Name: פיתוח מודל כבד אתנול-induced fibrotic דג הזברה ללמוד ובתאים בתיווך תא התחדשות Hepatocyte (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: למדו ליצור מודל כבד פיברוטי מושרה אתנול ב-Danio rerio לחקר מנגנוני התחדשות תאי כבד. שיטה זו מאפשרת סקרינג כימי יעיל וחיסכוני לזיהוי תרופות פוטנציאליות לטיפול במחלות כבד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות של GTEC (2731336 ו 1411318), ה- NIH (K01DK081351), ואת NSF (1,354,837) כדי CHS אנו מודים Alem גיורגיס לקריאה ביקורתית של כתב היד.

<ol><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration.</a> J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).</li>
<li>Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+and+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Stem cells and liver regeneration.</a> Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).</li>
<li>Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epidemiology+of+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Global epidemiology of hepatitis C virus infection.</a> Lancet Infect Dis. 5 (9), 558-567 (2005).</li>
<li>Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of liver fibrosis.</a> Annu Rev Pathol. 6, 425-456 (2011).</li>
<li>Bataller, R., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Liver fibrosis.</a> J Clin Invest. 115 (2), 209-218 (2005).</li>
<li>Kisseleva, T., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-fibrogenic+strategies+and+the+regression+of+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Pract+Res+Clin+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Anti-fibrogenic strategies and the regression of fibrosis.</a> Best Pract Res Clin Gastroenterol. 25 (2), 305-317 (2011).</li>
<li>Constandinou, C., Henderson, N., Iredale, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+liver+fibrosis+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Modeling liver fibrosis in rodents.</a> Methods Mol Med. 117, 237-250 (2005).</li>
<li>Gabele, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+interactive+effects+of+alcohol+and+high-fat+diet+on+hepatic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">A new model of interactive effects of alcohol and high-fat diet on hepatic fibrosis.</a> Alcohol Clin Exp Res. 35 (7), 1361-1367 (2011).</li>
<li>Lieber, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcoholic+fatty+liver%3A+its+pathogenesis+and+mechanism+of+progression+to+inflammation+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Alcoholic fatty liver: its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis.</a> Alcohol. 34 (1), 9-19 (2004).</li>
<li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).</li>
<li>Jang, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+profiling+of+an+alcoholic+fatty+liver+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Metabolic profiling of an alcoholic fatty liver in zebrafish (Danio rerio).</a> Mol Biosyst. 8 (7), 2001-2009 (2012).</li>
<li>Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+steatosis+in+response+to+acute+alcohol+exposure+in+zebrafish+requires+sterol+regulatory+element+binding+protein+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation.</a> Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).</li>
<li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+helix-loop-helix+transcription+factor%2C+heart+and+neural+crest+derivatives+expressed+transcript+2%2C+marks+hepatic+stellate+cells+in+zebrafish%3A+analysis+of+stellate+cell+entry+into+the+developing+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).</li>
<li>Lin, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+animal+model+for+alcoholic+liver+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Development of an animal model for alcoholic liver disease in zebrafish.</a> Zebrafish. 12 (4), 271-280 (2015).</li>
<li>Huang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+interaction+between+Wnt+and+Notch+activity+modulates+the+regenerative+capacity+of+a+zebrafish+fibrotic+liver+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model.</a> Hepatology. 60 (5), 1753-1766 (2014).</li>
<li>Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroreductase-mediated+cell%2Ftissue+ablation+in+zebrafish%3A+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).</li>
<li>Parsons, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-responsive+cells+initiate+the+secondary+transition+in+larval+zebrafish+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Notch-responsive cells initiate the secondary transition in larval zebrafish pancreas.</a> Mech Dev. 126 (10), 898-912 (2009).</li>
<li>Baker, K., Warren, K. S., Yellen, G., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+%27pacemaker%27+current+%28Ih%29+in+a+zebrafish+mutant+with+a+slow+heart+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Defective 'pacemaker' current (Ih) in a zebrafish mutant with a slow heart rate.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4554-4559 (1997).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196(2012).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (37), (2010).</li>
<li>Paku, S., Schnur, J., Nagy, P., Thorgeirsson, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+structural+evolution+of+the+early+proliferating+oval+cells+in+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver.</a> Am J Pathol. 158 (4), 1313-1323 (2001).</li>
<li>Turner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+stem+cell+and+maturational+liver+lineage+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology.</a> Hepatology. 53 (3), 1035-1045 (2011).</li>
<li>Kodama, Y., Hijikata, M., Kageyama, R., Shimotohno, K., Chiba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+notch+signaling+in+the+development+of+intrahepatic+bile+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The role of notch signaling in the development of intrahepatic bile ducts.</a> Gastroenterology. 127 (6), 1775-1786 (2004).</li>
<li>Ryback, R., Percarpio, B., Vitale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibration+and+metabolism+of+ethanol+in+the+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Equilibration and metabolism of ethanol in the goldfish.</a> Nature. 222 (5198), 1068-1070 (1969).</li>
<li>Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+zebrafish+chemical+screening+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Advances in zebrafish chemical screening technologies.</a> Future Med Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).</li>
<li>Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((zebraflash+transgenic+lines+for+in+vivo+bioluminescence+imaging+of+stem+cells+and+regeneration+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish.</a> Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).</li>
<li>Westhoff, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+automated+imaging+pipeline+for+the+analysis+of+the+zebrafish+larval+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of an automated imaging pipeline for the analysis of the zebrafish larval kidney.</a> PLoS One. 8 (12), e82137(2013).</li>
<li>Perlman, Z. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+drug+profiling+by+automated+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multidimensional drug profiling by automated microscopy.</a> Science. 306 (5699), 1194-1198 (2004).</li>
<li>Chu, J., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+school+in+liver+development%3A+lessons+from+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">New school in liver development: lessons from zebrafish.</a> Hepatology. 50 (5), 1656-1663 (2009).</li>
<li>Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+conversion+of+hepatic+biliary+epithelial+cells+to+hepatocytes+after+near+total+loss+of+hepatocytes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish.</a> Gastroenterology. 146 (3), 776-788 (2014).</li>
<li>He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+liver+after+extreme+hepatocyte+loss+occurs+mainly+via+biliary+transdifferentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish.</a> Gastroenterology. 146 (3), 789-800 (2014).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+structure%2C+enzyme+histochemistry%2C+and+immunohistochemistry+of+liver+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Fine structure, enzyme histochemistry, and immunohistochemistry of liver in zebrafish.</a> Anat Rec (Hoboken). 295 (4), 567-576 (2012).</li>
<li>Yovchev, M. I., Xue, Y., Shafritz, D. A., Locker, J., Oertel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repopulation+of+the+fibrotic%2Fcirrhotic+rat+liver+by+transplanted+hepatic+stem%2Fprogenitor+cells+and+mature+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Repopulation of the fibrotic/cirrhotic rat liver by transplanted hepatic stem/progenitor cells and mature hepatocytes.</a> Hepatology. 59 (1), 284-295 (2014).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

צפינו התחדשות hepatocyte בתיווך HPC ב EtOH / MTZ שטופלו כבדי מחלים, דבר המצביע על כך אפילו בנוכחות של כמות משמעותית של חלבונים ECM כולל סוג סיבי לי קולגן, HPCs לשמור וכשירותו להתחדש כמו hepatocytes. הטיפול בלבד MTZ לא להגדיל בתצהיר של חלבוני ECM משמעותי, ואילו הטיפול רק EtOH לא לגרום HPC הפעלת 15. על ידי ניצול של טיפול EtOH / MTZ בשילוב, הצלחנו לחקור התחדשות HPC מונחה בכבד fibrotic. כמו חיסול כמעט מוחלט של hepatocyte מעורר התחדשות hepatocyte מונחה HPC, חשוב לברר זחלי MT...

למרות יכולת ההתחדשות המרשימה של hepatocytes 1, שהם סוג תא parenchymal העיקרי של הכבד, אי ספיקת כבד כרונית פוגעת ביכולת הזאת, מה שמובילה תאים ובתאים בכבדים (HPC) התחדשות תלויה 2. נזק כבד כרונית נגזרת בעיקר שימוש לרעה באלכוהול, וירוס הפטיטיס C כרונית (HCV) 3 ו מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD) 4. זה מוביל פיברוזיס כבד מתמשך, אשר מזוהה עם ההצטברות של תאי מטריקס חלבונים (ECM). מתמיד הצטברות ECM מעווה אדריכלות כבדה ללא פגעה על ידי יצירת רקמת צלקתית סיבית 5, לאחר מכן וכתוצאה מכך שחם עם תחלואה ותמותה גבוהות. ניסיונות רבים נעשו כדי למתן את התגובה fibrotic בעיקר על ידי התמקדות מעכב ציטוקינים profibrogenic והופעל myofibroblasts 6. האחרון נגזר בעיקר מתאי stellate כבדים (Hגיל), התאים הלא parenchymal הכבד עקרון אחראי צלקת בכבד היווצרות 4. אף על פי כן, טיפולי משובי מעודדי מקורות הסלולר אנדוגני כולל HPCs להתחדש hepatocytes בנוכחות עלבונות fibrogenic מתמשכים מחכים לחקירה נוספת. דגמים ניסיוניים רבים סיסטיק הכבד תוארו ביונקים. הזרקה חוזרת ונשנית של פחמן טטרא (CCL 4) כבר בשימוש נרחב כדי לגרום פיברוזיס כבד מודלים בעכברים וחולדה 7. בשילוב עם תזונה עתירת שומן (HF), אלכוהול הובילה upregulation משמעותית של ביטוי גנים profibrogenic ואת הכבד סיסטיק 8. בעוד steatosis (הצטברות שומנים בדם) הנובעת מחשיפת אלכוהול חריפה, זה הופך את הכבד רגיש פציעה בכבד חמורה יותר 9. דג הזברה, Danio rerio, התפתחה כמערכת מודל חוליות יסולא בפז ללימוד התחדשות. למרותחוליות אחרות תחתונות כגון סלמנדרות ויש axolotls יכולת מרשימה לרגנרציה הדג הזברה יש יתרונות על פני מערכות מודל אחרות לגבי אסטרטגיות מניפולציה וויזואליזציה גנים הדרושים לביצוע מניפולצית משובי פוטנציאל גורמי 10. דג הזברה גם מייצג מודל חוליות אטרקטיבי ללימוד מחלת כבד אלכוהולית (ALD) פשוט על ידי הוספת אתנול (EtOH) למים שלהם. חשיפה אקוטית EtOH כדי דג הזברה הזחל והבוגר שנגרם steatosis בכבד 11-13. כאשר דג זברה מבוגר זכתה לחשיפת EtOH מורחבת, בתצהיר קולגן נצפה עם גברת ביטוי של גנים הקשורים סיסטיק 14. עם זאת, קיים צורך בפיתוח מודלים ללמוד התחדשות כבדה בתגובת EtOH כגירוי fibrogenic. לאחרונה, פיתחנו מודל הכבד fibrotic הנגרמת EtOH דג הזברה 15. שילבנו מערכת אבלציה הגנטי הספציפי hepatocyte עם טיפול EtOH ב הזחל adulדג הזברה t. יצרנו שני קווים מהונדסים, Tg (fabp10a: CFP-NTR) Gt1 ו Tg (fabp10a: mCherry-NTR) GT2, שבו nitroreductase E.coli (NTR) הם התמזגו ציאן חלבון פלואורסצנטי mCherry, בהתאמה, בשליטה של חומצת השומן ספציפי hepatocyte מחייבת 10a חלבון, אמרגן בסיסי כבד (fabp10a). במערכת זו, NTR ממירה metronidazole prodrug רעילה (MTZ) לתוך סוכן ה- DNA בין-גדיל מקשרים צולב 16, גרימת מוות מפורש של hepatocytes. באמצעות מודל זה, הראינו כי אוכלוסייה של תאים כבדים, אשר מגיבים Notch signaling, מומר hepatocytes בהעדר ליד של hepatocytes וב העודף ECM. אנחנו המיועד תאים אלה HPCs. יתר על כן, באמצעות מסכים כימיים, זיהינו activators מולקולה הקטן של איתות Wnt ומעכבים של איתות Notch שמרחיב התחדשות hepatocyte בכבד fibrotic. Therefoמחדש, המודל הכבד fibrotic שלנו דג הזברה מייצג מערכת סינון הכימי מעולה בהשוואה לתא ביותר בתרבות או מערכת סינון מבוסס יונקים. זוהי מערכה in vivo עם עלות משמעותית והטבות לחיסכון בזמן. כאן אנו מתארים את ההליכים המפורטים להקמת מודל כבד fibrotic נגרם EtOH ועל ביצוע מסכים כימיים באמצעות מודל זה דג זברה. יתר על כן, ניתוחי מנות הזמן בוצעו כדי לחקור כיצד hepatocyte התחדשות מתרחש בכבד fibrotic. פרוטוקול זה יספק כלי רב ערך כדי לחקור את המנגנונים ואסטרטגיות של שיפור התחדשות hepatocyte בכבד fibrotic.

<table><tbody><tr><td>סידן גופרתי המיהידראט (CaSO4)</td><td>Acros</td><td>AC385355000</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי (MgSO4)</td><td>EMD</td><td>MX0075</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>אתילן גליקול-ביס(2-אמינואתילאתר)- N,N,N&prime;,N&prime;,N&prime; -חומצה טטראצטית (EGTA)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E7023</td><td>200 הוכחה</td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>F79-500</td><td></td></tr><tr><td>מטרונידזול (MTZ)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M3761</td><td></td></tr><tr><td>1-פניל-2-תיאוריאה (PTU)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>3-אמינו חומצה בנזואית אתיל אסטר (טריקאין)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>טבלית מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS)</td><td>Amresco</td><td>E404</td><td>ממיסים טבליה אחת עם 100 מ"ל מים מזוקקים</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>נמס נמוך אגרוז&nbsp;</td>ספריית תרכובות איתות תאי גזע <td>Amresco</td><td>BP165</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Selleck Chemicals</td><td>L2100</td><td>10&nbsp; מלאי mM בספריית DMSO</td></tr><tr><td>ActiProbe-1K</td><td>Timtec</td><td>ActiProbe-1K</td><td>10&nbsp; מלאי mM ב-DMSO</td></tr><tr><td>SB</td><td>415286-Selleck Chemicals</td><td>S2729</td><td>מתמוסס עם DMSO ל-10&nbsp; mM</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2924</td><td>מתמוססים עם DMSO ל-10&nbsp; mM</td></tr><tr><td>Anti-Collagen I נוגדן</td><td>Abcam</td><td>ab23730</td><td>השתמש ב-1:100 לצביעה חיסונית, מגיב עם דגים</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 חמור נגד ארנב IgG (H+L)</td> <td>בדיקות מולקולריות</td><td>A31573</td><td>השתמש ב-1:200 לצביעה חיסונית</td></tr><tr><td>מדיה הרכבה (Vectorshield)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 100 מ"מ</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>24-well צלחת</td><td>VWR</td><td>10062-896</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11255-20</td><td>Dumont #55</td></tr><tr><td>שקופית זכוכית</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>75x25 מ"מ</td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית</td><td>VWR</td><td>48366-045</td><td>18 מ"מ</td></tr><tr><td>עטיפת פלסטיק</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22305654</td><td></td></tr><tr><td>רדיד אלומיניום</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>1213100</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Vibrotome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אפיפלואורסנטי</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקול</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr></tbody></table>

פיתוח מודל כבד אתנול-induced fibrotic דג הזברה ללמוד ובתאים בתיווך תא התחדשות hepatocyte

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

פיברוזיס מתמשך בכבד עם המשך הצטברות חלבון מטריצה חוץ-תאית (ECM) גורם לאובדן היכולת התאית של הכבד, מה שמוביל לשחמת עם תפקוד לקוי של הכבד. בין עלבונות רבים בכבד, שימוש לרעה באלכוהול יכול להוביל לבעיות בריאותיות משמעותיות כולל אי ספיקת כבד וקרצינומה של הכבד. עם זאת, זהותם של מקורות תאיים אנדוגניים המחדשים הפטוציטים בתגובה לאלכוהול לא נחקרה כראוי. יתר על כן, מעט מחקרים דגמו ביעילות את התחדשות הפטוציטים על פגיעה הנגרמת על ידי אלכוהול. לאחרונה דיווחנו על הקמת מודל כבד פיברוטי המושרה על ידי אתנול (EtOH) בדגי זברה שבו תאי אב בכבד (HPCs) הולידו הפטוציטים לאחר אובדן הפטוציטים כמעט מוחלט בנוכחות גירוי פיברוגני. יתר על כן, באמצעות מסכים כימיים באמצעות מודל זה, זיהינו מספר מולקולות קטנות המשפרות את התחדשות הפטוציטים. כאן אנו מתארים בפירוט את ההליכים לפיתוח מודל כבד פיברוטי המושרה על ידי EtOH ולביצוע מסננים כימיים באמצעות מודל זה בדגי זברה. פרוטוקול זה יהווה כלי קריטי לתיאור המנגנונים המולקולריים והתאיים של האופן שבו הפטוציטים מתחדשים בכבד הפיברוטי. יתר על כן, שיטות אלו יקלו על גילוי פוטנציאלי של אסטרטגיות טיפוליות חדשות למחלת כבד כרונית in vivo.

איור 1 מציג את התפתחות מודל הכבד fibrotic הנגרמת EtOH דג הזברה הזחל. כדי לייעל את פרוטוקול על חשיפת זחלי דג זברת EtOH, אנו מעריכים הראשון רעיל EtOH. 2.5 ימים שלאחר ההפריה (DPF) הזחלים נחשפו ריכוז 1% EtOH, 1.5%, או 2% למשך 24 שעות ואחריו טיפול EtOH במקביל 24 שעות / MTZ. חשיפת 2% EtOH נגרמת תמותה גבוהה, בעוד שכמעט כל זחלים חשופים 1% EtOH או פחות הראו שינויי fibrogenic מינימאליים עם בתצהיר נדיר של חלבונים תאים מטריקס כמו קולגן. בהתבסס...

פיברוזיס מתמשך עם שקיעה של חלבוני מטריצה חוץ-תאיים מוגזמים מוביל לשחמת. שימוש לרעה באלכוהול הוא אחד הגורמים העיקריים למחלת כבד קשה. הקמנו מודל כבד פיברוטי המושרה על ידי אתנול כדי לחקור את המנגנונים והאסטרטגיות לקידום התחדשות הפטוציטים בעת פציעה הנגרמת על ידי אלכוהול.

פיתוח מודל כבד אתנול-induced fibrotic דג הזברה ללמוד ובתאים בתיווך תא התחדשות Hepatocyte

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לבסס מודל של כבד פיברוטי המושרה על ידי אתנול בדגי זברה, ולבצע סריקות כימיות באמצעות מודל זה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום התחדשות הכבד, כגון המנגנונים המולקולריים והתאיים של אופן התחדשות ההפטוציטים בכבד פיברוטי.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא יעילה מבחינה כלכלית וחוסכת זמן בסריקה כימית ב-vevo. יתרה מכך, ניתן לבצע ניתוח מפורט של מהלך הזמן באמצעות ויזואליזציה של תא בודד. את הפרוצדורה ידגימו Mianbo Huang, פוסט-דוקטורנט, ו-Jin Xu, סטודנט לתואר מתקדם מהמעבדה.לאחר הכנת הרכיבים לפי הפרוטוקול הכתוב, הגדירו מיכלי הזווג עם מחיצות באמצעות דגי זברה בוגרים טרנסגניים המכילים fatty acid binding protein 10a:CFP-NTR עם Tp1:mCherry ודגי Zebrafish מסוג Tg(hand2:EGFP). למחרת בבוקר, שעתיים לאחר הסרת המחיצות, אספו את העובריים על ידי סינון מי המערכת והעברת העובריים לצלחוני פטרי בקוטר 100 מילימטר המכילים מצע גידול לעוברים. ב-56 שעות לאחר ההפריה, או HPF, הוסיפו 1.5 אחוז ethanol לעוברים.השתמשו בניילון נצמד כדי לכסות את הפלטות על מנת למנוע אידוי של אתנול. לאחר מכן, דגרו בטמפרטורה של 28 °C למשך 24 שעות. הכינו תמיסת MTZ טרייה בריכוז 15 mM ומצע לעוברים עם 0.1% DMSO, והוסיפו אתנול עד לריכוז סופי של 1.5%.לאחר מכן, ב-80 HPF, טפלו בעוברי המיון ב-20 milliliters של תמיסת ethanol MTZ לכל צלחת פטרי. השתמשו בניילון נצמד כדי לכסות את הצלחות למניעת התאיידות של ה-ethanol וכסו בנייר אלומיניום להגנה מאור. לאחר מכן, הדגרימו בטמפרטורה של 28 degrees Celsius למשך 24 שעות.ביום למחרת, בחן את העוברים תחת מיקרוסקופ אפי-פלוורסצנטי באמצעות מסנן CFP והגדלה של 80x כדי למיין את הלרוות עם אבלציה כמעט מלאה של ההפטוציטים. לביצוע סריקות כימיות, הוצא מהמקפיא בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס את פלטות ה-96 באריות המכילות תסמיכי כימיקלים בריכוז עשרה מילימולר ב-DMSO. השתמש בנייר אלומיניום כדי לכסות את הפלטות למניעת פירוק פוטוקטלי של הכימיקלים, והפשר אותן באמצעות ניעור עדין בטמפרטורת החדר.במבחנות של 1.5 מיליליטר, הכין תמיסות כימיות על ידי דילול של חמישה מיקרוליטר של תמיסות מלאי בריכוז של עשרה מילימולר במיליליטר אחד של מצע עוברים, עד לריכוז סופי של 50 מיקרומולר. לאחר מכן, העבר חמש זחלים לכל באר עם השמדה כמעט מלאה של ההפטוציטים לצלחות 24 בארות הממולאות במצע עוברים. לאחר מכן, הסר את מצע העוברים והוסף 500 מיקרוליטר של התמיסות הכימיות לכל באר.כסו את הפלטות בנייר אלומיניום והדגירו את הזחלים בטמפרטורה של 28 degrees Celsius למשך 50 שעות. לאחר ההדגרה, בחנו את מספר ו/או את עוצמת ההבעה של hepatocytes המבטאים CFP באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent בהגדלה של 80x. צלמו זחלים חיים עם מספר ו/או עוצמה מוגברים או מופחתים של hepatocytes המבטאים CFP.הקימו הצלבות של דגי זברה (Zebrafish) טרנסגניים המכילים את החלבון fatty acid binding protein 10a:CFP-NTR עם TP1:mCherry, וגדלו את הזחלים הממוינים עד לגיל שש עד 12 חודשים. השתמשו ברשת כדי להעביר את דגי הזברה הטרנסגניים הבוגרים למכלי ההטלה. הכינו אתנול טרי בריכוז one percent במי מערכת, ולאחר מכן השתמשו ב-500 milliliters מהתמיסה כדי להחליף את מי המערכת במכלי ההטלה.דגרו את המכליים בטמפרטורה של 28 °C למשך 72 שעות, תוך העברת הדגים לתוך תמיסת אתנול טרייה והסרה יומית של דגים מתים במהלך הדגירה. הכינו תמיסת MTZ טרייה בריכוז 10 mM במי מערכת עם 0.1% DMSO, ולאחר מכן הוסיפו 500 mL של תמיסת MTZ שחוממה מראש לדגים במכליי הרבעה של 1 L. השתמשו בנייר אלומיניום כדי לכסות את המכליים.יש להדגיר בטמפרטורה של 28 degrees Celsius למשך שמונה שעות ולנתח בהתאם לפרוטוקול הכתוב. לאחר הרדמה לפי הפרוטוקול הכתוב, חשפו את איברי מערכת העיכול באמצעות מספריים על ידי חיתוך העור והשרירים התת-עוריים לאורך הבטן, מסנפיר הפיטן ועד למכסה הזימים (operculum). לאחר מכן, חתכו לכיוון האחורי לאורך צד הדג חזרה עד לסנפיר הפיטן.העבירו את הדג לפרועת קונית של 15 מיליליטר ושטפו פעם אחת באמצעות PBS. לאחר מכן, הסירו את ה-PBS והוסיפו 4 מיליליטר של פורמלהיד 3% שהוכן טרי בבופר PEM. דגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך לילה כדי לקבע את הדג.ביום למחרת, לאחר שטיפת הדגימות בהתאם לפרוטוקול הכתוב, גזרו את הוושט כדי להוציא את כל מערכת העיכול יחד עם הכבד מחלל הגוף. לאחר מכן, הניחו את איברי מערכת העיכול בתבנית חיתוך והשתמשו באגרוז נמוך התכה בריכוז 4% כדי להטמיע את הרקמה. לאחר מכן, גזרו את הבלוק לצורת טרפז והדביקו אותו לבסיס.לאחר מכן, השתמשו בויברטום (vibratome) ובחיתוך דגימות ברוחב 50 µm במקטעים רוחביים, החל מהקצה הפנימי של הרקמה, אל תוך PBS קר מאוד. השתמשו במכחול מספר 1 כדי להעביר את המקטעים לפלטה בעלת 6 בארי (6 well plate) המכילה PBS. לאחר ביצוע צביעה אימונוהיסטוכימית למקטעים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמשו במכחול מספר 1 כדי להעביר בעדינות את המקטעים לשקופיות זכוכית.השתמשו בנייר ניגוב (kimwipes) כדי להסיר PBS עודף לפני הוספת טיפה של תמיסת קיבוע (mounting medium) וזכוכית כיסוי. לאחר מכן, השתמשו בלק גוף כדי לאטום את זכוכית הכיסוי. לבסוף, באמצעות מערכת קונפוקלית המצוידת בעדשת שמן 40x 1.3 NA, בצעו צילום Z-Stack בעוצמה של 20 עד 50 אחוזים ובמרווחים של מיקרון אחד.איור זה מראה כי זחלים שטופלו ב-ethanol MTZ פיתחו כיפוף כלפי מעלה של הגו והזנב, בצקת פריקארדיאלית (paricardialidema), וכשל בניפוח של שלפוחית השחייה. כפי שניתן לראות כאן, כבדים של ביקורת שטופלו ב-DMSO לא הראו שקיעה של קולגן מסוג 1 פיברילרי. לעומת זאת, כבדים שטופלו ב-ethanol MTZ הראו הצטברות מוגברת של קולגן מסוג 1 ב-25 ו-50 שעות לאחר אבלציה.בנוסף, בהשוואה לכבדים של קבוצת הביקורתי שקיבלו DMSO, מספר ה-HSC's עלה והם אימצו צורה דמוית myofibrillblast, חסרה בתהליכים ציטופלזמיים, בכבדים המתחדשים שטופלו באתנול ו-MTZ. דמות זו מראה את הפיתוח של מודל כבד פיברוטי מושרא על ידי אתנול בדגי זהב בוגרים שטופלו באתנול בריכוז של one percent ואחריו ב-MTZ. מניתוחים אלו של מהלך הזמן, נצפתה הצטברות מוגברת באופן מובהק של קולגן מסוג one collagen בכבדים המתחדשים שטופלו באתנול ו-MTZ ביומים השני, השלישי והרביעי לאחר האבלציה, בהשוואה לכבדים שטופלו ב-DSMO.בניסוי סריקה כימית זה, התבצע השמדה של הפטוציטים בנוכחות 1.5 אחוז ethanol ו-15 millimolar MTZ. לאחר מכן, הזחלים נחשפו לחומרים כימיים למשך 50 שעות. מספר אגוניסטים של Wnt, כגון מעכבים של glycogen synthase kinase-3 ומפעיל Wnt, קידמו רגנרציה של הפטוציטים בהשוואה ל-DMSO.נתונים אלה מצביעים על כך שדגם פיברוזי זה, המתקיים לאורך זמן, מספק כלי בעל ערך רב לגילוי מולקולות קטנות המגבירות את התחדשות ההפטוציטים. לאחר שליטה בטכניקה, ניתן לבצעה בתוך שבוע אחד אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשיג אבלציה כמעט מלאה של ההפטוציטים ולשמור על ריכוז האתנול לאורך כל הפרוצדורה.בעקבות הליך זה, ניתן לבחון את היעילות של התרכבים הכימיים שזוהו במודלים של פגיעה בכבד של יונקים. לאחר פיתחו,הטכניקה הזו יכולה לפתוח נתיבים חדשים בתחום של טיפול ברגנרציה תאית כדי לחקור את הפוטנציאל לגילוי אסטרטגיות טיפוליות חדשניות עבור חולי אי-ספיקת כבד כרונית. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מפתחים מודל של כבד פיברוטי המושרה על ידי אתנול בדגי זברה וכיצד לבצע סריקות כימיות.אל תשכחו שעבודה עם פורמלהיד עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון חבישת כפפות וטיפול בריאגנט בתוך מבתר כימי, בעת ביצוע פרוצדורה זו.

development-an-ethanol-induced-fibrotic-liver-model-zebrafish-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

כדי להבין את המנגנונים המולקולריים של אתנול הנזק הנגרמת התפתחותית, פיתחנו מודל של דג הזברה חשיפה אתנול בוחנים את פיזיים, שינויים הסלולר, וגנטיים המתרחשות לאחר החשיפה...

הערכת שינויים teratogenic במודל דג הזברה של חשיפה אלכוהול עוברית

זכרון מטבולית הוא התופעה שמתרחשת סיבוכי סוכרת להתמיד ולהתקדם ללא הפרעה גם לאחר euglycemia מושגת pharmaceutically. כאן אנו מתארים מודל סוכרת דג זברה שהוא ייחודי בכך שהיא מאפשרת בדיקה של רכיבי epigenetic mitotically המסירים של זיכרון...

דגם דג זברה של סוכרת וזכרון מטבולית

כדי לעזור להעריך את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התחדשות הכבד המונעת על ידי דג הזברה, הקמנו מודל פגיעה בכבד שבו הפטוציטים המבטאים ניטרורודוקטאז מבוטלים גנטית בטיפול במטרונידזול.  בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לתמרן במיומנות, לנטר ולנתח אבלציה של הפטוציטים והתחדשות כבד מונעת מרה.

אבלציה Hepatocyte הספציפי בדג הזברה לחקר התחדשות כבד מונע מרה

פרוטוקול זה מתאר ניתוח היסטולוגית של הכבד מן הזחלים דג הזברה כי טופלו באתנול 2% עבור 24 שעות. טיפול כזה אתנול חריפה התוצאות סטאטוזיס כבד נפיחות של כלי הדם הכבד.

ניתוח היסטולוגית של פגיעה חריפה בכבד אלכוהול דג הזברה

כאן אנו להפגין שיטה לכמת את גודל הכבד בזחל zebrafish, מתן דרך להעריך את ההשפעות של מניפולציות גנטיות ופרמקולוגית על גידול בכבד ופיתוח.

בדיקת גודל הכבד בזחל זברה באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד

עבודה זו מתארת פרוטוקול לכמת רמות האתנול בעובר דג זברה באמצעות כרומטוגרפיה הראש שטח גז משיטות חשיפה נכונה לעיבוד העובר ניתוח אתנול.

קוונפיקציה של רמות האתנול של עוברי דגים באמצעות כרומטוגרפיה גז החלל הראשי

פרוטוקול זה מתאר את ההליכים כדי לגרום לפגיעה בכליות חריפה (AKI) ב זברה-דג מבוגר באמצעות ציספלטין כסוכן נטרוקסי. פירטנו את השלבים כדי להעריך את הרבייה של הטכניקה ושתי טכניקות לניתוח דלקת ומוות תאים ברקמת הכליה, ציטומטריית זרימה ו- TUNEL, בהתאמה.

מודל פגיעה בכליות חריפה המושרה על ידי ציספלטין בדג זברה למבוגרים

פרוטוקול זה מתאר את ההליך להסרת האונה הגחונית של הכבד בדגי זברה בוגרים כדי לאפשר את המחקר של התחדשות הכבד.

כריתת הפטקטומיה חלקית בדגי זברה למבוגרים

במאמר זה אנו מציגים כיצד ליצור מודל של דגי זברה הקשורים למחלת כבד שומני שאינו אלכוהולי (NAFLD) כדי לחקור את ההשפעה של עודף כולסטרול על המיקרו-סביבה של הכבד ועל הנוף של תאי מערכת החיסון.

ניתוח של מיקרו-סביבה של הכבד במהלך התקדמות מוקדמת של קרצינומה הפטוצלולרית שאינה אלכוהולית הקשורה למחלת הכבד השומני בדגי זברה

עבודה זו מתארת פרוטוקול למערכת טרנסגנזה מודולרית Tol2, שיטת שיבוט מבוססת שער ליצירה והזרקה של מבנים טרנסגניים לעוברים של דגי זברה.

מערכת Tol2 של דג הזברה: גישת טרנסגנזה מודולרית וגמישה מבוססת שער

כאן אנו מציגים פרוטוקול להשתלת תאים ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה בעוברים ובזחלים של דגי זברה בכל שלב בין יום אחד לשבעה ימים לפחות לאחר ההפריה.

השתלת תאים ברזולוציה גבוהה בדגי זברה עובריים וזחלים

למדו ליצור מודל כבד פיברוטי מושרה אתנול ב-Danio rerio לחקר מנגנוני התחדשות תאי כבד. שיטה זו מאפשרת סקרינג כימי יעיל וחיסכוני לזיהוי תרופות פוטנציאליות לטיפול במחלות כבד.

פיתוח מודל כבד אתנול-induced fibrotic דג הזברה ללמוד ובתאים בתיווך תא התחדשות Hepatocyte

גלה סרטונים נוספים