דור של אפיתל דרכי נשימת עכבר נגזרות ESC תאי שימוש decellularized פיגומי ריאות

המטרה הכוללת של הליך זה, היא לכוון את ההתמיינות של תאי גזע עובריים של עכברים לתאי אפיתל בוגרים של דרכי הנשימה, באמצעות תרבית תלת מימדית שהוקמה עם פיגומי ריאה נטולי תאים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום התפתחות הריאות, כגון תפקיד התכווצויות מטריצת התאים ואיתות גורם גדילה במהלך התמיינות שושלת הריאות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת במערכת תרבית תלת מימדית בסביבה מוגדרת ללא סרום, ומשיגה בידול אפיתל חזק של דרכי הנשימה עם זיהום מוגבל משושלות אנדודרם אחרות. לאחר המתת חסד של חולדת וויסטאר בוגרת, על פי פרוטוקול הטקסט, אבטח את החיה למשטח ניתוח על ידי קיבוע כפות הרגליים הקדמיות והרגליים האחוריות, והשתמש באתנול 70% כדי לרסס במורד החזה והבטן. צור חתך ממש מתחת לכלוב הצלעות. חותכים את העור וחושפים את הסרעפת. לאחר מכן, בצע חתכים קטנים דרך הסרעפת, כדי לגרום לריאות לסגת, ולהפחית את הסיכוי לנקב את הריאות. לאחר מכן, צור חתך אנכי לאורך עצם החזה, ופתח את חלל בית החזה כדי לגשת ללב ולריאות. לאחר מכן, בעזרת תפר, קשרו את הווריד הנבוב התחתון, והשתמשו במספריים קטנים כדי למקם חתך קטן בפרוזדור השמאלי. בעזרת מזרק מוכן של 10 מ"ל עם מחט בגודל 25 מלאה בתמיסת מלח Hank's Balance Heparinized, התחל זלוף ריאות על ידי החדרת המחט לחדר הימני, ודחף את המאגר דרך מחזור הדם הריאתי. המשיכו בזלוף עד שהריאות הופכות ללבנות, והנוזל הזורם מהפרוזדור השמאלי מתבהר. לאחר הזלוף יש לחשוף את קנה הנשימה ולבצע חתך קטן ליד סחוס בלוטת התריס לצורך צינור. לאחר מכן, בעזרת קטטר פלסטיק, יש לנקב את קנה הנשימה ולהשתמש בתפר כדי לאבטח אותו במקומו. כעת, הגדר מערכת זלוף כבידה על ידי קיבוע מזרק 10 מ"ל למעמד ומהדק. לאחר מכן, הסר והשליך את בוכנת המזרק. אבטח את נקודת המילוי המקסימלית על חבית המזרק בגובה 20 ס"מ מעל הריאות, ולאחר מכן חבר פקק דו כיווני לקצה המזרק, וצינור פלסטיק ארוך לקצה השני של תא העצירה. משוך בעדינות את הקטטר מקנה הנשימה, והצמד לקצה צינור הפלסטיק. לאחר מכן, שפכו תמיסת דה-סלולריזציה לתוך המזרק ואפשרו לתמיסה למלא לחלוטין את צינורות הפלסטיק והצנתר המצורפים. הנח את הצנתר המלא בתמיסה בחזרה לקנה הנשימה ושטוף את הריאות על ידי מילוי לקיבולת ריאות כוללת למשך דקה אחת. לאחר מכן הסר את הקטטר מקנה הנשימה כדי לאפשר לנוזל לזרום החוצה מהריאות. חזור על שטיפת הריאות שמונה פעמים עם תמיסת דה-סלולריזציה, ולאחר מכן עשר שטיפות עם PBS. הריאות ייראו לבנות עם השלמת שלבי השטיפה. ואז לנתח את קנה הנשימה והריאות מחלל הצוואר והחזה. הסר רקמות עודפות מהריאות המנותחות, כולל הוושט והלב, ולאחר מכן העביר את הריאות ל-PBS קר עד להכנה לחתך ויברטום. להכנת חלקים עבים, הכינו כ-15 מ"ל של 2% ו-4% נקודת התכה נמוכה ב-PBS, ומספיק 6% אגרוז להטמעת כל האונות בבלוקים מלבניים קטנים. לאחר העברת האגרוז לצינורות של 15 מ"ל, הניחו את הצינורות על גוש חום ושמרו על הטמפרטורה מעל 40 מעלות צלזיוס כדי למנוע ג'ל. בעזרת מספריים קטנים, נתחו את הריאה המנוטרלת בקצה כל סימפונות לובר, ונתקו כל אונה. לאחר מכן השתמש ביריעות סופגות כדי להסיר עודפי PBS, והעביר את האונות ל-2% אגרוז על בלוק החימום למשך חמש דקות לציפוי הרקמה. לאחר העברת כל אונה לצלחת פטרי, מניחים את המנה על צלחת קרה ומניחים למשטח לג'ל למשך דקה. מניחים בעדינות את האונות לאגרוז 4%, ולאחר דגירה של חמש דקות וקירור, חוזרים על הציפוי עם אגרוז 6%. לאחר הציפוי, השתמש בתבניות בסיס מתכת כדי להטמיע כל אונה בנפרד ב-6% אגרוז, כאשר לפחות 3 מ"ל של אגרוז מקיף את הרקמה מהקצוות. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים, כוונו כל אונה על ידי מיקום הקצה השטוח הגדול ביותר של הרקמה על פני תבנית המתכת הפונה לנסיין, והשלימו את ההטבעה באמצעות קלטות פלסטיק. הניחו לבלוקים להתג'ל על צלחת קרה לפחות 30 דקות לפני חתך הוויברטום. לחלופין, אחסן את הבלוקים בתא לח עד 12 שעות בארבע מעלות צלזיוס לפני חתך הוויברטום. להכנת חלקים, הגדר את הוויברטום על ידי מילוי תא החיתוך ב- PBS קר. הקימו אמבט קרח מסביב כדי לשמור על טמפרטורה קרה לאורך כל החתך. כעת, הסר את הבלוקים מתבניות המתכת, והשתמש בסכין גילוח כדי לקצץ את עודפי האגרוז המקיפים את האונות, תוך שמירה על כשלושה מילימטרים מקצה הרקמה. בעזרת דבק, קבע את הרקמה למרכז צלחת הדגימה, וטבל את הצלחת בתא החיתוך המלא PBS. טען את להב החיתוך על הוויברטום. הגדר את גבולות החיתוך בוויברטום, על ידי בחירת ערכי המהירות, המשרעת והעובי הבאים בהתאמה. חתכו כל אונה לחלוטין, ואם החלקים אינם נפרדים לחלוטין זה מזה, השתמשו במספריים קטנים כדי לחתוך ידנית את החלקים חופשיים. לאחר מכן, אוספים בעדינות קטעי פיגומים ומעבירים ל-PBS קר. בעזרת מלקחיים יש לשחרר בעדינות כל חלק מהאגרוז שמסביב. כדי לטהר קטעי פיגומים, לאחר העברתם מ-PBS לצינורות מיקרו-צנטריפוגה, הוסף 90 יחידות למיליליטר נוקלאז ב-PBS, ודגירה על מסובב בטמפרטורת החדר למשך 12 עד 24 שעות. לאחר העברת חלקים לצינורות מיקרו-צנטריפוגות חדשים, על פי פרוטוקול הטקסט, בתנאים סטריליים מוסיפים תמיסה אנטי-מיקרוביאלית, ודוגרים על מסובב בטמפרטורת החדר למשך שש שעות. לאחר מכן, בתנאים סטריליים, השתמש ב-PBS כדי לשטוף את הפיגומים פעמיים ולהעביר אותם למדיום נטול סרום, או SFDM, לפני הזריעה בתאים. כדי להקים תרבית ממשק נוזלי אוויר, השתמש במלקחיים סטריליים כדי להניח ממברנות הידרופוביות על צלחת פטרי. לאחר מכן, העבירו כל קטע פיגום מפוזר מ-SFDM לממברנה, וודא שהחלקים מפוזרים באופן שווה על הממברנה. הכינו שש או שתים עשרה צלחות באר על ידי מילוי בארות ב -1 מ"ל או 0.5 מ"ל SFDM בהתאמה. לאחר מכן, הניחו בעדינות את הממברנות לתוך הבארות, ואפשרו לממברנה לצוף על גבי המדיום וליצור תרבית נוזלי אוויר. כדי לזרוע פיגומים תלת מימדיים, לאחר הכנת תאים אנדודרמליים ומיון תאים מופעל פלואורסצנטי, כדי להעשיר לאנדודרם סופי, השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את התאים הממוינים. לאחר מכן סובב את התאים ב -400 G למשך חמש דקות. באמצעות SFDM, השעו מחדש את התאים הגלולים לכ-100,000 תאים ב-10