הכנת ג'לי 3D קולגן microchannels לחקר אינטראקציות 3D In vivo

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור מטריצות קולגן תלת מימדיות מיושרות ואקראיות, לצורך התבוננות בנדידת תאים או תהליכים תאיים אחרים בהקשר של סביבה תלת מימדית. שיטה זו נועדה ללכוד תכונות קולגן שאנו מוצאים ברקמות אמיתיות, מה שיכול לעזור לענות על שאלות מפתח כמו המנגנונים שבהם התאים משתמשים כדי לזהות מטריצה חוץ-תאית מיושרת או אקראית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאתה יכול לתפעל את הארגון של הסביבה התלת מימדית, תאי תמונה בפנים ואתה יכול לעשות זאת בצורה חסכונית עם ציוד זמין בדרך כלל.

באופן כללי, אנשים חדשים בשיטה הזו יתקשו כי הם לא מערבבים מספיק טוב את תמיסת הקולגן ואת חוצץ הנטרול, והם שואבים את הקולגן דרך התעלות בצורה לא עקבית. מי שידגים את ההליך הזה יהיה בריאן בורקל, שהוא מדען בכיר במעבדה שלי. כדי להתחיל, ערבבו היטב את חוצץ הקולגן וה-HEPES לפני הוספת תאים ומדיה כדי להבטיח נטרול תקין של הקולגן.

לאחר מכן, הוסיפו את התאים והמדיה לתערובת הקולגן המנוטרלת והניחו אותה על קרח כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. פיפטו את התערובת הקרה כקרח למשטח סטרילי שאינו מטופל בתרבית רקמות כדי למזער את ההתקשרות והצמיחה של תאים מחוץ לג'ל הקולגן. השתמש בפיפטה כדי לפזר את התמיסה באופן שווה.

הניחו לג'ל להתפלמר בטמפרטורת החדר למשך כ-10 עד 15 דקות. לאחר מכן, מכסים את הג'לים ומעבירים אותם לחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 עד 60 דקות נוספות לסיום הפילמור. עם הפילמור, הג'ל יהפוך אטום.

לאחר הפילמור, הוסף שניים עד שלושה מיליליטר מדיה. לאחר מכן, שחררו את הג'לים מדפנות הבאר על ידי הפעלת פיפטה של 200 סביב היקף הבאר. סובבו את המנה בעדינות כדי לשחרר את הג'ל מהמשטח התחתון.

על מנת ליצור מיקרו-ערוצי PDMS ליישור מטריצות קולגן. ראשית הכינו מאסטר סיליקון SuA, תוך שימוש בטכניקות ליתוגרפיה רכות סטנדרטיות המתוארות במקום אחר. לאחר מכן, השתמשו במקל מלאכה כדי לערבב היטב 20 גרם של בסיס אלסטומר עם 2 גרם של חומר ריפוי בכוס חד פעמית.

לאחר ערבוב טוב, הסירו את תערובת ה-PDMS על ידי הנחת הכוס החד פעמית בתא ואקום בלחץ ואקום של 550 מילימטר כספית. הסר את התערובת למשך כשעה עד שעה וחצי. בזמן הסרת הגז של ה-PDMS, הכן את מאסטר הסיליקון על ידי הנחת גיליון נקי של סרט שקיפות על פלטה חמה ואחריו מאסטר הסיליקון.

ודא שתבנית תעלת המיקרו פונה כלפי מעלה. לאחר שעה עד שעה וחצי, הסר את ה- PDMS הנטול גז מתא הוואקום. שפכו לאט את ה-PDMS למרכז המאסטר ואפשרו לכוח המשיכה לפזר אותו באופן שווה.

לאחר מכן, גלגלו בזהירות גיליון שני של סרט שקיפות על גבי מאסטר הסיליקון וה-PDMS כדי למנוע בועות אוויר. הניחו בעדינות יריעת גומי על גבי השקף, ואחריה יריעת אקריליק בגודל 1/8 אינץ', ולאחר מכן, הוסיפו את הראשונה מבין שלוש משקולות של עשרה קילו על גבי יריעת האקריליק. בתחילה, המשקל הראשון יצוף, יאפשר לו להתיישב ולהתייצב לפני שתמשיך עם שתי לוחות המשקל הנותרים.

כשמוכנים להמשיך, כוונו פלטה חמה ל-70 מעלות צלזיוס ורפא את ה-PDMS למשך ארבע שעות. לאחר הריפוי, הניחו ל-PDMS להתקרר למשך שעה נוספת לפחות ולאחר מכן, קלפו בזהירות את סרט השקיפות העליון עבור הוופל. לבסוף, הסר את התעלות בעזרת המלקחיים.

הניחו את התעלות הפוכות על סרט שקיפות נקי חדש ונקו את כל היציאות בתנועה מעגלית עם מלקחיים חדים. הסר את כל שברי ה-PDMS שמשתחררים. לאחר מכן, הניחו חתיכת סרט אריזה על הספסל, הצד הדביק כלפי מעלה והניחו את ערוץ ה-PDMS עם הצד כלפי מטה על גבי הסרט.

לחץ כלפי מטה על הערוצים עם הקצה העגול של זוג מלקחיים כדי להבטיח מגע טוב. הסר את התעלות וחזור על תהליך זה משני הצדדים עד להסרת כל הפסולת הנראית לעין. לאחר מכן, העבירו את תעלות ה-PDMS הנקיות והמוכנות לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר מלא באתנול 70%.

מערבל את התעלות במהירות מרבית למשך 30 שניות, ואז החלף את התמיסה באתנול טרי של 70%. בעזרת טכניקות אספטיות, העבירו את תעלת ה-PDMS כלפי מעלה, לכלי נקי וסטרילי. לאחר מכן, UV מטפל בתעלות עד שהאתנול מתאדה.

לאחר הייבוש, הפוך את התעלות על החלקת כיסוי או צלחת תחתית זכוכית ולחץ אותן כלפי מטה על הזכוכית כדי ליצור אטימה טובה. הוסף טלאי של PDMS סטרילי כדי לכסות ולסגור את החלק המרכזי של התעלות ולאפשר להתקנה להתייבש היטב לפני שתמשיך. לאחר מכן, הניחו טיפה של 100 מיקרוליטר של תמיסת קולגן של 10 מיקרו גרם למיליליטר על גבי תעלה ומשכו אותה דרך התעלה באמצעות ואקום.

דגרו את התעלות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה ואז העבירו את התעלות, שעדיין מלאות בתמיסת ציפוי קולגן, למקרר. מצננים את הסט למשך כ-15 עד 30 דקות ולאחר מכן משתמשים בשואב או פיפטה כדי להסיר את תמיסת ציפוי הקולגן מהתעלות. התחל בנטרול תמיסת הקולגן, דילול שלה במדיה תאית ודגירה על קרח למשך 15 דקות.

לאחר מכן, הנח 120 עד 150 מיקרוליטר מתמיסת הקולגן ליציאה A של תעלה מקוררת מראש. לאחר מכן, חבר פיפטה של 25 מיליליטר לקו ואקום והנח אותה מעל יציאה C. השתמש בה כדי למשוך פנימה את התערובת בתנועה אחידה אחת, ועצור ברגע שהקולגן מגיע לקצה. הצעד החשוב ביותר ליצירת מטריצות אקראיות הוא למשוך לאט את הקולגן דרך התעלה.

אם הוא נמשך מהר מדי, זה יגרום ליישור מוגבר בחלק הערוץ או בכל הערוץ. הסר בזהירות כל תמיסה עודפת מאזורי היציאה ולאחר מכן הנח מדבקות PDMS סטריליות על שתי היציאות, A ו-C. לאחר שתיים-שלוש דקות, הסר את מדבקת ה-PDMS המרכזית המכסה את יציאה B והוסף שניים עד שלושה מיקרו-ליטרים של תאים בריכוז של מיליון עד שלושה מיליון תאים למיליליטר ליציאה המרכזית. אפשר לזמן הג'ל להתפלמר חלקית בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 15 דקות נוספות ולאחר מכן העביר את הקונסטרנט לחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 עד 30 דקות נוספות.

לאחר הפילמור, הסר את כיסויי יציאות ה-PDMS והוסף מדיה כדי לכסות את הערוץ לחלוטין. כאן 50,000 ארבעה תאי T 1 הוטמעו בג'ל קולגן של 2 מ"ג/מ"ל או 3.5 מ"ג/מ"ל למשך 5 ימים. קו אחד של ארבעת תאי T הוא קו סרטן Med Aesthetic מתכווץ מאוד, אך הוא מסוגל לכווץ את הג'ל בצפיפות גבוהה רק בכ-10% ג'לים בצפיפות נמוכה הניתנים להתאמה מתכווצים ב-57% באותה מסגרת זמן.

מידת יישור הקולגן מווסתת על ידי קצב זרימת הקולגן, כך שקצב זרימת קולגן גבוה יותר מניב יישור טוב יותר. השימוש בתעלות צרות יותר יחד עם לחצי ואקום גבוהים יותר משפר את יישור רשת הקולגן, בעוד שתעלה רחבה יותר המשמשת בשילוב עם לחצי ואקום נמוכים מייצרת מטריצות אקראיות. לאחר השליטה, ניתן לבצע מזיגת ג'ל או תעלות קולגן תוך שעתיים וחצי אם מבוצעים כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להגדיר את הרכיבים לפני ההתחלה. ברגע שתתחיל לעבוד עם הקולגן, אתה צריך לעבוד במהירות. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה התלת-ממדית של התא, לחקור הידבקות תאים, נדידה ופלישה לסביבות חוץ-תאיות תלת מימדיות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לשפוך ג'ל קולגן בצפיפות משתנה וכיצד לייצר, מטריצות קולגן אקראיות ומיושרות.