Name: מבחני מושבת Vitro לאפיון ובתאי Tri-עצמה מבודדת מלבלב Murine למבוגרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: למדו איך לאפיין מושבות תאים מקדם-לבלב מבודדים מלבלב מבוגרים בעכברים באמצעות מבחני מושבה בתלולית מתיל עם מצע חצי-מוצק. שיטות אלו מאפשרות חקר התחדשות עצמית והתמיינות של תאים בודדים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לוסי בראון ואלכסנדר Spalla מהליבה Cytometry האנליטי של עיר של תקווה עבור סיוע במיון. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מעניק R01DK081587 ו R01DK099734 כדי HTK, ו U01DK089533 ל- ADR, ועל ידי מענק הקרן הלאומית למדע NSF-DMR-1,206,121 וקליפורניה המכון RB5-07398 מענק רפואה רגנרטיבית כדי DAT תומך ממכון ג&#39;ייקובס יוסף י להנדסה מולקולרית לרפואה בקלטק כדי DAT, ואלה מן קרן אוקסנרד ואלה פיצג&#39;רלד קרן כדי HTK גם הודתה בהכרת תודה. מימון: עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מעניק R01DK081587 ו R01DK099734 כדי HTK, ו U01DK089533 ל- ADR, ועל ידי מענק הקרן הלאומית למדע NSF-DMR-1,206,121 וקליפורניה המכון RB5-07398 מענק רפואה רגנרטיבית כדי DAT תומך מן יוסף י ג&#39;ייקובסמכון להנדסה מולקולרית לרפואה בקלטק כדי DAT, ואלה מן אוקסנרד קרן ואלה פיצג&#39;רלד קרן כדי HTK גם הודו בהכרת תודה. מחקר מדווח בפרסום זה כלל את עבודות שבוצעו Core ההדמיה הדיגיטלי המיקרוסקופי Core Cytometry אנליטית האור הנתמך על ידי המכון הלאומי לסרטן של המכון הלאומי לבריאות בארה&quot;ב תחת מספר פרסי P30CA33572. מחקר חסות: נותן החסות לא להשתתף בעיצוב המחקר, איסוף, ניתוח, או פרשנות של נתונים.

<ol><li>Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+tracing+reveals+the+ontogeny+of+pancreatic+cell+fates+during+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis.</a> Mech Dev. 120, 35-43 (2003).</li>
<li>Kopp, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9%2B+ductal+cells+are+multipotent+progenitors+throughout+development+but+do+not+produce+new+endocrine+cells+in+the+normal+or+injured+adult+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas.</a> Development. 138, 653-665 (2011).</li>
<li>DiGiusto, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-based+gene+therapy+for+HIV+with+lentiviral+vector-modified+CD34%28%2B%29+cells+in+patients+undergoing+transplantation+for+AIDS-related+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma.</a> Science translational medicine. 2, 36-43 (2010).</li>
<li>Inada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbonic+anhydrase+II-positive+pancreatic+cells+are+progenitors+for+both+endocrine+and+exocrine+pancreas+after+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Carbonic anhydrase II-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 19915-19919 (2008).</li>
<li>Solar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+exocrine+duct+cells+give+rise+to+insulin-producing+beta+cells+during+embryogenesis+but+not+after+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth.</a> Dev Cell. 17, 849-860 (2009).</li>
<li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+pancreatic+progenitor+cells--recent+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies.</a> Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colony-forming+cells+in+the+adult+mouse+pancreas+are+expandable+in+Matrigel+and+form+endocrine%2Facinar+colonies+in+laminin+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).</li>
<li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-26a+targets+ten+eleven+translocation+enzymes+and+is+regulated+during+pancreatic+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-26a targets ten eleven translocation enzymes and is regulated during pancreatic cell differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 17892-17897 (2013).</li>
<li>Ghazalli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+Pancreas+of+Mice+Contains+Tripotent+Progenitors+Capable+of+Giving+Rise+to+Duct%2C+Acinar%2C+and+Endocrine+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Postnatal Pancreas of Mice Contains Tripotent Progenitors Capable of Giving Rise to Duct, Acinar, and Endocrine Cells In Vitro.</a> Stem Cells Dev. , (2015).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colony-forming+progenitor+cells+in+the+postnatal+mouse+liver+and+pancreas+give+rise+to+morphologically+distinct+insulin-expressing+colonies+in+3D+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Diabet+Stud%22%5BJournal%5D)">Colony-forming progenitor cells in the postnatal mouse liver and pancreas give rise to morphologically distinct insulin-expressing colonies in 3D cultures.</a> Rev Diabet Stud. 11, 35-50 (2014).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Multilineage+Differentiation+and+Self-Renewal+of+Single+Pancreatic+Colony-Forming+Cells+from+Adult+C57Bl%2F6+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">In Vitro Multilineage Differentiation and Self-Renewal of Single Pancreatic Colony-Forming Cells from Adult C57Bl/6 Mice.</a> Stem Cells Dev. , (2014).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo J. 32, 2708-2721 (2013).</li>
<li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+three-dimensional+niches+deconstruct+pancreas+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.</a> Development. 140, 4452-4462 (2013).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+conversion+of+human+pancreatic+ductal+cells+into+insulin-secreting+endocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Expansion and conversion of human pancreatic ductal cells into insulin-secreting endocrine cells.</a> Elife. 2, e00940(2013).</li>
<li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organoid-initiating+cells+in+mouse+pancreas+and+liver+are+phenotypically+and+functionally+similar%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The organoid-initiating cells in mouse pancreas and liver are phenotypically and functionally similar.</a> Stem Cell Res. 13, 275-283 (2014).</li>
<li>Ku, H., Yonemura, Y., Kaushansky, K., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombopoietin%2C+the+ligand+for+the+Mpl+receptor%2C+synergizes+with+steel+factor+and+other+early+acting+cytokines+in+supporting+proliferation+of+primitive+hematopoietic+progenitors+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Thrombopoietin, the ligand for the Mpl receptor, synergizes with steel factor and other early acting cytokines in supporting proliferation of primitive hematopoietic progenitors of mice.</a> Blood. 87, 4544-4551 (1996).</li>
<li>Ku, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-expressing+colonies+developed+from+murine+embryonic+stem+cell-derived+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors.</a> Diabetes. 56, 921-929 (2007).</li>
<li>Winkler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+assay+for+insulin-expressing+colony-forming+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors.</a> J Vis Exp. , e3148(2011).</li>
<li>Gong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li>
<li>Formeister, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+SOX9+levels+differentially+mark+stem%2Fprogenitor+populations+and+enteroendocrine+cells+of+the+small+intestine+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinct SOX9 levels differentially mark stem/progenitor populations and enteroendocrine cells of the small intestine epithelium.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1108-G1118 (2009).</li>
<li>Fluidigm. Real-Time PCR Analysis User Guide (PN) 68000088 K1. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.fluidigm.com/documents">http://www.fluidigm.com/documents</a> (2015).</li>
<li>Seymour, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dosage-dependent+requirement+for+Sox9+in+pancreatic+endocrine+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A dosage-dependent requirement for Sox9 in pancreatic endocrine cell formation.</a> Dev Biol. 323, 19-30 (2008).</li>
<li>Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 81, 2844-2853 (1993).</li>
<li>Suzuki, A., Nakauchi, H., Taniguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+multipotent+pancreatic+progenitors+using+flow-cytometric+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting.</a> Diabetes. 53, 2143-2152 (2004).</li>
<li>Seaberg, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).</li>
<li>Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+adult+pancreatic+exocrine+cells+to+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells.</a> Nature. 455, 627-632 (2008).</li>
<li>Baeyens, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+cytokine+treatment+induces+acinar+cell+reprogramming+and+regenerates+functional+beta+cell+mass+in+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transient cytokine treatment induces acinar cell reprogramming and regenerates functional beta cell mass in diabetic mice.</a> Nat Biotechnol. 32, 76-83 (2014).</li>
<li>Thorel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+adult+pancreatic+alpha-cells+to+beta-cells+after+extreme+beta-cell+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss.</a> Nature. 464, 1149-1154 (2010).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

מבחני מושבת לבלב המושבה אחת ניתוחי המתואר כאן נוצרו בהשראת מבחני מושבת hematopoietic המכיל methylcellulose אשר שחקו תפקיד מכריע בפענוח הביולוגיה של תאי אבות היווצרות דם בעשורים האחרונים 23. מבחנים אלה (איור 5), תאים ניתקים לבלב הם מצופים לתוך methylcellulose המכיל תקשורת חצי מוצקה עם גורמי גדילה מתאימים וחלבוני ECM התומכים ההיווצרות של טבעת, צפופות או האנדוקרינית / acinar מושבות 7. תא אב יחיד כי הוא מסוגל והוליד מושבה של תאים שמכונה PCFU. בכך...

<html> הלבלב מורכב משלוש שושלות תאים עיקריות; תאים acinar להפריש אנזימי עיכול, צינוריות להפריש mucin להדוף פתוגנים ולהעביר אנזימי עיכול כדי במעיים, ותאי האנדוקרינית להפריש הורמונים, כולל אינסולין וגלוקגון, כי לשמור על הומאוסטזיס הגלוקוז. במהלך ההתפתחות העוברית של הלבלב, תאי ductal מוקדם הם המקור של ובתאים תלת-עוצמה המסוגל והוליד שלושה שושלות של pancreata של בעלי חיים בוגרים 1,2. מכיוון שתאי גזע ובתאים מבוגרים, כגון תאי גזע ממוח העצם, כבר משמשים בהצלחה לטיפול במגוון מחלות 3, יש עניין רב במציאת תאי הגזע ועל מי שהגה בלבלב המבוגר. אם בידוד מניפולציה של תאי גזע ועל מי שהגה לבלב המבוגרים היו אפשריים, תאים אלה יכולים לשמש לטיפול במחלות כגון סוכרת מסוג 1, שבה תאי מפרישי האינסולין נהרסים על ידי אוטואימוניות. s = &quot;jove_content&quot;&gt; אם ובתאים תלת-עצמה עדיין קיימים צינוריות לבלב מבוגרות לאחר השלמת התפתחות עוברית היא שאלה התווכחה בכבדות בקהילה המדעית. בדיון זה, ושימוש in vivo cre-לקס השושלת-התחקות טכניקות, Inada ועמיתים לעבודה הראו כי תאי ductal בעכברים בוגרים שסומנו בסמן, anhydrase פחמתית השנייה, יכול מעוררים שלוש כל שושלות הלבלב 4. עם זאת, באמצעות סמנים ductal אחרים, כגון HNF1b 5 ו Sox9 2, זה היה להסיק כי תאים ductal אינם המקור העיקרי של תאי בטא בעכברים בוגרים. לפני מספר שנים, הצענו כי עילת הדיון הנ&quot;ל יכולה להיות בגלל החוסר, בתחום 6,7, של כלי אנליטיים מתאימים שיכול לשמש למדידת התחדשות עצמית ושתיים בידול קריטריונים רב שושלת צורך להגדיר תא גזע. טכניקת in vivo cre-לקס התחקות השושלת ציינההנ&quot;ל יכול לספק ראיות קשר הצאצאים-אב ברמת אוכלוסייה. עם זאת, טכניקת התחקות בשושלת זו מוגבלת שביכולתה כדי להבחין אם ובתאים יחידים יכולים עצמי לחדש להתמיין שושלות מרובות. ניתוח מתא בודד חשוב כי אם אבות מונו-עוצמה כמה, כל אחד עם פוטנציאל באים ממשפחות שונות, נותחו יחד, הם עשויים להופיע באופן קולקטיבי יש יכולות בידול רב השושלת. בנוסף, תאי גזע הם בדרך כלל אוכלוסיית קטין של איבר בוגר. הפעילות של אוכלוסיית תא קטין יכולה להיות רעולה פנים על ידי האוכלוסייה הגדולה. לכן, תוצאה שלילית ממחקר האוכלוסייה אינה מעידה בהכרח על העדר תאי גזע. לבסוף, מעקב שושלת-לקס cre אינו מאפשר כרגע המדידה עצמית והתחדשות. כדי להתחיל בהתמודדות טכנית הפער בתחום ביולוגיה של התא ובתאים הלבלב, המושבה 7-11 או organoid 12-15 </suמבחני p&gt; באמצעות מערכות תרבות 3D תוכננו. שני מבחני מושבה עבור אבות לבלב פותחו במעבדה שלנו: אחד מכיל תכשיר מסחרי של חלבוני מטריקס murine התאיים (ECM) (ראה שיטות וציוד טבלה), והשני מכיל הידרוג&#39;ל laminin, חלבון ECM מלאכותי מוגדר 7-11. ובתאים מעורבבים methylcellulose המכיל בינוני חצי מוצק. Methylcellulose הוא חומר אינרטי וצמיג ביולוגית מוכן סיבי עץ, ויש בו נעשה שימוש באופן שגרתי מבחני המושבה hematopoietic 16. את methylcellulose המכיל בינוני חצי מוצק מגביל את תנועתם של ובתאים יחידים, כך שהם לא יכולים מחדש המצרפי. עם זאת, המדיום הוא רך מספיק כדי לאפשר תאים ובתאים לגדול להתמיין מושבה של תאים בחלל 3D. בהמשך למסורת של המטולוגים, תא ובתאים הלבלב כי היה מסוגל והוליד מושבה של תאים היה nאמד יחידת המושבה יוצרי הלבלב (PCFU). PCFUs, כאשר גדל ב assay המושבה ECM המכיל בעכברים, להצמיח מושבות פיברוזיס ששמם &quot;טבעת&quot; מושבות 7. עם תוספת של אגוניסט Wnt, R-spondin1, לתוך תרבות ECM המכיל בעכברים, כמה מושבות טבעת לההפך &quot;צפוף&quot; מושבות 7. במאמר זה, אלה שני סוגי מושבות הגדלים בתרבית ECM בעכברים הם יכונו &quot;טבעת / צפופות&quot; מושבות. כאשר הטבעת / מושבות צפופות הם ניתקו לתוך השעית תא בודדת מחדש מצופות לתוך תרבויות המכילות הידרוג&#39;ל laminin, &quot;האנדוקרינית / acinar&quot; מושבות נוצרות 7. שימוש יחיד מושבה ניתוחית, נמצא כי רוב מושבות טבעת / סמיך האנדוקרינית / acinar, או ממבוגר (2-4 בן חודש) 7,11 או צעיר (1 שבועות בן) 9 לבלב בעכברים, לבטא את כל השלושה סמני שושלת. הדבר מצביע על כך שרוב PCFUs שמקורם הוא תלת-עצמה. ב assay מושבת ECM המכיל בעכברים, PCFUs בעכברים הבוגר וחסון עצמי לחדש ולהרחיב כ -500,000 פעמים מעל 11 שבועות בתרבות 7. ECM Murine מועדף תומך התמיינות של תאים ductal על שושלות האנדוקרינית acinar, ואילו בנוכחות הידרוג&#39;ל laminin, PCFUs murine מעודדים להבדיל מועדף לתאי האנדוקרינית acinar ופחות אל שושלת ductal 7,9,11. חשוב לציין, אינסולין + גלוקגון - תאי-הורמונלית מונתה נוצר בתרבות הידרוג&#39;ל laminin ולהפריש אינסולין בתגובה לגלוקוז גירוי במבחנה 7,9, דבר המצביע על בגרות פונקציונלית. הבידול תלת-השושלת 7,9 פוטנציאל ההתחדשות עצמית 11 של PCFUs הבודד אושר על ידי המיקרומניפולציה תא בודד, כלומר, culturing תא אחד לכל טוב עבור היווצרות מושבה. יחד, תוצאות אלו מספקים ראיות שיש עצמית חידוש,-poten תלתt, דמויי תאים ובתאים בלבלב בעכברים לאחר הלידה המציגות פעילויות בתרבות 3D. מבחני PCFU murine המתואר במאמר זה לקוחים מתוך assay המושבה לפני המיועד ובתאים הבדיל מתאי גזע עובריים בעכברים (mESCs) 17. פרוטוקול זה מתועד בפירוט אחר פרסום יופיטר 18. הרכיבים וטכניקות התרבות נדרשו לבצע את assay מושבת ECM המכיל בעכברים עבור PCFUs המבוגר זהים עבור אבות נגזרות המסקלין 17,18. לכן, היבטים אלה של assay לא יחזור על עצמו כאן; במקום הנהלים הבאים יטופלו: 1) דיסוציאציה של הלבלב מבוגר ומיון תאים CD133 + Sox9 / EGFP + ductal, המעשירים PCFUs מעכברים בוגרים 7, 2) מניפולציה תא בודד של תאים ממוינים, 3)-מושבה אחת מנתח באמצעות qRT-PCR ו כל הר immunostaining, ו -4) דיסוציאציה של Colonie microfluidicים לתוך ההשעיה תא בודד מחדש ציפוי לתוך ECM בעכברים או מבחני המושבה הידרוג&#39;ל laminin.

<table><tbody><tr><td>חלבוני ECM עכבריים (מטריג'ל)</td><td>בקטון דיקסון (פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי, ארה"ב)</td><td>354230</td><td>מלאי נשמר ב-20 & #176; C</td></tr><tr><td>הידרוג'ל למינין</td><td>מסופק על ידי דיוויד טירל (פסדינה, קליפורניה ארה"ב)</td><td></td><td>המלאי נשמר ב-20 ו-#176; C</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Shinetsu Chemical (טוקיו, יפן)</td><td></td><td>1,500 סנטיפואז (יחידת צמיגות דינמית השווה ל-15 גרם/ס"מ/שנייה) (צמיגות גבוהה)</td></tr><tr><td>Mediatech מי מלח עם חוצץ פוספט של Dulbecco</td><td>(מנסס, וירג'יניה, ארה"ב)</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ</td><td>מלח Gibco (גרנד איילנד, ניו יורק, ארה"ב)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל בקבוקון חרוטי פלקון</td><td>קורנינג בע"מ (קורנינג, ניו יורקארה"ב)</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 מ"מ x 20 מ"מ צלחת תרבית תרחיף</td><td>קורנינג בע"מ (קורנינג, ניו יורק, ארה"ב)</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>גיבקו (גרנד איילנד, ניו יורק, ארה"ב)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>DNase1</td><td>Calbiochem (דרמשטדט, גרמניה)</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז B</td><td>Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland)11088831001</td><td></td> <td>המלאי נשמר ב-20 &#176; C</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD16/32</td><td>Biolegend (סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב)</td><td>101310</td><td>אנדוטוקסין נמוך,</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Rat IgG2a ו-kappa ללא אזיד; בקרת איזוטיפ</td><td>ביולג'נד (סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב)400522</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>עכברוש IgG1 וקאפה; בקרת איזוטיפ</td><td>eBioscience (סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב)</td><td>13-4301-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD133-Biotin</td><td>eBioscience (סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב)</td><td>13-1331-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD71-PE-Cy7</td><td>Biolegend (סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב)</td><td>113812</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-Allophycocyanin</td><td>Biolegend (סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב)</td><td>405207</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-phenylindole</td><td>Invitrogen ( וולת'אם, מסצ'וסטס, &nbsp; USA)</td><td>3571</td><td>מלאי נשמר ב-20 &#176; C</td></tr><tr><td>Anti-mucin 1</td><td>Thermo Fisher Scientific (וולת'אם, מסצ'וסטס ארה"ב)</td><td>HM-1630-P1</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 649 עז אוגר אנטי-ארמני</td><td>ג'קסון אימונוס (ווסט גרוב, פנסילבניה, ארה"ב)</td><td>127-495-160</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הנשר השונה של דולבקו: תערובת נוטריאנטים F-12</td><td>Mediatech (מנסס, וירג'יניה, ארה"ב)</td><td>10-092-CV</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>תרבית Tissure ביולוגית (לונג ביץ', קליפורניה, ארה"ב)</td><td>101</td><td>מלאי נשמר ב-20 &#176; C</td></tr><tr><td>Tris Ethylenediaminetetraacetic חומצה</td><td>TEKnova (הוליסטר, קליפורניה, ארה"ב)</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Micro Kit</td><td>Qiagen (ונלו, הולנד)</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>ערכת שעתוק הפוך QuantiTec</td><td>Qiagen (ונלו, הולנד)</td><td>205310</td><td></td></tr><tr><td>CellsDirect חד-שלבי qRT-PCR ערכת</td><td>אמביון/Invitrogen (גרנד איילנד, ניו יורק, ארה"ב)</td><td>11753-100</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Santa Cruz Bio (סנטה קרוז, קליפורניה, ארה"ב)</td><td>SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים</td><td>Jackson Immuno (ווסט גרוב, פנסילבניה, ארה"ב)</td><td>005-000-121</td><td>המלאי נשמר ב-20 & #176; סרום</td></tr><tr><td>C Donkey</td><td>Jackson Immuno (ווסט גרוב, פנסילבניה, ארה"ב)</td><td>0017-000-121</td><td>המלאי נשמר ב-20 & #176; C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)</td><td>T-4799</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Invitrogen (Waltham, MA,&nbsp; ארה"ב)</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies (וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>גיבקו מים סטריליים</td><td>(גרנד איילנד, ניו יורק, ארה"ב)</td><td>15230-147</td><td>ביולוגיה מולקולרית בדרגה</td></tr><tr><td>פסטר פיפטה</td><td>פישר סיינטיפיק (פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב)</td><td>13-678-8B</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m רשת פילטר</td><td>פישר סיינטיפיק (פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב)</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m רשת פילטר</td><td>פישר סיינטיפיק (פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב)</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>TC Plate 96 באר מתלה</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924 (בעבר 83.1835)</td><td></td></tr><tr><td>1 סמ"ק מזרק</td><td>Becton Dickson (פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי, ארה"ב)</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 סמ"ק מזרק</td><td>Becton Dickson (פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי, ארה"ב)301604</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>48.48 Dyanmic Array Chip</td><td>Fluidigm (סן פרנסיסקו, קליפורניה, ארה"ב)</td> <td>BMK-M-48.48</td><td></td></tr><tr><td>Fluidigm GE 48.48 מדגם מערך דינמי & ערכת ריאגנטים לטעינת בדיקה</td><td>Fluidigm (סן פרנסיסקו, קליפורניה, ארה"ב)</td><td>85000800</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems (גרנד איילנד, ניו יורק, ארה"ב)</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילן גליקול סורביטן מונולאורט</td><td>סיגמא (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תחתית זכוכית</td><td>MatTek (אשלנד, מסצ'וסטס, ארה"ב)</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>צלחת פטרי 35 מ"מ עם תחתית זכוכית</td></tr><tr><td>חתיכת פה/צינורות גומי</td><td>Renova Life Inc. (קולג' פארק, מרילנד, ארה"ב)</td><td>MP-SET</td><td></td></tr><tr><td>ניקוטינאמיד</td><td>סיגמא (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)</td><td>מלאי N0636</td><td>נשמר ב-20 & #176; C</td></tr><tr><td>גורם גדילה אנדותל כלי דם</td><td>R& D Systems (מיניאפוליס, מינסוטה, ארה"ב)</td><td>מלאי 293-VE</td><td>נשמר ב-80 ו-#176; C</td></tr><tr><td>אקטיבין B</td><td>R& D Systems (מיניאפוליס, מינסוטה, ארה"ב)</td><td>מלאי 659-AB</td><td>נשמר ב-80 ו-#176; C</td></tr><tr><td>Extendin 4</td><td>Sigma (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)</td><td>מלאי E7144</td><td>נשמר ב-20 & #176; סי</td></tr><tr><td>רספונדין-1</td><td>מו"פ D Systems (מיניאפוליס, מינסוטה, ארה"ב)</td><td>מלאי 3474-RS</td><td>נשמר ב-80 & #176; C</td></tr><tr><td>Falcon 5 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגול</td><td>קורנינג בע"מ (קורנינג, ניו יורק, ארה"ב)</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>מחט PrecisionGlide 18 גרם x1 1/2</td><td>בקטון דיקסון (פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי, ארה"ב)305196</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>מחט PrecisionGlide 16 גרם x 1 1/2</td><td>בקטון דיקסון (פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי, ארה"ב)</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>משטח חיבור נמוך במיוחד של Costar 24 צלחת תחתונה שטוחה היטב&nbsp;</td><td>קורנינג בע"מ (קורנינג, ניו יורק, ארה"ב)</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>קוסטאר 96 בלאק וול פלייט</td><td>קורנינג בע"מ (קורנינג, ניו יורק, ארה"ב)</td><td>3603</td><td>תחתית שטוחה ושקופה עם מכסה.&nbsp; מיקרו-פלטות פוליסטירן שחור מטופלות TC</td></tr><tr><td>Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M מיקרוסקופ הפוך</td><td>Carl Zeiss AG (Oberkochen, גרמניה)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biomark HD&nbsp;</td><td>Fluidigm (סן פרנסיסקו, קליפורניה, ארה"ב)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אריה סדר מיוחד מחקר מוצר מיון תאים</td><td>בקטון דיקסון (פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי, ארה"ב)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS/BSA</td><td></td><td></td><td>1x PBS 
0.1% (משקל/נפח) BSA 
PenStrep (49 יחידות/מ"ל פניצילין, 49 &mu; גרם/מ"ל סטרפטומיצין)</td></tr><tr><td>PBS/BSA/Dnase1</td><td></td><td></td><td>1x PBS 
0.1% (משקל/נפח) BSA 
PenStrep (49 יחידות/מ"ל פניצילין, 49 &mu; גרם/מ"ל סטרפטומיצין) 
דנאז 1 (2,400 יחידות/מ"ל ללבלב)</td></tr></tbody></table>

מבחני מושבת vitro לאפיון ובתאי tri-עצמה מבודדת מלבלב murine למבוגרים

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

גזע ובתאים מהלבלב המבוגר יכולים להיות מקור פוטנציאלי של תאי בטא דמוי טיפולי לטיפול בחולי סוכרת מסוג 1. עם זאת, זה עדיין לא ידוע אם תאי גזע מולידם להתקיים בלבלב המבוגר. אסטרטגיות מחקר באמצעות-לקס cre שושלת-התחקות בעכברים בוגרים הניבו תוצאות כי גם תמיכה או להפריך את הרעיון כי תאי הבטא ניתן להפיק מן הצינורות, מיקומו המשוער שבו אבות לבלב מבוגרים עשויים להימצא. Vivo ב אלה שיטות cre-לקס התחקות השושלת, לעומת זאת, לא יכול לענות על השאלות של התחדשות עצמית ושתיים בידול קריטריונים רב השושלת צורך להגדיר תא גזע. כדי להתחיל פונה פער הטכני הזה, אנחנו ממציאים מבחני מושבה 3 ממדים עבור אבות לבלב. זמן קצר לאחר הפרסום הראשוני שלנו, מעבדות אחרות שפותחו באופן עצמאי דומה, אך לא זהה, שיטה המכונית assay organoid. בהשוואה assay organoid, השיטה שלנו מעסיקהmethylcellulose, המהווה פתרונות צמיגים המאפשרים הכללת החלבונים תאים מטריקס בריכוזים נמוכים. המבחנים המכיל methylcellulose להתיר זיהוי קל וניתוחים של ובתאים ברמת התא בודד, אשר הם קריטיים כאשר אבות מהווים אוכלוסייה-משנה קטן, כמו במקרה של תאי גזע איבר רבים מבוגר. יחד, תוצאות מכמה מעבדות להפגין במבחנת התחדשות עצמית והבחנה רבה שושלת של ובתאים דמויים לבלב מעכברים. הפרוטוקולים הנוכחיים מתארים שני מבחני מושבה מבוסס methylcellulose לאפיין אבות לבלב עכבר; אחד מכיל תכשיר מסחרי של חלבונים תאי מטריקס murine והשני חלבון תאי מטריקס מלאכותי המכונה הידרוג&#39;ל laminin. הטכניקות המוצגות כאן הן 1) דיסוציאציה של הלבלב ומיון של CD133 + Sox9 / EGFP + תאים ductal מעכברים בוגרים, 2) מניפולציה תא בודד של יםתאי orted, 3) מושבה אחת המנתח באמצעות immunostaining qRT-PCR ו כל ההר microfluidic, ו -4) דיסוציאציה של מושבות עיקריות לתוך תא בודד השעיות מחדש ציפוי לתוך מבחני מושבה משני להעריך התחדשות עצמית או בידול.

ניתן להעשיר תאי בוגרים ובתאי לבלב על ידי מיון תא מופעל קרינה (איור 1). שורת העכבר המהונדס Sox9 / EGFP משמשת כאן נוצרה הראשונה כתוצאה של פרויקט אטלס מוח GENSAT 19, ואת כתב EGFP נמצא תחת השליטה של כרומוזום חיידקים מלאכותי המכיל ~ 75 kb במעלה או ~ 150 kb רצפים במורד זרם של Sox9 20 . בעכברים אלו, EGFP תוויות צינוריות הלבלב ביעילות ובאופן ספציפי 22. לבלב היה רכש ו ניתק לתוך ההשעיה תא בודד, ומוכתמת עם נוג...

מבחני מושבה במבחנה כדי לזהות עצמית והתחדשות והבחנה של ובתאים מבודדים לבלב בעכברים בוגר הם המציאו. מבחנים אלה, אבות לבלב להצמיח מושבות תאים בחלל 3 ממדים במדיום methylcellulose המכיל מוצק למחצה. פרוטוקולים לטיפול תאים בודדים ואפיון של מושבות בודדות מתוארים.

מבחני מושבת Vitro לאפיון ובתאי Tri-עצמה מבודדת מלבלב Murine למבוגרים

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

המטרה הכללית של פרוטוקולים אלו היא לאפיין מושבות תאים שגדלו מתאי אב הלבלב בודדו מעכברים בוגרים, באמצעות בדיקות תרבית המשתמשות במצע חצי-מוצק המכיל מתילצלולוז. השיטות שלנו יכולות לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של תאי אב הלבלב, כגון, מהן יכולות ההתחדשות העצמית וההבדלה של תאי אב בלבלב בוגר? היתרון העיקרי של טכניקות אלו הוא שהן מאפשרות את חקרם של תאי אב בודדים, דבר החשוב להבנת הפוטנציאל הביולוגי האמיתי שלהם.הרעיון לשיטות אלו עלה לראשונה כאשר הבנו כי ניתן להחיל את בדיקות המושבות המשמשות לחקר תאי גזע המטופוייטיים גם על אוכלוסיות תאי לבלב. את הפרוצדורות ידגימו ג'ייקוב טרמבלי, סטודנט לתואר שני, ד"ר ג'נין קיחאנו, פוסט-דוקטורנטית, וגברת אנגלה לו, טכנאית, כולם מהמעבדה שלי. בהקדם האפשרי לאחר ההקרבה, השתמשו במספריים כדי לבצע חתך אנכי בקו האמצע של דופן הבטן, ופתחו את חלל הבטן.בעזרת פינצטה, הרימו בעדינות את הטחול, וגזרו במספריים את רקמת החיבור שבין הטחול לבין האונה הספלינית של הלבלב. נתקו את רקמות החיבור של האונות הדואודנליות והקיביות באופן דומה, והניחו את רקמות הלבלב בתוך צלחת פטרי המכילה DPBS בתוספת 0.1%BSA ואנטיביוטיקה, על קרח. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמשו בפינצטה בעלת קצה דק כדי להסיר את רקמת השומן.כעת העבירו את הלבלבים למנדף תרביות רקמה ושטפו את הרקמה בשלוש צלחות פטרי רצופות של 100 מילימטר, שכל אחת מהן מכילה 10 מיליליטר של PBS קר בתוספת BSA. לאחר השטיפה האחרונה, הניחו את הלבלבים בצלחת פטרי סטרילית ויבשה כדי להסיר כמה שיותר PBS בתוספת BSA, והעבירו את הרקמות לצלחת פטרי יבשה נוספת על קרח. לאחר מכן, השתמשו במספרי קפיץ כדי לקצץ את הלבלבים במשך שתי עד שלוש דקות עד להשגת חתיכות רקמה דקות, והשעיו את חלקי הרקמה בתוך שני עד שלושה מיליליטר של תמיסת PBS BSA DNase I קרה שהוכנה טרי.באמצעות פ pipette של 10 milliliter, העבירו את החלקים לפרועת קונית של 50 milliliter והוסיפו מספיק PBS BSA DNase I כדי להביא את הנפח הכולל ל-10 milliliter. לאחר מכן, הוסיפו לרקמות 350 עד 450 microliters של collagenase B. הניחו את הפרועת במקלח מים בטמפרטורה של 37 degree Celsius למשך שמונה דקות, תוך ערבוב סיבובי כל שלוש עד ארבע דקות.בסיום הדגירה, השתמשו במזרק של 10 מיליליטר עם מחט במידה 16.5 כדי לשאוב ולאחר מכן להתיז את תמיסת הרקמה לאורך דופן המבחנה בנפח 50 מיליליטר בטמפרטורת החדר שבע פעמים. לאחר מכן, החזירו את הרקמות לאמבט המים למשך שמונה דקות נוספות תוך ערבול קל מדי פעם, ולאחריהן שבעה מחזורים של שאיבה והתזה באמצעות המזרק, כפי שהודגם. לאחר השבירה המכנית האחרונה, העבירו מנה של 10 מיקרוליטר מתלי התאים אל פטריה יבשה ואשרו את נוכחותם של תאים בודדים ומקבצי תאים קטנים תחת מיקרוסקופ אור הפוך בניגוד מופע (phase contrast) עם עדשה אובייקטיבית של 10x.בשלב הבא, הנח את המבחנה על קרח והשלם את הנפח הכולל ל-50 milliliters באמצעות PBS BSA DNase I. סבב את התאים בצנטריפוגה, והשתמש בפיפט P1000 כדי להחזיר את המשקע לסuspended ב-5 milliliters של PBS BSA DNase I קר. לאחר מכן, סנן את התאים דרך מסנן רשת ניילון של 70 micron ולאחריו מסנן רשת ניילון של 40 micron לתוך מבחנה קונית חדשה מ-polypropylene בנפח 50 milliliters. כוונן את הנפח ל-5 milliliters של PBS BSA DNase I, וספור את התאים. לאחר מכן, מהלל את תרחיף התאים הבודדים לריכוז סופי של 2 × 10⁷ תאים ל-milliliter ב-PBS BSA DNase I קר על קרח.על מנת לבצע צביעה אימונוהיסטוכימית של מושבות לבלב שגודלו במצע חצי-מוצק המכיל מתילצלולוז, הכינו תחילה פיפטת פסטור מזכוכית עם פתח צר באמצעות מבער בונסן. לאחר מכן, חברו את הקצה הקטן של טיפ פיפטה של 1 ml לקצה אחד של צינור גומי דפלק, ואת פיית השאיבה לקצה השני. חברו את פיפטת הפסטור מזכוכית לקצה הרחב של טיפ הפיפטה.לאחר מכן, שאבו 10 עד 50 µL של מצע DMEM/F12 עם 1% מתילצלולוז לתוך פיפטת פה. כעת, הניחו את צלחת המושבות על במה של מיקרוסקופ פאזה הפוך והשתמשו בעדשה של 10x כדי למצוא מושבות מתאימות לבחירה. לאחר מכן, מקמו את פתח הפיפטה לצד המושבה הרצויה, והפעילו שאיבה איטית באמצעות הפה כדי לבחור מושבה בודדת.לצורך איסוף יעיל, חשוב לוודא שהמושבה המדוברת נמצאת במיקוד לפני הצבת פתח הפיפטה מזכוכית לצד צבר התאים. לאחר קצירת המושבה, הכניסו את קצה הפיפטה לבאר אחת בלוח של 96 בארות המכיל 4% paraformaldehyde והשקיפו את המושבה לתוך הבאר. לאחר איסוף כל המושבות, קבעו את המושבות למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס תוךما ניעור עדין.בבוקר למחרת, שטפו את המושבות פעמיים ב-PBS למשך 10 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר. מנקודה זו ואילך, העבירו את המושבות באמצעות פיפטת P10 פלסטית עם טיפ כפוף. לאחר השטיפה השנייה, שמרו את המושבות המקובעות למשך לילה בתוך מבחנות של 1.5 מיליליטר מלאות בפאראפין בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, העבירו את המושבות לבארות בודדות בלוח שחור בעל 96 בארות עם תחתית שקופה, המכיל 200 µL של תמיסת חסימה (blocking buffer) לכל באר. הדגרירו את הלוח למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C עם ניעור עדין. למחרת בבוקר, העבירו את המושבות לבארות חדשות המכילות 200 µL של הנוגדן הראשוני הרלוונטי לדגירה נוספת למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C עם ניעור עדין.בבוקר למחרת, העבירו את המושבות לשלושה בארות עוקבות המכילות 200 µL של PBS בתוספת 0.1% Tween 20 לשטיפות של 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר השטיפה השלישית, העבירו את המושבות לבארות נקיות המכילות 200 µL של הנוגדן המשני המתאים, ודגרו את הפלטה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים בחשיכה. בסיום הדגירה, שטפו את המושבות שלוש פעמים ב-PBS Tween כפי שהודגם זה עתה, והעבירו את המושבות לבארות חדשות עם DAPI למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, רכזו את המושבות הצבועות אימונוהיסטוכימית בתוך פטרי עם תחתית זכוכית בקוטר 35 מילימטר וכסו אותן בכיסוי זכוכית. לבסוף, דגמו את המושבות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי. ניתן להעשיר תאי אב ללבלב בוגרים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) תוך שימוש בפרמטרי סינון (gating) מתאימים, מכיוון שהיכולת ליצור מושבות נמצאת רק בתאים ניתביים חיוביים ל-CD133 Sox9/EGFP.ניתן לסווג את המושבות הלבלביות בהתאם למורפולוגיות שלהן באמצעות מיקרוסקופיית אור בניגודיות פאזה הפוכה. לאחר ברירה ידנית, ניתן לנתח את המושבות גם באמצעות ניתוח qRT-PCR מיקרופלואידי לבדיקת ביטוי גנים, או באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית של דגימה שלמה (whole mount immunostaining) לבדיקת ביטוי חלבונים. למעשה, מושבות בודדות רבות מבטאות סממני שושלת לתאי צינורית, תאי אנדוקרין ותאי אצינרי, למשל, מה שמעיד על כך שמרבית התאים הקדמונים המקימי מושבות לבלביות עבור מושבות אלו הם טרי-פוטנטיים.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להשלים את הליכי הדיססקציה, הדיסוציאציה, צביעת התאים והמיון, והזריעה של התאים למצע חצי-מוצק המכיל מתילצלולוז בתוך שש עד שבע שעות, במידה שהם מבוצעים כראוי. בעקבות היווצרות המושבות, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון quantitative RT-PCR, western blot או בדיקות הפרשת אינסולין כדי לענות על שאלות נוספות לגבי ביטוי הגנים או היכולות התפקודיות של המושבות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה בידיכם הבנה טובה של אופן הדיסוציאציה של לבלב עכבר בוגר וכיצד לאפיין מושבות של תאי פרוגניטור לבלב שנוצרו בתרביות חצי-מוצקות המכילות מתילצלולוז.

in-vitro-colony-assays-for-characterizing-tri-potent-progenitor-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

Assay תלת מימדי המאפשר clonogenic הלבלב כמו אבות להתמיין אינסולין להביע המושבות מתואר. שיטה זו מנצלת חצי מוצק מדיה המכילה גורמים, methylcellulose Matrigel וצמיחה, שבו אבות יחיד להתרבות...

Assay כמותי עבור אינסולין להביע המושבה יוצרי אבות

המחקר הנוכחי מתאר גישה בידול מכוון של גרימת הבחנה הלבלב של בתאי גזע עובריים אנושיים. חשיבות רבה היא מציאת תא האנדותל שיתוף תרבות מתווכת ההבשלה של תא גזע עובריים אנושיים נגזר אבות לתאי הלבלב אינסולין המבטאים.

תא האנדותל שיתוף תרבות מתווכת ההבשלה של עובריים אנושיים לתאי גזע לאינסולין בתאי לבלב הפקת בגישה הבחנה בימוי

פרוטוקול לבודד, אשכולות תאי איון התרבות, ותמונה (ICCS) שמקורם בתאי לבלב עובריים אנושיים מתואר. השיטה מפרטת את הצעדים הדרושים כדי ליצור ICCS מרקמות, תרבות כמו monolayers או בהשעיה כאגרגטים, ותמונה לסמנים של התפשטות וגורל החלטות תא לבלב.

בידוד, תרבות והדמיה של צבירי תאים עוברי האנושי לבלב

שיטת התרבות תלת ממדים שתוארה בפרוטוקול זה משחזרת פיתוח לבלב מאבות מפוזרים עוברי לבלב של עכבר, כולל הרחבתן משמעותית, בידול והמורפוגנזה לתוך איבר מסועף. שיטה זו ניתנת להדמיה, התערבות ומניפולציה תפקודיות של הנישה.

במבחנה הלבלב Organogenesis ממפוזר אבות עכבר עובריים

כאן אנו מתארים פרוטוקול 4 שלבים להבדיל מתאי גזע עובריים אנושיים כדי NKX6-1 + אבות לבלב במבחנה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של שורות תאי גזע אנושיים pluripotent.

בידול יעיל של pluripotent בתאי גזע כדי NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; אבות הלבלב

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר אינסולין לבטא 3D מאתר pancreatoids בין לתרשים e10.5 הפומבית אבות הלבלב מזנכימה המשויך את...

דור של אינסולין נטולת לגרדום, תלת מימדי לבטא Pancreatoids העכבר אבות הלבלב במבחנה

פרוטוקול זה מציג השוואה בין שני פרוטוקולי אינדוקציה שונים להבחנה בין תאי גזע עיסת שיניים אנושית (hDPSCs) כלפי שושלות הלבלב במבחנה: הפרוטוקול האינטגרטיבי והפרוטוקול הלא אינטגרטיבי. הפרוטוקול האינטגרטיבי מייצר יותר תאים המייצרים אינסולין (IPCs).

במבחנה אינדוקציה של תאי גזע עיסת שיניים אנושית לכיוון שושלות הלבלב

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה משופרת להגברת הביטוי המשותף של פקטורי שעתוק PDX1 ו-NKX6.1 באבות לבלב שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) בחד-שכבתיים מישוריים. זה מושג על ידי חידוש המטריצה הטרייה, מניפולציה של צפיפות התא, וניתוק התאים האנדודרמליים.

התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים למבשרי תאי בטא בלבלב במערכת תרבית דו-ממדית

התמיינות תאי גזע לתאי איון מספקת פתרון חלופי לטיפול קונבנציונלי בסוכרת ולמידול מחלות. אנו מתארים פרוטוקול מפורט של תרבית תאי גזע המשלב ערכת התמיינות מסחרית עם שיטה שאושרה בעבר כדי לסייע בייצור איים מפרישי אינסולין שמקורם בתאי גזע בצלחת.

התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לצברי איים מייצרי אינסולין

מאמר זה מציג פרוטוקול להתמיינות מכוונת וניתוח פונקציונלי של תאים דמויי תאי β. אנו מתארים תנאי תרבית אופטימליים ומעברים עבור תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לפני יצירת תאי לבלב מייצרי אינסולין. ההתמיינות בת ששת השלבים מתקדמת מיצירת אנדודרם סופית לתאים פונקציונליים דמויי תאי β המפרישים אינסולין בתגובה לגלוקוז.

פרוטוקול אופטימלי ליצירת תאים תפקודיים מפרישי אינסולין בלבלב מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

אנו מספקים פרוטוקול זעיר-פולשני להשתלה תוך-שרירית של איי תאי גזע לבלב שמקורם בתאי גזע אנושיים לעכברים חסרי חיסון, לצורך השתלה ב-in vivo וניתוח בהמשך הזרם.

השתלה תוך-שרירית של תאי גזע פלוריפוטנטיים במקור תאי גזע בלבלב בעכברים

למדו איך לאפיין מושבות תאים מקדם-לבלב מבודדים מלבלב מבוגרים בעכברים באמצעות מבחני מושבה בתלולית מתיל עם מצע חצי-מוצק. שיטות אלו מאפשרות חקר התחדשות עצמית והתמיינות של תאים בודדים.

מבחני מושבת Vitro לאפיון ובתאי Tri-עצמה מבודדת מלבלב Murine למבוגרים

גלה סרטונים נוספים