הכנה וניתוח של במבחנה שלושה שד ממדי המחליפים קרצינומה
9 במאי 2016
אנו מדגימים שיטה ליצירת פונדקאיות תלת מימדיות לסרטן השד, שניתן לתרבית באמצעות מערכת ביו-ריאקטור זלוף כדי לספק חמצן וחומרים מזינים. לאחר הגדילה, הפונדקאיות מקובעות ומעובדות לפרפין להערכת פרמטרים מעניינים. מוסברת ההערכה של פרמטר אחד כזה, צפיפות התאים.
המטרה הכוללת של מערך הליכים זה היא ליצור תרביות תאים תלת מימדיות כדי לתפקד כמו פונדקאיות סרטן שד במבחנה, ולהציג שיטה למדידת צמיחת תאים בחלקים היסטולוגיים של הפונדקאיות. תרבית תאים תלת מימדית היא שיטה רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית למידול התנהגות תאים במבחנה מאשר תרבית תאים דו-ממדית. על ידי שינוי הרכב התא בתנאי ניסוי, ניתן להתאים את מערך ההליכים הזה כדי לענות על מגוון שאלות ביולוגיות, ולהעריך את היעילות של טיפולים מועמדים.
כדי לשלב את התאים ב-ECM, על קרח, הוסיפו את התאים ואת ארבעת הרכיבים הקשורים הראשונים המפורטים בטבלה הראשונה בכתב היד המצורף, לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של שני מילימטרים. לאחר מכן, ערבבו אותם בעדינות על ידי פיפטינג, והימנעו מהיווצרות בועות. עקוב אחר רמת ה-pH באמצעות הפנול האדום ב-10XD MEM כדי לוודא שהתערובת מציגה צבע כתום-ורוד, המעיד על pH של שבע.
אם התערובת נראית צהובה וה-pH נמוך מדי, הוסיפו לאט 7.5 אחוז נתרן ביקרבונט טיפה אחת בכל פעם עד שמגיעים לצבע המתאים. זכור לשמור את התערובת על קרח, ועבוד במהירות כדי למנוע פילמור ECM מוקדם. עבור תרביות תלת מימד מוצקות, שמור על החלקת החדר על קרח כדי למנוע פילמור ECM מוקדם.
פיפטה לאט 100 מיקרו-ליטר מתערובת ה-ECM של התא לכל באר של שקופית תא שמונה הבארות, ופיפטה את תערובת ה-ECM של התא סביב שולי הבאר כדי לסייע בפיזור טוב יותר של התערובת. לאחר מכן, דגרו על הפונדקאיות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, חמישה אחוזי CO2, למשך 45 דקות כדי לאפשר פילמור ECM. לאחר ארבעים וחמש דקות מוסיפים 100 מיקרו-ליטר של מצע התרבית לכל באר, ודוגרים ב-37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזי CO2 למשך הניסוי.
שנה את מדיום התרבות כל יומיים. מגבלה של תרבית תלת מימד היא שדיפוזיה של חמצן וחומרים מזינים לנפח עשויה להיות לא מספקת כדי לתמוך בכדאיות התאים. תוספת של מערכת ביו-ריאקטור עשויה לעזור להתגבר על מגבלה זו ולהגביר את הצמיחה.
כדי להעשיר תרביות תלת מימד במערכת ביו-כור, הכינו והרכיבו באופן סטרי את החלק של מערכת הביו-ריאקטור המאכלס את הפונדקאיות. במכסה המנוע של תרבית תאים, באמצעות מזרק עם מחט בגודל 26, הזרקו את תערובת ה-ECM של התא לאזור הביו-ריאקטור הזלוף שנועד להכיל תאים, והמשיכו במהירות לשלב הבא. כדי להבטיח פיזור אחיד יותר של התאים בתוך הפונדקאיות, הנח את רכיב הביו-ריאקטור המאכלס את הפונדקאיות בצינור חרוטי של 50 מיליליטר.
סובב ברציפות את הפונדקאיות ב-18 סל"ד תוך כדי דגירה ב-37 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה באתרו או באינקובטור למשך 45 דקות כדי לאפשר פילמור ECM. לאחר פילמור והוספת מדיום, חבר את מכלול הביו-ריאקטור למשאבה. התחל זלוף בינוני באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס, חמישה אחוזי CO2.
המשך זלוף בינוני למשך הניסוי, ושנה את מדיום התרבית כנדרש לתכנון הניסוי הספציפי. בסוף הניסוי עוטפים את הפונדקאיות בג'ל לעיבוד דגימות כדי לשמור על הפונדקאיות שלמות במהלך העיבוד, ולהקל על חתך היסטולוגי. לשם כך, ממיסים את ג'ל עיבוד הדגימה באמבט מים של 60 מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן לשימוש.
לאחר מכן, פיפטה כ-300 מיקרו-ליטר של ג'ל לעיבוד דגימה לתחתית תבנית קריו-מסומנת. בעזרת להב אזמל ומלקחיים, הסר בזהירות פונדקאית מהכור הביולוגי או מהבאר של מגלשה תאית בת שמונה בארות, והנח אותה בתבניות הקריוגרפיות המכילות ג'ל לעיבוד דגימות. פיפטה כ-300 מיקרו-ליטר של ג'ל לעיבוד דגימה לכיסוי הפונדקאית בקריומולט.
לאחר מכן, דגרו אותו בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר שהג'ל לעיבוד הדגימה התמצק, הסר את ג'ל עיבוד הדגימה המכיל את הפונדקאית מהקריומולד והנח אותו בקלטת רקמות. אם יש להכניס יותר מפודקאית אחת לאותה קלטת רקמות, ניתן להשתמש בצבעי סימון רקמות כדי להבחין בין דגימות לאחר קיבוע ועיבוד.
לאחר מכן, הנח את קלטת הרקמה המכילה את הפונדקאית בפורמולה ניטרלית של עשרה אחוזים למשך עשר עד שתים עשרה שעות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר קיבוע מלא. לאחר הקיבוע, העבירו את קלטת הרקמה המכילה את הפונדקאית ל-70 אחוז אתנול. הפונדקאית הקבועה מוכנה כעת לעיבוד לפרפין ולחתך היסטולוגי לאחר מכן.
כדי למדוד את צפיפות התאים ותמונות פוטו-מיקרוסקופיות של חלקים מוכתמים H ו-E, פתח קובץ תמונה של הפונדקאית. השתמשו בכלי Polygon ב-ImageJ ובקצוות ה-ECM כקו עזר, כדי לשרטט את אזור הפונדקאית באמצעות גרירת העכבר ולחיצה ליצירת נקודות עיגון. לאחר החלוקה לרמות, בחר מדידה תחת הכרטיסיה ניתוח.
לאחר מכן, העלה את קבצי התמונה המשמשים למדידת אזור הפונדקאות ל-Cell Profiler על ידי גרירת קבצי התמונה לרשימת הקבצים. לאחר מכן, הקצה שם לכל תמונה המיובאת במודול ייבוא שמות וסוגים ובחר את סוג התמונה. לאחר יצירת צינור הניתוח, הפעל את מצב בדיקה ולחץ על הפעל ב-Cell Profiler.
והעריכו אובייקטים מסוננים כדי להבטיח שרוב הגרעינים בתמונת הבדיקה מזוהים כראוי, והפרמטרים האופטימליים נבחרים לזיהוי התאים. הגרעינים הכלולים יהיו מוקפים בעיגול ירוק. לאחר מכן, שמור את הפרויקט, צא ממצב בדיקה ולחץ על נתח תמונות.
מוצגת כאן תמונה מייצגת של החלק המוכתם ב-H ו-E מפונדקאית שגדלה במשך שבעה ימים. וזו תמונה מייצגת של החלק המוכתם ב-H ו-E מחליף מוצק שגדל במשך שבעה ימים עם מדיום מוחלף כל יומיים. התאיות נמוכה בהרבה בפונדקאיות המוצקות.
גרף זה מציג את ההשוואה של המספר הממוצע של תאים גרעיניים לאזור לאחר שבעה ימי גדילה. פונדקאית מפוצצת וסולידית. נתונים מספריים אלה תומכים בתאיות במיקרו-גרפים הצילומיים של החלקים המוכתמים H ו-E.
והגרף הזה מראה את ההשוואה של מדד התיוג Ki-67, שהוא מדד התפשטות התאים לאחר שבעה ימים של גידול של פונדקאיות מוצקות ומוצקות. נתונים אלה תומכים שוב בצמיחה גדולה יותר בפונדקאיות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון הכלאה באתרה ואמינו היסטוכימיה על חתכים היסטולוגיים של הפונדקאיות כדי לענות על שאלות כמו RNA וביטוי חלבונים.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד להכין ולעבד פונדקאיות תלת מימדיות של רקמות מבחנה, ולבצע ניתוח פונדקאי על חלקים היסטולוגיים מוכתמים H ו-E.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה ליצירת תחליפי סרטן שד תלת-ממדיים שניתן לתרבת במערכת ביו-ריאקטור בפרפוזיה. התחליפים נבדקים עבור פרמטרים כגון צפיפות תאים לאחר קיבוע ועיבוד לאנליזה היסטולוגית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- אונקולוגיה
רקע
- תרבית תאים תלת-ממדית מספקת מודל רלוונטי פיזיולוגית יותר מאשר תרביות דו-ממדיות.
- שיטה זו מאפשרת הערכה של שאלות ביולוגיות שונות.
- ניתן להתאימה להערכת היעילות של תרופות מועמדות.
- ניתן לשנות את ההרכב התאי כדי לבחון תנאים ניסיוניים שונים.
מטרת המחקר
- ליצירת תחליפים לסרטן השד in vitro באמצעות תרביות תאים תלת-ממדיות.
- להצגת שיטה למדידת צמיחת תאים בחתכים היסטולוגיים.
- להעמקת ההבנה של התנהגות תאים בסביבה רלוונטית יותר.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הכנת תערובת תאים עם רכיבי ECM בתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה.
- ערבוב עדין של הרכיבים כדי למנוע היווצרות בועות.
- ניטור רמות ה-pH באמצעות פנול אדום להבטחת תנאים אופטימליים.
- שימוש במערכת ביו-ראקטור של פרפוזיה לתחזוקת התרבית.
תוצאות עיקריות
- יצירה מוצלחת של דגמים חלופים תלת-ממדיים של סרטן השד.
- הערכה של צפיפות התאים כפרמטר מפתח למחקר.
- הדגמת יכולת ההתאמה של השיטה למגוון שאלות ביולוגיות.
- ביסוס פרוטוקול אמין למחקרים עתידיים.
מסקנות
- השיטה שפותחה מספקת פלטפורמה חסונה למחקרי סרטן השד.
- תרביות תלת-ממדיות יכולות לשפר משמעותית את המידול במערכות in vitro.
- גישה זו יכולה להקל על בחינת מועמדים טיפוליים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך הניהולי
שיטה זו מאפשרת מידול in vitro רלוונטי פיזיולוגית של קרצינומה של השד על ידי שילוב רכיבי סטרומה ומטריצה חוץ-תאית, ובכך היא נותנת מענה למגבלה מרכזית של תרביות 2D קונבנציונליות. מערכת הביוריאקטור עם זרימה (perfusion) מתגברת על מגבלות דיפוזיה של חמצן וחומרי הזנה, ובכך היא תומכת בתרבית ממושכת לצורך בדיקת תרופות בשלב הפרה-קליני. כימות צפיפות תאים עם גרעין באמצעות ImageJ ו-CellProfiler מספק תוצר מדיד להערכת דינמיקת הגדילה והתגובה לטיפול.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של אינטראקציות בין גידול לסטרומה במבנה תלת-ממדי המדמה באופן קרוב יותר קרצינומה של השד in vivo.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות מידול השפעתם של פיברובלסטים ושל ה-ECM על התנהגות תאי סרטן.
- ערך ניבוי: מגביר את הביטחון בממצאים פרה-קליניים על ידי הפחתת ארטיפקטים הקשורים לתרביות בשכבה אחת (monolayer).
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יצירת תחליפי תלת-ממד סטנדרטיים עם צפיפות תאים ניתנת לכימות לצורך סריקה עקבית של תרכובות.
- ערך תפעולי: תואם למערכות ביו-ריאקטור בפרפוזיה לשמירה על חיוניות התאים במהלך חלונות בדיקה ממושכים.
- מוכנות לבדיקה: תהליכי עיבוד היסטולוגי וניתוח תמונות מאפשרים מדידה הדירה של צפיפות התאים כנקודת קצה פרמקודינמית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רציפות תרגומית: התחליפים מקובעים ומעובדים לפאראפין בשיטות analogous לטיפול בדגימות קליניות, דבר המאפשר השוואה ישירה.
- מודל פרה-קליני: מאפשר הערכה של קינטיקת גדילה וסממני פרוליפרציה כגון Ki-67 תחת תנאים משתנים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשר שינוי של רכיבים תאיים ומרכיבי מטריקס כדי לחקור את התרומה של הסטרומה להתנהגות הגידול ולתגובה לטיפול.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אספקת מודל תלת-ממדי הכולל סטרומה, שניתן להשתמש בו לבדיקת היפותזות, פיתוח בדיקות ותיקוף פרה-קליני לפני אופטימיזציית המולקולות המובילות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך במחקרים מכניסטיים של אינטראקציות בסביבת המיקרו של הגידול ובמודולציה סטרומלית של פנוטיפים של תאי סרטן.
- סינון: מאפשר תרבית מבוססת פרפוזיה למחקרים של חשיפה ממושכת לתרופות עם אספקת רכיבי תזונה מבוקרת.
- אנליטיקה: כימות של תאים עם גרעין ליחידת שטח באמצעות ImageJ ו-CellProfiler מספק מדדים אובייקטיביים וניתנים להרחבה עבור השפעות של צמיחה וטיפול.
- מחקר תרגומי: עיבוד בפאראפין וחיתוך היסטולוגי תואמים את זרימות העבודה של פתולוגיה קלינית, ובכך תומכים בהערכה של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: הרכב תאי הניתן להתאמה מאפשר לתכנת מחדש את הפלטפורמה עבור תתי-סוגים שונים של סרטן השד או תצורות שונות של תרבית משותפת (co-culture) עם סטרומה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: משפר את הרלוונטיות הפיזיולוגית של מודלים in vitro על ידי שילוב רכיבי סטרומה ו-ECM החסרים בשכבות מונואלייר סטנדרטיות.
- ערך תפעולי: שילוב בביוראקטור עם פירפוז (perfusion) מקטין מגבלות דיפוזיה, ובכך משפר את השחזוריות ואת משך התרבית.
- ערך אסטרטגי: מאפשר הערכות פרה-קליניות בעלות יכולת ניבוי גבוהה יותר, ובכך מפחית את הסיכון לתוצאות חיוביות שגויות בסינון תרופתי.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בקבלת החלטות מבוססות נתונים (go/no-go) באמצעות אספקת מדדים כמותיים על צמיחת תחליפים ותגובה לטיפול.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות תאים בתלת-ממד, בטכניקות סטריליות ובעיבוד היסטולוגי.
- תלוי בגישה למערכות ביו-רCאקטור של פרפוזיה, למיקרוטומים ולתוכנות לניתוח תמונות (ImageJ, CellProfiler).
- מצריך סטנדרטיזציה של פרוטוקולי הכנת תחליפים, קיבוע וחיתוך בין הצוותים.
- התאמה למודלים חלופיים עשויה לדרוש אופטימיזציה של הרכב ה-ECM ויחסי התאים.
- מגבלות מעשיות כוללות זמני תרבית ממושכים ושימוש מוגבר במשאבים בהשוואה למודלים דו-ממדיים.
שאלות נפוצות בנושאי ביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:46
Preparation of Cells in Extracellular Matrix
1:36
Surrogate Preparation
3:51
Surrogate Fixation and Processing
5:27
Measuring Cell Density
6:39
Results: Representative Images of a H&E-stained Section from Perfused and Solid Surrogates
7:37
Conclusion
