling+by+Optimizing+MKLP1+Neck+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">CYK4 Promotes Antiparallel Microtubule Bundling by Optimizing MKLP1 Neck Conformation.</a> PLOS Biol. 13 (4), e1002121(2015).</li>
<li>Laine, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+herpes+simplex+virus+by+optical+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of herpes simplex virus by optical super-resolution imaging.</a> Nat. Commun. 6, 5980(2015).</li>
<li>Pinotsi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+heterogeneous+amyloid+fibril+growth+kinetics+via+two-color+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Direct observation of heterogeneous amyloid fibril growth kinetics via two-color super-resolution microscopy.</a> Nano Lett. 14 (1), 339-345 (2014).</li>
<li>Esbjörner, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observations+of+amyloid+%CE%B2+Self-assembly+in+live+cells+provide+insights+into+differences+in+the+kinetics+of+A%CE%B2%281-40%29+and+A%CE%B2%281-42%29+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observations of amyloid β Self-assembly in live cells provide insights into differences in the kinetics of Aβ(1-40) and Aβ(1-42) aggregation.</a> Chem. Biol. 21 (6), 732-742 (2014).</li>
<li>Michel, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+monomeric+tau+protein+is+sufficient+to+initiate+the+spread+of+tau+protein+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Extracellular monomeric tau protein is sufficient to initiate the spread of tau protein pathology.</a> J. Biol. Chem. 289 (2), 956-967 (2014).</li>
<li>Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Super-Resolution+Imaging+of+%CE%B2-Amyloid+Aggregation+In+Vitro+and+In+Vivo%3A+Method+and+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Syst.+Biol.+Alzheimer%27s+Dis.+SE+-+6%22%5BJournal%5D)">Optical Super-Resolution Imaging of β-Amyloid Aggregation In Vitro and In Vivo: Method and Techniques.</a> Syst. Biol. Alzheimer's Dis. SE - 6. 1303, 125-141 (2016).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).</li>
<li>Cragg, G. E., So, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+resolution+enhancement+with+standing+evanescent+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Lateral resolution enhancement with standing evanescent waves.</a> Opt. Lett. 25 (1), 46-48 (2000).</li>
<li>Chung, E., Kim, D., So, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+resolution+wide-field+optical+imaging%3A+objective-launched+standing-wave+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Extended resolution wide-field optical imaging: objective-launched standing-wave total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 31 (7), 945(2006).</li>
<li>Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+video+microscopy+of+live+cells+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination.</a> Nat. Methods. 6 (5), 339-342 (2009).</li>
<li>Fiolka, R., Shao, L., Rego, E. H., Davidson, M. W., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+two-color+3D+imaging+of+live+cells+with+doubled+resolution+using+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Time-lapse two-color 3D imaging of live cells with doubled resolution using structured illumination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (14), 5311-5315 (2012).</li>
<li>Brunstein, M., Wicker, K., Hérault, K., Heintzmann, R., Oheim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-field+dual-color+100-nm+super-resolution+imaging+reveals+organization+and+dynamics+of+mitochondrial+and+ER+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Full-field dual-color 100-nm super-resolution imaging reveals organization and dynamics of mitochondrial and ER networks.</a> Opt. Express. 21 (22), 26162-26173 (2013).</li>
<li>Förster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+structured+illumination+microscope+setup+with+high+acquisition+speed+by+using+a+spatial+light+modulator%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Simple structured illumination microscope setup with high acquisition speed by using a spatial light modulator.</a> Opt. Express. 22 (17), 20663(2014).</li>
<li>Lu-Walther, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fastSIM%3A+a+practical+implementation+of+fast+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Appl.+Fluoresc%22%5BJournal%5D)">fastSIM: a practical implementation of fast structured illumination microscopy.</a> Methods Appl. Fluoresc. 3, 014001(2015).</li>
<li>Shaw, M., Zajiczek, L., O'Holleran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+speed+structured+illumination+microscopy+in+optically+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High speed structured illumination microscopy in optically thick samples.</a> Methods. , (2015).</li>
<li>von Olshausen, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Total+internal+reflection+microscopy%3A+super-resolution+imaging+of+bacterial+dynamics+and+dark+field+imaging%22">Total internal reflection microscopy: super-resolution imaging of bacterial dynamics and dark field imaging</a>. , University of Freiburg. (2012).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li>
<li>Meadowlark Optics Inc. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Basic+Polarization+Techniques+and+Devices%22">Basic Polarization Techniques and Devices</a>. , (2005).</li>
<li>O'Holleran, K., Shaw, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+effects+on+contrast+in+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Polarization effects on contrast in structured illumination microscopy.</a> Opt. Lett. 37 (22), 4603(2012).</li>
<li>Brankner, S. Z., Hobson, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrankner%2C+SZ+%22Synchronization+and+Triggering+with+the+ORCA-Flash4.0+Scientific+CMOS+Camera%22">Synchronization and Triggering with the ORCA-Flash4.0 Scientific CMOS Camera</a>. , <a target="_blank" href="http://www.hamamatsu.com/resources/pdf/sys/SCAS0098E_synchronization.pdf">http://www.hamamatsu.com/resources/pdf/sys/SCAS0098E_synchronization.pdf</a> (2013).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li>
<li>Wicker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-iterative+determination+of+pattern+phase+in+structured+illumination+microscopy+using+auto-correlations+in+Fourier+space%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Non-iterative determination of pattern phase in structured illumination microscopy using auto-correlations in Fourier space.</a> Opt. Express. 21 (21), 24692(2013).</li>
<li>Boulanger, J., Pustelnik, N., Condat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-smooth+convex+optimization+for+an+efficient+reconstruction+in+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%222014+IEEE+11th+Int.+Symp.+Biomed.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Non-smooth convex optimization for an efficient reconstruction in structured illumination microscopy.</a> 2014 IEEE 11th Int. Symp. Biomed. Imaging. 3 (1), 995-998 (2014).</li>
<li>Ströhl, F., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+joint+Richardson-Lucy+deconvolution+algorithm+for+the+reconstruction+of+multifocal+structured+illumination+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Appl.+Fluoresc%22%5BJournal%5D)">A joint Richardson-Lucy deconvolution algorithm for the reconstruction of multifocal structured illumination microscopy data.</a> Methods Appl. Fluoresc. 3 (1), 014002(2015).</li>
<li>Mudry, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+illumination+microscopy+using+unknown+speckle+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Photonics%22%5BJournal%5D)">Structured illumination microscopy using unknown speckle patterns.</a> Nat. Photonics. 6 (5), 312-315 (2012).</li>
<li>Ayuk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+illumination+fluorescence+microscopy+with+distorted+excitations+using+a+filtered+blind-SIM+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Structured illumination fluorescence microscopy with distorted excitations using a filtered blind-SIM algorithm.</a> Opt. Lett. 38 (22), 4723(2013).</li>
<li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIMcheck%3A+a+Toolbox+for+Successful+Super-resolution+Structured+Illumination+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy.</a> Sci. Rep. 5, 15915(2015).</li>
<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+live%2C+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended-resolution+structured+illumination+imaging+of+endocytic+and+cytoskeletal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics.</a> Science. 349 (6251), (2015).</li>
<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+live%2C+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

<html> שהותקנו מערכות TIRF-SIM כגון ההתקנה המפורטת בפרוטוקול זה מסוגלות הדמיה סופר-רזולוציה ססגונית במהירות גבוהה לעומת מיקרוסקופים זמינים מסחרי. היתרון הגלום של SIM כטכניקת סופר-רזולוציה הוא כי ההחלטה הזמנית אינה מוגבלת על ידי photophysics של fluorophore, בהשוואה לשיטות אחרות כגון מיקרוסקופיה לוקליזציה מולקולה בודדת (SMLM) או שיטות סריקת נקודה כגון מיקרוסקופיה דלדול פליטה מאולצת ( STED). שלא כמו טכניקות אחרות אלה, SIM אינו מחייב fluorophores photoswitchable או מתכלה כך ההדמיה ססגונית היא פשוטה. מערכות TIRF-SIM ללא, כגון אופטי חתך SIM ו- SIM מולטיפוקליות בדרך כלל ניתן להשיג שיפורים ברזולוציה של פי 1.7 או פחות בפועל בניגוד הגורם של שיפור 2 דיווחו כאן, ומערכות מסחריות הן גם בדרך כלל איטי יותר ופחות גמישה מאשר מערכת המובאים בפרוטוקול זה. &quot;&gt; שני הקשיים העיקריים ביישום הטכניקה הזו הם ראשית את הצורך עבור מיקום מדויק של שש קורה SIM בתוך אזור TIR של הצמצם האחורי של המטרה, מחייב הליך יישור אופטי מייגע זמן רב. שנית, לייצר בניגוד דפוס גבוה על מדגם, סיבוב הקיטוב חיוני. עבור מערכות NA 2D-SIM נמוך, סיבוב הקיטוב יכול להימנע על ידי בחירה זהירה של האוריינטציה קיטוב ליניארי, אבל זה הופך להיות בלתי אפשרי עבור TIRF-SIM 25. עבור הדמיה ססגוניות במהירות גבוהה, אלקטרו שליטת קיטוב אופטית יש צורך וזה מגדיל את מורכבות חשבון המערכת. מגבלות הטכניקה TIRF-SIM, כמו TIRF הקונבנציונלי, מוגבל באופן טבעי תצפית של מבנים ביולוגיים ותהליכים הממוקמים בקרום תאי הבסיס שיכול להיות מואר על ידי עומק חדירת 150-200 ננומטר של שדה החלוף. בזמןSIM מצוטט לעתים קרובות להיות פחות photodamaging לתאים מאשר כל אחד STED או SMLM, הכפלת רזולוציה לרוחב עדיין להגדיל את המספר הדרוש של פוטונים על ידי לפחות פי 4 5 לעומת מיקרוסקופיה TIRF קונבנציונאלי. עבור הדמית מסגרת חליפין גבוהים עם זמני חשיפות קצרים, עליית פוטון זה מחייבת שימוש בעוצמות תאורה מוגברת. בעוד כל fluorophore יכול לשמש הדמית SIM של דגימות מרגשות קבועות או איטיים, חלבוני ניאון בהירות גבוהה או צבע סינטטי הדור הבא עם photostability המשופרת מומלצי הדמית תא חי. למרות שיישום זה מסוגל הדמית צבע אחד מסגרת חליפי SIM העולה על 20 הרץ, הדמיה ססגונית במערכת הציגה מוגבלת על ידי זמן המעבר של גלגל מסנן פליטה הממונע. בשל גודלו של שבב המצלמה sCMOS, השימוש של אופטיקה פיצול תמונה מסנן ופליטה multiband יהיה אפשרי ולאפשר אני סימולטניmaging עם אורכי גל מרובים ללא עונש מהירות. אפשרות נוספת תהיה לסירוגין לייזרי העירור השונים ומשתמש מסנן חריץ multiband לדחות את אור העירור. השימוש SLM בינארי ferroelectric ביישום זה גם אינו אופטימלי. יעילות דיפרקציה של SLM כזה הוא נמוך מאוד, ולכן רוב לאור האירוע הוא בהשתקפות אפס הסדר, אשר סוננו על ידי מסכה מרחבית. עבור יישומים הדורשים שיעור גבוה מסגרת מאוד, מהירות הדמיה ולכן היא מוגבלת על ידי הספק של דיודות לייזר. SLM גם מציג כמה סְגַלגַלוּת בקיטוב עבור אורכי גל מן גל עיצוב 550 ננומטר שבו פיקסלים אינם פועלים כמו צלחות גל חצי אידיאליות. אמנם זה יכול להיות מתוגמל על ידי שימוש LCVR נוסף, הפתרון האידיאלי עשוי להיות השימוש בהתקן מייקרו-ראי דיגיטלי (DMD) כמחולל דפוס. שינויים אפשריים Prese ההתקנהnted כאן הוא גמיש ומשתנה בקלות רבה יותר מאשר מכשירים מסחריים כך שיטות הדמיה אחרות כגון 3D-SIM, SIM-2D מהר, SIM מולטיפוקליות (MSIM) ו- SIM שאינו ליניארי (NL-SIM) יכולות להיות מיושמות 21,34,35. 2D-SIM יכול להיות גם מתאים הדמיה שטוח יחסית, זז מהר מבנים כגון reticulum endoplasmic הפריפריה. חדר המיון הפריפריה טמון עמוק בתוך התא מאשר אפשר להאיר באמצעות שדה TIRF חלוף אך בשל המבנה השטוח ניתן הדמיה באמצעות-SIM 2D רגיל עם רקע זניח מחוץ לפוקוס. בנוסף, השימוש של אלגוריתמי שיקום חתך אופטיים משופרים לדכא out-of-פוקוס אור להרחיב את שימוש 2D-SIM כדי דגימות עבות אופטי, אם כי שם הכפלת רזולוציה הצירית אינה נדרשו 21. בשנת MSIM, המדגם הוא מואר על ידי שריג דליל של מוקדי עירור 36. טיפול זה יכול להיות מיושם על ידי הסרת המסכה מרחבית (SM) והחלפתו על ידי מקטב. SLM החברה פועלת כמו אפנן משרעת. בסורגי SIM בינארי מוצגים על SLM יכולים להיות מוחלף על ידי שריג 2D של כתמים, עם הגודל של הכתמים נבחרו להיות שווה לגודל של יכולת מיקוד עקיף במישור התמונה. באיור 7 א, סריג של 4 x 4 ריבועים פיקסל מוצג על SLM (ההבלעה) אשר כאשר demagnified על המדגם מייצר מוקדים עקיפים מוגבלים של 150 x 150 ננומטר, בהתחשב בגודל פיקסל SLM הפיזי של 13.62 מיקרומטר. מוקדי העירור אז יכולים להיות מתורגמים על ידי העברת דפוס הסריג על SLM וזה חוזר על עצמו מספר פעמים על מנת להאיר את השדה כולו מבט. תמונות נרכשות לכל תפקיד דפוס תורגם בערימה היא שלאחר עיבוד להניב תמונה משוחזרת עם רזולוציה משופרת של עד בפקטור של <img alt="משוואה" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq19.jpg" /> והקטן מחוץ מוקד אור לעומת תמונת widefield המקבילה30. טיפול זה יכול להיות שימושי עבור הדמיה עבה, דגימות צפופות עבורו SIM סטנדרטי אינו מתאים עבור מבנים ניגודיות נמוכים למשל כגון תאי דם אדומים מוכתמים (איור 7C), אם כי פעם הרכישה גדלה בשל מספר הרב של מסגרות גלם נדרש לכל שדה הראיה (במקרה זה N = 168). לבסוף, ההתקנה יכולה להיות שונה כדי לאפשר או גבוה NA ליניארי TIRF-SIM או בדוגמת הפעלה שאינו ליניארי SIM (PA NL-SIM), כפי שהוצגה לאחרונה על ידי Li et al., על ידי שימוש אובייקטיבי ultrahigh 1.7 NA או תוספת של לייזר photoactivation 405 ננומטר ואופטימיזציה זהירה של דפוסי צורמת SLM 35. יישומים עתידיים SIM עדיין טכניקה המתפתחת במהירות ויישומים רבים במדעי החיים יופעלו בעתיד. מהירות, רזולוציה, ושיפורים הניגודיות של הטכניקה ואת יכולת השימוש מ fluorophores תקןEAN שעבור bioimaging, מוגדר SIM להחליף מערכות מיקרוסקופ רבות קונבנציונליות, כגון פלטפורמות שדה confocal ורחבות. מערכות SIM מסחריות זמינות כבר היום עם מפרט טכני יוצא מן הכלל, עם זאת, הם מעבר להישג ידם הכספי של מעבדות מחקר רבות, ואת, באופן מכריע, הם מאבדים את הגמישות להיות משונים פותח על מנת ליישם את התפתחויות המחקר העדכני ביותר בתחום. גם אין להם את היכולת החיונית &quot;להיות מותאמת עבור הניסוי בהישג היד&quot;, לעתים קרובות צוואר בקבוק קריטי חיתוך מחקר מדעי חי קצה. המערכת המתוארת כאן יהיה מתאים במיוחד גם ללמוד תהליכים דינמיים ליד פני התא, עבור במבחנה של מערכות bilayer מחדש, ללמוד כימיה של פני השטח של חומרים מדעי הטבע, למשל. חומרי 2D, ויישומים רבים אחרים.

<table><tbody><tr><td>לייזר 488 ננומטר</td><td>Toptica</td><td>iBeam SMART</td><td>עם אפנון דיגיטלי</td></tr><tr><td>561 ננומטר לייזר</td><td>קוהרנטי</td><td>OBIS LS</td><td>עם אפנון דיגיטלי</td></tr><tr><td>640 ננומטר לייזר</td><td>Cobolt</td><td>MLD</td><td>עם אפנון דיגיטלי</td></tr><tr><td>מראות דיכרואיות ארוכות מעבר&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>לשילוב קורות עירור</td></tr><tr><td>מראה דיכרואית מרובעת פס</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td>בעובי 3 מ"מ, הדמיית TIRF שטוחה, מותקנת בקוביית מסנן אולימפוס BX</td></tr><tr><td>מראה דיכרואית מרובעת פס</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td>מאותה אצווה כמו לעיל, 25 x 25 מ"מ</td></tr><tr><td>1 אינץ' תושבת קינמטית מרובעת</td><td>אופטיקה אדמונד</td><td>58-860</td><td></td></tr><tr><td>גלן-טיילור קלציט מקטבים</td><td>Thorlabs</td><td>GT5-A</td><td>ליישור של LCVR</td></tr><tr><td>Glan-Taylor הר</td><td>Thorlabs</td><td>SM05PM5</td><td></td></tr><tr><td>צלחת חצי גל אכרומטית</td><td>Thorlabs</td><td>AHWP05M-600</td><td>400-800 ננומטר</td></tr><tr><td>סיבוב כלוב הר</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1 / M</td><td>עבור HWP</td></tr><tr><td>גביש נוזלי משתנה מעכב</td><td>Meadowlark אופטיקה</td><td>SWIFT</td><td>נבנה בהתאמה אישית כדי לספק עיכוב גלים מלא בטווח של 488 עד 640 ננומטר.</td></tr><tr><td>בקר LCVR</td><td>Meadowlark אופטיקה</td><td>D3060HV</td><td>בקר מתח גבוה שני ערוצים עבור מעכבי גביש נוזלי</td></tr><tr><td>צלחת רבע גל Achromatic</td><td>Meadowlark אופטיקה</td><td>AQM-100-0545</td><td></td></tr><tr><td>כלוב סיבוב הר</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1P/M</td><td>עבור QWP</td></tr><tr><td>10 מ"מ אכרומטי כפול</td><td>Thorlabs</td><td>AC080-010-A-ML</td><td>עבור מרחיב קרן</td></tr><tr><td>200 מ"מ achromatic כפול</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>עבור מרחיב קרן</td></tr><tr><td>כלוב XY מתרגמים</td><td>Thorlabs</td><td>CXY1</td><td></td></tr><tr><td>מאפנן אור מרחבי פרואלקטרי</td><td>תצוגות ממד</td><td>רביעי M0787-00249&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>SXGA-3DM (IFF) מיקרו-תצוגה מסוג M249, 1,280 x 1,024 פיקסלים, עם לוח דרייבר</td></tr><tr><td>מסגרת הרכבה SLM</td><td>Forth Dimension Displays</td><td>M0787-10014</td><td>קבוע לתושבת אלומיניום בנויה בהתאמה אישית</td></tr><tr><td>&Oslash; 50.8 מ"מ גימבל מראה הר</td><td>Thorlabs</td><td>GM200/M</td><td>עבור SLM הרכבה</td></tr><tr><td>דו-צירית ליניארית תרגום שלב עם פלטפורמה מסתובבת</td><td>Thorlabs</td><td>XYR1/M</td><td>עבור SLM הרכבה</td></tr><tr><td>מסילה</td><td>מוביל Newport</td><td>M-PRC-3</td><td>עבור SLM הרכבה</td></tr><tr><td>דיוק מסילה אופטית</td><td>Newport</td><td>PRL-6</td><td>עבור SLM הרכבה</td></tr><tr><td>300 מ"מ achromatic כפול עדשה</td><td>Qioptiq</td><td>G322 273 322&nbsp;</td><td>f = 300 מ"מ, קוטר 31.5 מ"מ</td></tr><tr><td>עדשה כפולה אכרומטית 140 מ"מ</td><td>Qioptiq</td><td>G322 239 322</td><td>f = 140 מ"מ, קוטר 31.5 מ"מ</td></tr><tr><td>דיוק XY תושבות תרגום</td><td>Thorlabs</td><td>LM2XY</td><td></td></tr><tr><td>מתאמי הרכבה לעדשות</td><td>Thorlabs</td><td>SM2AD32</td><td>להרכבת עדשות 31.5 מ"מ בתושבות 2 אינץ'</td></tr><tr><td>שלבי תרגום</td><td>Comar</td><td>12XT65</td><td>Dovetail, כונן צד</td></tr><tr><td>XY מתרגם עם כוננים דיפרנציאליים</td><td>Thorlabs</td><td>ST1XY-D/M</td><td>למסנן מרחבי</td></tr><tr><td>תושבת כלוב סיבוב</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1/M</td><td>למסנן מרחבי</td></tr><tr><td>300 מ"מ כפול אכרומטי</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-300-A-ML</td><td>עדשת צינור עירור</td></tr><tr><td>אוטומטי XY stage עם צלחת עליונה Z-piezo</td><td>ASI</td><td>PZ-2150-XYFT-PZ-IX71&nbsp;</td><td>עם בקר MS-2000</td></tr><tr><td>מסגרת מיקרוסקופ הפוכה</td><td>אולימפוס</td><td>IX-71</td><td></td></tr><tr><td>עדשת אובייקטיבית</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>UAPON100XOTIRF 100X/1.49NA</td></tr><tr><td>גלגל מסנן במהירות</td><td>גבוהה קודם מדעי</td><td>HF110A</td><td>עם בקר ProScan III</td></tr><tr><td>קודם מסנני פליטת פס פס Semrock</td><td></td><td>FF01-525/30, FF01-676/29</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת sCMOS</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA פלאש v4.0</td><td></td></tr><tr><td>חממה עליונה</td><td>OKO Lab</td><td>H301-K-FRAME</td><td>להדמיית תאים חיים, עם טמפרטורת קו מודגש ובקרי CO2 עמודים</td></tr><tr><td>אופטיים מנירוסטה</td> סדרת <td>Thorlabs</td><td>TR</td><td>להרכבת רכיבים</td></tr><tr><td>אופטיים מחזיקי עמודים</td> סדרת <td>Thorlabs</td><td>PH</td><td>להרכבת רכיבים אופטיים</td></tr><tr><td>תושבות מראה קינמטיות</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td>להרכבת מראות 1 אינץ'</td></tr><tr><td>אינטרפרומטר גזירה</td><td>Thorlabs</td><td>SI100</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוספירות פלואורסצנטיות 100 ננומטר</td><td>Life Technologies</td><td>T-7279</td><td>Tetraspeck</td></tr><tr><td>Rhodamine 6G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83697-250MG</td><td></td></tr><tr><td>8 באר זכוכית תחתית כלים</td><td>ibidi</td><td>80827</td><td>עם #1.5 coverglass</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155409</td><td>עם #1.5 כיסוי זכוכית</td></tr><tr><td>כיסוי 0.01 מ"מ מיקרוסקופ שקופית רשתית</td><td>EMS</td><td>68039-22</td><td></td></tr><tr><td>CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10613</td><td></td></tr></tbody></table>

a guide to מיקרוסקופית tirf תאורה מובנית ב- high speed ​​עם צבעים מרובים

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

הדמיה סופר-רזולוציה אופטית עם מיקרוסקופיה תאורה מובנה (SIM) היא טכנולוגיית מפתח עבור הדמיה של תהליכים ברמה המולקולרית בתחומי הכימיה ומדעי ביו. למרות שמערכות ה- SIM מסחריות זמינות, מערכות שמיועדות מותאם אישית במעבדה יכולה להכות מערכות מסחריות, האחרונות בדרך כלל תוכננו עבור קלות שימוש ויישומים למטרות כלליות, הן מבחינת נאמנות הדמיה ומהירות. מאמר זה מציג מדריך מעמיק בבניית מערכת ה- SIM המשתמשת השתקפות פנימית מוחלטת (TIR) ​​תאורה והוא מסוגל הדמיה במהירות של עד 10 הרץ בשלושה צבעים ברזולוציה לרמה של 100 ננומטר. בשל השילוב של ה- SIM TIRF, המערכת מספקת ניגודיות תמונה טובה יותר מאשר טכנולוגיות מתחרות. כדי להשיג מפרטים אלה, כמה אלמנטים אופטיים משמשים כדי לאפשר בקרה אוטומטית על מבנה מדינת הקיטוב המרחבי של אור התאורה לכל wav העירור הזמיןelengths. פרטים נוספים על יישום חומרה ובקרה ניתנים להשיג סנכרון בין דור דפוס אור העירור, אורך גל, מדינת קיטוב, ושליטת מצלמה תוך שימת דגש על השגת קצב פריימי רכישה מרבית. צעד אחר צעד פרוטוקול ליישור מערכת כיול מוצג והשיפור ברזולוצית השגת מקבלת תוקף על דגימות מבחן אידיאליות. יכולת הדמיה סופר-רזולוציה וידאו שער מודגם עם תאים חיים.

מאמר זה מספק מדריך מעמיק להרכבה ותפעול של מיקרוסקופ תאורה מובנה הפועל עם תאורה פלואורסצנטית השתקפות פנימית כוללת (TIRF-SIM) כדי לדמות תהליכים ביולוגיים דינמיים עם רזולוציית על אופטית במספר צבעים.

A Guide to מיקרוסקופית TIRF תאורה מובנית ב- High Speed ​​עם צבעים מרובים

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבנות וליישר מיקרוסקופ תאורה מובנה המתאים להדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים חיים במהירות גבוהה המסוגל לפעול במצבי TIRF וחתך אופטי עם מספר צבעים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של התא שלא ניתן לענות עליהן כיום באמצעות מיקרוסקופ TIRF מוגבל עקיפה סטנדרטי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא רזולוציית הזמן המהירה שלה בהשוואה לטכניקות מיקרוסקופיה אחרות ברזולוציה גבוהה, מה שהופך אותה למתאימה היטב להדמיית תהליכים דינמיים בתאים חיים.למרות שפרוטוקול זה מתאר את השלבים לבניית מיקרוסקופ TIRF-SIM, ההתקנה גמישה ומשתנה בקלות כדי ליישם שיטות הדמיה כגון 3D-SIM, SIM מולטיפוקאלי ו-SIM לא-ליניארי. כדי לסדר וליישר את נתיב העירור עבור מיקרוסקופ תאורה מובנה, התחל בסימון מיקומי הרכיבים על השולחן האופטי כפי שמצוין כאן. לאחר הכנסת המראה הדיכרואית הראשונה, DM4, לצריח קוביית המסנן של מסגרת המיקרוסקופ, הכנס את המראה הדיכרואית השנייה, DM3, לתושבת מראה קינמטית מרובעת בגודל אינץ' אחד ומקם אותה במרחק אורך מוקד אחד מעדשת הקבל, L5. לאחר מכן, כדי להגדיר במדויק את הגישה האופטית למערכת, הסר את עדשת האובייקטיב, OB, מהצריח, ובמקום זאת הברג כלי יישור.לאחר מכן, השתמש במראה הדיכרואית DM3 ובמראת יישור זמנית הממוקמת במיקום הסופי המשוער של ה-SLM כדי לנווט קרן ייחוס קולימית מלייזר אחד דרך מרכז החורים בשני דיסקי היישור. באמצעות שלוש מראות ומראה דיכרואית DM2 כפי שמתואר כאן, כוון את הקרן מהלייזר הראשון למראה הזמנית. לאחר קביעת הציר האופטי הגס, הסר את כלי היישור.לאחר מכן הכנס קשתית לנתיב האלומה לפני שהיא נכנסת לגוף המיקרוסקופ ומרכז אותה על הקורה. חבר חתיכת כרטיס לבן עם חור קטן שבמרכזו הקשתית, ולאחר מכן הכנס מחדש את עדשת האובייקטיב. לאחר מכן, בצע התאמות זוויתיות איטרטיביות למראות DM3, ובמיקום SLM כדי למרכז את ההשתקפות האחורית על הכרטיס עם הקרן הנכנסת.לאחר מכן הסר זמנית את עדשת האובייקט וסמן את נקודת הלייזר על התקרה כדי ליצור מיקום ייחוס. הכנס את עדשת הצינור, L5, במרחק של בערך אורך מוקד אחד מהמטרה, והרכיב אותה על שלב תרגום ליניארי המוגדר לתרגום לאורך כיוון קרן הייחוס. כוונן את המיקום והזווית של עדשת הצינור כך שהקרן היוצאת מהמטרה תהיה מקולמת ותפגע בנקודת הייחוס בתקרה.בדוק שהעדשה מאונכת לקרן על ידי בדיקה חוזרת של ההשתקפות האחורית עם הקשתית והכרטיס הלבן. לאחר מכן הסר את עדשת האובייקט והכנס את העדשה השנייה של טלסקופ ממסר התמונה, L4. השתמש בתרגום הליניאריtagה כדי להתאים את המיקום והזווית של עדשה זו כדי לשמור על קולימציה, וכדי להבטיח שקרן הייחוס עדיין פוגעת בנקודה המסומנת בתקרה. החלף את עדשת האובייקט והכנס את העדשה הראשונה של הטלסקופ, L3. התאם את המיקום והזווית של עדשה זו כדי להבטיח קולימציה ואי סטייה כמתואר קודם לכן.לאחר הרכבת שבב ה-SLM בהתאם לפרוטוקול הטקסט, כשהעדשות מיושרות, הכנס את ה-SLM במקום המראה. התאם את מיקום ה-SLM כך שקרן הייחוס ממוקמת במרכז שבב ה-SLM, והתאם את הזווית כך שהקרן תעבור דרך שתי עדשות הממסר. לאחר מכן בדוק שקרן הייחוס עדיין מרוכזת בנקודה המסומנת.התקן את המעכב המשתנה של הגביש הנוזלי, או LCVR, עם הציר המהיר שלו ב-45 מעלות לקיטוב האירוע. לאחר מכן, לאחר השלמת היישור של מסובב הקיטוב על פי פרוטוקול הטקסט, תוך שימוש באור המועבר דרך העיניים, התמקד ברשתית וקבע את עדשת האובייקט במיקום זה. לאחר מכן הכינו שכבה חד-שכבתית של חרוזי פלורסנט על ידי פיזור טיפה של 100 ננומטר חרוזים צבעוניים על זכוכית כיסוי מספר 1.5.השאירו את החרוזים לייבוש כדי לספוג את החרוזים לכוס לפני הטבילה מחדש במים. בעזרת שמן טבילה, הנח את דגימת החרוזים על המטרה. כוונן בעדינות את מיקום המצלמה כך ששכבת החרוזים הפלואורסצנטיים תהיה בפוקוס.לאחר יצירת דפוסי סורג בינאריים של SIM כקבצי מפת סיביות והעלאתם ל-SLM בהתאם לפרוטוקול הטקסט, טען את תוכנת הבקרה SLM ולחץ על התחבר. בלשונית "רפרטואר", לחץ על "טען"כדי לפתוח את קובץ הרפרטואר, ולבדוק את מספר הפקודות השוטפות הכלולות בקובץ. לחץ על שלח ללוח" כדי להעלות את קובץ הרפרטואר ל-SLM.לאחר מכן, בחר בכרטיסייה סטטוס והזן את מספר ההזמנה הפועלת. לחץ על בחר"כדי לשנות את סדר הריצה לסורג היישור. הכנס מסכה מרחבית, או SM, המותקנת על שלב XY לנתיב האלומה במיקום המוקד של L3, ותרגם את מיקומה ביחס לציר האופטי כך שרק הפקודות הראשונות הרצויות מועברות.מיד לאחר המסנן המרחבי, רק שתי אלומות עגולות ייראו לעין. בדוק את התמונה של שכבת החרוזים הפלואורסצנטיים במצלמה. אם שתי הקורות העגולות אינן חופפות כפי שמתואר כאן, מקם מחדש את מישור הדגימה, תוך התאמה איטרטיבית של עדשת האובייקט ומיקום המצלמה.לאחר כוונון עדין של המיקוד והגדרת מישור הדגימה בהתאם לפרוטוקול הטקסט, אשר את תאורת ה-TIRF על ידי הדמיה, למשלample, תמיסה של 10 צבע רודמין מיקרו-מולרי 6G על ידי הבאת הצבע למיקוד. אם שתי הקרניים מתרחשות בזווית ה-TIRF הנכונה, אז מולקולות בודדות יהיו גלויות ללא רקע גבוה, וקצוות הצמצם העגול יהיו בפוקוס. ניתן לבצע התאמות עדינות למיקום הקורות על ידי התאמת מראה דיכרואית DM3.כדי לסנכרן ולכייל את המערכת, הנח את דגימת החרוז חד-שכבתית על המטרה והבא למיקוד. השתמש בתוכנת הבקרה SLM כדי לתכנת את ה-SLM להציג כל אחת מתמונות השינוי התלת-פאזי בתורה עבור כיוון התבנית הראשון. לאחר מכן עבור לסדר הפעלה רביעי של הרפרטואר לדוגמה.בתוכנת הרכישה, הגדר את המצלמה לתקופת החשיפה הגלובלית על ידי בחירת מאפייני מצלמה מתקדמים "והגדרת Output Trigger Kind 1" לחיובי, ו-Output Trigger Kind 2 "לשלילי. בחלונית הרצף תחת Scan Type, בחר Hard Disk Record והגדר את ספירת הפריימים לשלוש. לאחר מכן לחץ על התחל "כדי לרכוש שלוש מסגרות.דפוס ה-SLM ישתנה עם כל חשיפה. לאחר קריאת המערכת על פי פרוטוקול הטקסט, בתוכנת הבקרה SLM, העבר את סדר ההפעלה של SLM לסדרה המלאה של תשע תמונות סורג בינאריות הנדרשות ל-TIRF-SIM. זהו סדר ריצה אפס ברפרטואר לדוגמה.לאחר רכישת תשע תמונות של דגימת החרוז, בחלונית הרצף של תוכנת המצלמה, בחר Hard Disk Record"כסוג הסריקה, ושנה את ספירת הפריימים לתשע. לאחר מכן לחץ על התחל "כדי לרכוש תמונות. לבסוף, תחת Save Buffered Images, בחר TIFF כסוג התמונה ולחץ על OK. שחזר תמונה ברזולוציה גבוהה בהתאם לפרוטוקול הטקסט.מוצג כאן, חרוזים פלואורסצנטיים צבעוניים בקוטר 100 ננומטר צולמו כדי להשוות TIRF סטנדרטי ל-TIRF-SIM. ל-TIRF-SIM הייתה בבירור רזולוציה רוחבית גבוהה משמעותית בהשוואה ל-TIRF. הרזולוציה המשוערת של המיקרוסקופ היא 90 ננומטר ו-120 ננומטר עבור 488 ו-640 ננומטר TIRF-SIM, בהתאמה.זה מתאים לשיפור של פי שניים ברזולוציה הרוחבית עבור שני אורכי הגל בהשוואה למקרה המוגבל של העקיפה התיאורטית. כפי שניתן לראות כאן, סיבי עמילואיד עם תווית פלואורסצנטית נוצרו במבחנה ושימשו גם כדגימת בדיקה להדגמת רזולוציה כפולה. מבנים תת-תאיים עם ניגודיות גבוהה, כגון מיקרו-צינורות עם תווית emGFP או LifeAct-GFP הם אידיאליים להדמיית TIRF-SIM, ומניבים תמונות בניגודיות גבוהה וברזולוציה סופר.הדמיית TIRF-SIM באמצעות המערך המודגם מאפשרת תצפית על תת-אוכלוסייה של מיקרו-צינורות הממוקמים בקרבת קליפת המוח של תאי הבסיס, וניתן לראות פילמור ודה-פולימריזציה של מיקרו-צינוריות לאורך זמן. דגימות ניגודיות נמוכות ללא מבנים בדידים חסרות מידע ברזולוציה גבוהה למעט בקצוות קרום הפלזמה, ולכן הן לא אופטימליות להדמיית TIRF-SIM. לבסוף, ניגודיות אפנון גבוהה חיונית להדמיית SIM מוצלחת.כפי שמודגם כאן, התמרת פורייה של התמונה המשוחזרת מאפשרת הדמיה של פונקציית ההעברה האופטית של ה-SIM. לאחר השליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך כשבוע, אם נרכשו כל החלקים הדרושים. כאשר מנסים הליך זה, יש להיות מודעים לנושאים הקריטיים ביותר ליישום מוצלח של TIRF-SIM.ראשית, יישור מדויק של הקורות הוא חיוני. זה יכול להיות קשה, מכיוון שהם חייבים להיות ממוקמים בקצוות צמצם העדשה האובייקטיבית. שנית, זה קריטי שמצב הקיטוב של האור יסתובב יחד עם התבנית.בלי זה, ניגודיות הדפוס של המדגם תהיה נמוכה ובניית התמונה לאחר מכן תהיה בלתי אפשרית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב את השלבים החשובים ביותר בבנייה ויישור של מיקרוסקופ TIRF-SIM מבוסס SLM. אל תשכח שעבודה עם לייזרים מסוג 3B עלולה להיות מסוכנת ביותר.יש לשמור על עוצמת הלייזר ברמות בטוחות לעין תוך ביצוע תהליך היישור עם מטרת ה-TIRF במקום.

a-guide-to-structured-illumination-tirf-microscopy-at-high-speed-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

המידור של חלבונים גם בתוך קרום פלזמה או אל מקומות תאיים הוא אחד מנגנון רגולטורי כי יכול מאוד להשפיע על התוצאות איתות, ולכן, כדי להבין איתות חשוב ללמוד את התנהגות במרחב ובזמן של חלבונים המעורבים. המתואר כאן מערכת מבוססת מיקרוסקופיה TIRF ללמוד התמרה האות בתאי T, אבל הוא החלים רחב.

טכניקה מיקרוסקופית TIRF הדמיה בזמן אמת סימולטני של TCR וחלבונים הקשורים אליו לשידור אותות

סרטון וידאו זה מדגים טכניקת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת ברזולוציה גבוהה (TIRF) להדמיה בזמן אמת של היווצרות וסגירת פאגוזומים במהלך פגוציטוזה בתיווך מקרופאגים של תאי דם אדומים מסוג IgG (RBCs) המחוברים לפני השטח של צלחת תחתית זכוכית. המקרופאגים מרחיבים את הפסאודופודיה סביב ה-RBCs ובולעים אותם בתוך הפאגוזומים, ומנתקים אותם מפני השטח של הזכוכית.

הדמיה מבוססת מיקרוסקופיה TIRF של היווצרות וסגירת פגוזום

אנו מדגימים את השימוש במיקרוסקופ לוקליזציה של הפעלת פוטו פלואורסצנטי (FPALM) כדי לדמות בו זמנית סוגים מרובים של מולקולות המסומנות באופן פלואורסצנטי בתוך התאים. הטכניקות המתוארות מניבות לוקליזציה של אלפי עד מאות אלפי חלבונים בודדים המסומנים בסימון פלואורסצנטי, עם דיוק של עשרות ננומטרים בתוך תאים בודדים.

הדמיה סימולטנית רב-צבעונית של מבנים ביולוגיים עם מיקרוסקופ לוקליזציה של פוטו-אקטיבציה פלואורסצנטית

הכנת שכבות דו-שכבתיות של שומנים מישוריים הנתמכים בזכוכית מתפקדת בחלבון, קביעת ניידות החלבון בפנים ומדידת צפיפות החלבון מוצגת כאן. מתוארת מפת דרכים לבניית מיקרוסקופ השתקפות פנימית כוללת מופחת רעש, המאפשרת הדמיה של פלואורוכרומים דו-שכבתיים בודדים ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה.

המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי במישורים נתמך bilayers

כדי לחקור מהירויות זרימה וכיווניות של אקטין חוטי בסינפסה האימונולוגית של תאי T, הדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים חיים משולבת עם פלואורסצנציה של השתקפות פנימית כוללת ומכומתת עם ספקטרוסקופיה של מתאם תמונה מרחבית-זמנית.

קליפת המוח אקטין זרימה בתאי T לכמת ידי מתאם תמונת ספקטרוסקופיה מרחב ובזמן של תאורה מיקרוסקופית נתונים מובנים

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לתת את התנאים ניסיוני אופטימלית של הכנת הדוגמא ייבוא תמונות ושיחזור על מנת לבצע צבע כפול 2D תמונות dSTORM של microtubules חוטים ביניים בתאים...

הדמיה חוטים ביניים Microtubules עם מיקרוסקופ 2-ממדי ישירה שחזור אופטי סטוכסטי

כאן, אנו מציגים עבור צבע רב לוקליזציה של חלבוני ממברנה בודדת פרוטוקול organelles של תאים חיים. כדי לצרף fluorophores, משמשים החלבונים תיוג עצמי. חלבונים, במיקום שונה ממברנות תאי האברון המשמש אותו, יכול להיות מקומי עם דיוק של ~ 18 ננומטר.

צבע רב לוקליזציה מיקרוסקופיה של חלבוני ממברנה בודדת ב- Organelles של תאים בתרבית של חיים

כאן אנו מציגים מדריך מעשי של בניית מערכת משולבת מיקרוסקופ, אשר ממזג הדמיה epi-פלורסנט קונבנציונלי הדמיה המבוססת על זיהוי סופר-ברזולוציה מולקולה בודדת, גילוי מולקולה בודדת צבע רב, כולל מולקולה בודדת פלורסצנטיות תהודה העברת האנרגיה הדמיה, לתוך הגדרת אחד באופן יעיל.

ניצוח מספר מצבי הדמיה עם מיקרוסקופ זריחה אחת

הדמיה של קרום פלזמה מבודדים הן, אמצעי האחסון תאיים שמסביב, המיקרוסקופ המשוכלל כי היתר ברזולוציה גבוהה ומהירה יוצגו. השילוב של ספינינג דיסק וסיכום השתקפות פנימית פלורסצנטיות מיקרוסקופ בהגדרת אחד מאפשר ניסויים הדמיה חיה במחירים רכישה גבוהה עד 3.5 לשנייה בכל אוסף תמונות.

להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום

מיקרוסקופ אופטי ברזולוציה גבוהה מבוססי שבב הוא גישה מקורית למיקרוסקופיה פלואורסצנטית ומציעה יתרונות ביעילות ובתפוקה. כאן, הפרוטוקולים להכנת השבבים וההדמיה מוצגים עבור מיקרוסקופ TIRF ומיקרוסקופ ברזולוציה סופר מבוססי-לוקליזציה.

כולל תפוקה גבוהה של השתקפות פנימית ומיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי אופטיים באמצעות שבב פוטוני

אנו מציגים פרוטוקול ליישום מיקרוסקופיה של השתקפות הפרעות ומיקרוסקופיה כוללת-פנימית-השתקפות-פלואורסצנטית להדמיה בו-זמנית של מיקרו-טובולים דינמיים וחלבונים הקשורים למיקרו-טובולים המסומנים באופן פלואורסצנטי.

השתקפות הפרעה סימולטנית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת להדמיה מיקרוטובולים דינמיים וחלבונים נלווים

למדו לבנות וליישר מיקרוסקופ TIRF-SIM לדימות תאים חיים ברזולוציית-על במהירות גבוהה ובצבעים מרובים. שיטה זו מאפשרת מחקר תהליכים דינמיים בביולוגיית התא.

A Guide to מיקרוסקופית TIRF תאורה מובנית ב- High Speed ​​עם צבעים מרובים

גלה סרטונים נוספים

A Guide to מיקרוסקופית TIRF תאורה מובנית ב- High Speed עם צבעים מרובים