Name: דור של אפיתל דרכי נשימת עכבר נגזרות ESC תאי שימוש decellularized פיגומי ריאות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: למד שיטה להפקת תאי אפיתל דרכי נשימה בשלים מתאי גזע עובריים של עכבר באמצעות פיגומי ריאה מופחתי-תאיות תלת-ממדיים. הפרוטוקול משתמש בתנאי תרבית מוגדרים ללא סרום לייעול תהליך ההתמיינות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מבקשים להודות לד&quot;ר Rossant וד&quot;ר Bilodeau עבור ESC mCherry Nkx2-1 השתמש בניסויים מתוארים איורים 1-3. FACS בוצע במתקן cytometry זרימת SickKids-פתאום?. עבודה זו נתמכה על ידי הפעלת מענקים מהמוסד הקנדי לבריאות מחקר ומענק תשתית (CSCCD) מן הקרן הקנדית של חדשנות.

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ועדת טיפול בבעלי חיים של החולים מכון המחקר לילדים חולים. 1. הכנת פיגום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Decellularization של ריאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים חולדות Wistar מבוגרות באמצעות CO 2 קאמריים. מניחים חיה בתא ולהתחיל 100% חשיפה CO 2 בקצב המילוי של 10-30% של נפח תא לדקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים חיה לחוסר הכרה; זה יתרחש לאחר כ 2-3 דקות. אם חוסר הכרה אינה מתרחש בתקופה זו, לבדוק את קצב מילוי ואת החותם קאמרי. בעקבות חוסר הכרה, להתבונן בבעלי חיים עבור צבע עיניים דהויים וחוסר הנשימה. אם הן נצפות, לשמור מילוי CO 2 למשך 1-2 דקות ולאחר מכן להסיר מן החי קאמרי עבור הליך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Secure חיה לנתח משטח ידי תיקון קדמי ואת רגליים אחוריות, ולרסס לאורך החזה באזור בטן עם אתנול 70%. גש לב luNGS ידי פתיחת חלל בית החזה באמצעות חתך אנכי לאורך עצם החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא חתכים קטנים דרך הסרעפת הראשון לגרום הריאות לחזור בו, ומפחית את הסיכוי ניקוב הריאות. ולקשור את הווריד הנבוב הנח עם תפר ומקום חתך קטן אטריום השמאל במספריים לנתח קטנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק 10 מ&quot;ל מוכן עם מחט 25 G מלאים תמיסת מלח מאוזנת של heparinized האנק (HBSS) (10 הפרין U / ml ב HBSS), להתחיל זלוף ריאות ידי החדרת מחט לתוך החדר הימני לדחוף למאגר דרך מחזור הדם הריאתי (בשיעור של 2 מ&quot;ל / דקה). המשך הליך זה עד הריאות להלבין והנוזל זורם מן הפרוזדור השמאלי פועל ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות זלוף, לחשוף את קנה הנשימה cannulate עם קטטר פלסטיק ליד סחוס התריס ומאובטח במקום עם תפר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מערכת זלוף הכבידה על ידי תיקון מזרק 10 מ&quot;ל ל עמדה תשובה ו מהדק. הסר דהבוכנה במזרק iscard. אבטח את נקודת המילוי המרבית על חבית מזרק ב 20 סנטימטרים מעל הריאות. צרף שסתום דו כיווני עד הסוף של המזרק, וכן צינורות פלסטיק ארוך אל הקצה השני של ברזלים לאספקת פתרון decellularization אל קנה הנשימה cannulated. יוצקי פתרון לתוך מזרק ולאפשר פתרון למלא צינורות ו קטטר פלסטיק מצורפים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטיפה הריאות על ידי מילוי עד אפס מקום ריאות הכולל (כ -12 מ&quot;ל) עבור 1 דקות ולהסיר את הקטטר פלסטיק מקנה הנשימה כדי לאפשר לנוזל לזרום אל מחוץ לריאות. אין למלא מזרק יותר מ -10 מ&quot;ל כאשר lavaging הריאות כדי לשמור על לחץ מתחת ל -20 ס&quot;מ של H 2 O. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטיפה חוזרת של הריאות שמונה פעמים עם פתרון decellularization, ואחריו 10 שטיפות עם בופר פוספט (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנתחים את קנה הנשימה והריאות חינם מחלל הצוואר והחזה ולהסיר מן החיה. שמור רקמות בקור PBS ב 4 ° C עד כהכנה vibratome sectioning. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דור סעיף עבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כ 15 מיליליטר של 2% ו -4% (w / v) agarose, ומספיק 6% (w / v) agarose להטבעה כל האונות לגושים מלבניים קטנים. ממיסים אבקת נקודת התכה נמוכה agarose ב PBS על ידי במיקרוגל. מעבירים את agarose 50 מ&quot;ל צינורות על גוש חום ולשמור הטמפרטורה מעל 40 מעלות צלזיוס, כדי למנוע gelling. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח ריאות decellularized בסוף כל הסמפונות אוֹנִי לנתק כל אונה (גולגולתי, באמצע, אבזר, ואת אונות תקינה זנב והאונה השמאלית) באמצעות מספריים קטנים. פט לייבש כל אונה באמצעות יריעות סופגות להסיר PBS העודף ומניח בתוך 2% (w / v) agarose תוך כדי לחסום החימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כל אונה לאחר 5 דקות של ציפוי agarose, ומניח בצלחת פטרי לאפשר למשטח ז&#39;ל 1 דק &#39;על צלחת קרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות במקום אונות בחזרה ל -4% (w / v) agarose, מגניב אחרי 5 דקות, וחזור ציפוי פעם נוספת עם 6% (w / v) agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שיתוף רציףating של כל אונה, להטביע כל אונה בנפרד 6% (w / v) agarose באמצעות תבניות בסיס מתכת עם לפחות 3 מ&quot;מ של agarose סביב הרקמות מן הקצוות. אוריינט כל אונה באמצעות מלקחיים על ידי צבת הקצה השטוח הגדול האונה על פני השטח של עובש מתכת מול הנסיין. קצה זה יהיה בצד קבוע לצלחת הדגימה עבור חתך vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר גושי ג&#39;ל על צלחת קרה לפחות 30 דקות לפני חתך עם vibratome. בלוקים חנות בתא humidified עד 12 שעות ב 4 ° C לפני חתך vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את vibratome ידי מילוי תא חתך עם קר PBS 12. לשמור על טמפרטורה קרה לאורך חתך עם אמבט הקרח שמסביב. הסר בלוקים מתבניות מתכת ולהשתמש בסכין גילוח כדי לקצץ agarose עודף סביב אונות, תוך שמירה על כ 3 מ&quot;מ מהקצה של הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן רקמות במרכז צלחת הדגימה באמצעות דבק, לצלול לתוך צלחת tהוא PBS מלא קאמרי חתך. הגדרת חתך גבולות על vibratome ידי בחירת מהירות, משרעת הבאים, וערכי עובי בהתאמה: 0.2 מ&quot;מ / sec, 1.85 מ&quot;מ, ו -350 מיקרומטר. הערה: שני סעיפים אורכים ואת הרוחבי של אורינטצית אונת כשרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף כל אונה לחלוטין. ידני לחתוך קטעים בחינם באמצעות מספריים קטנים אם קטע אינו מופרדים באופן מלא על ידי להב בסוף רצף הסעיף. אסוף סעיפי פיגום בעדינות ולשמור ב PBS על קרח עד לשלב הבא. הערה: ייתכן שחלקים שנוצרו תכלול הוא הריאה הפרוקסימלי דיסטלי באזורים והמקורות שניהם יכולים לשמש recellularization; עם זאת, רוב השטח יקיפו ריאות דיסטלי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיהור סעיפי פיגום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את 350 מיקרון סעיפים פיגום עבה מ PBS על צינורות microcentrifuge (עד 30 סעיפים / צינור) ולטפל עם nuclease (90 U / ml ב PBS) (ראה רשימה של חומרים) במשך 12 - 24 שעות ב RT, עלהכתף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הטיפול nuclease, סעיפים העברה באמצעות מלקחיים כדי צינורות microcentrifuge חדש ולטפל עם פתרון מיקרוביאלית (200 U / סטרפטומיצין פניצילין מ&quot;ל ו -25 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​amphotericin B ב PBS) בתנאים סטריליים עבור 6 שעות ב RT, על הכתף. הערה: ניתן לאחסן פיגומים בתמיסה נגד חיידקים לשימוש עד שבוע ב 4 ° C לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צעד הטיהור עם פתרון מיקרוביאלית, לשטוף פיגומי פעמים עם PBS בתנאים סטריליים ולהעביר סרום תקשורת בידול חינם (SFDM) לפני זריעה עם תאים. </li></ol></li></ol> 2. תא Endodermal כן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Endoderm אינדוקציה Definitive <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על קווי ESC העכבר תחת תרבות חופשית מזין ללא, סרום באמצעות תנאים 2i 13. התחל אינדוקצית האנדודרם ידי הסרת תאי מתרבות פלוריפוטנטיים חסידות ידי trypsinization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים SFDM וזרעי בצפיפות של 20,000תאים / מיליליטר צלחות חסידות נמוכות במשך שלושה ימים ללא שינוי תקשורת כדי לאפשר היווצרות EB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלושה ימים להעביר את EBS בעדינות לתוך 50 מ&quot;ל צינורות חרוטים בעזרת פיפטה 10 מ&quot;ל ולאפשר להם לאסוף בתחתית 3 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות תקשורת לשאוב ולהוסיף תקשורת SFDM טריה בתוספת 50 א Activin ng / ml </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע חזרה לצלחות החסיד הנמוכות ביחס של 1: צפיפות 2 והתרבות במשך שלושה ימים נוספים כדי להשיג בידול האנדודרם סופי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עשרת האנדודרם מכריעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף יום 6 EBS, לנתק עם טריפסין תווית עבור c-kit וביטוי CXCR4 באמצעות נוגדנים ניאון מצומדות 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין תאים שכותרתו באמצעות מיון תא מופעל פלואורסצנטי (FACS) לביטוי של שני הסמנים כדי להשיג אוכלוסייה האנדודרם סופית מועשרת 15. </li></ol></li></ol> 3. הגדרת Recellularization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממשק אוויר נוזליהתקנת התרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כל סעיף פיגום decellularized (שלב 1.2.9) מ SFDM על קרום צף הידרופובי (8 מיקרומטר גודל נקבובי) באמצעות מלקחיים סטרילית. ודאו סעיפי פיגום מפוזרים באופן שווה על הממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 6- או 12-גם צלחות ידי מילוי בארות עם 1 או 0.5 מיליליטר של SFDM, בהתאמה. בעדינות במקום ממברנות לתוך בארות, המאפשר הממברנה לצוף על גבי מדיה, יצירת התקנת תרבות אוויר נוזלית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זריעה של פיגומי 3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות FACS עבור סמנים האנדודרם סופי (שלב 2.2.2) לספור תאים ממוינים באמצעות hemocytometer, ספין למטה ב 400 XG במשך 5 דקות ו resuspend ב SFDM. Resuspend תאים להשיג נפח המכיל כ 100,000 תאים / 10 μl / הפיגום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי recellularize פיגומים, פיפטה 10 μl של תאים ישירות על כל מקטע מוכן משלב 3.1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלף תקשורת SFDM בתרבויות כל 48 שעות. לשאוב את המדיה הישנה ידי החזיק את הצלחת ב בשיפוע קלכדי למנוע שיבוש התרבות. לאט לאט מוסיף SFDM טרי לתרבות לאורך דופן הבאר כדי למנוע שקיעה של קרום צף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על תרבויות נוזלי אוויר לתקופה של עד 21 יום כדי להשיג בידול של תאי זרע כדי epithelia דרכי נשימה הבוגרת. הערה: Recellularized ניתן לזהות קטעים מעובדים עבור מכתים רקמות immunofluorescent (IF) מיקרוסקופיה בכל נקודת זמן במהלך תרבית תאים 16. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+Factors%2C+Matrices%2C+and+Forces+Combine+and+Control+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells.</a> Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).</li>
<li>Daley, W. P., Peters, S. B., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+dynamics+in+development+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine.</a> J. Cell Sci. 121 (3), 255-264 (2008).</li>
<li>Ghaedi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-derived+alveolar+epithelium+repopulates+lung+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix.</a> J. Clin. Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).</li>
<li>Huang, S. X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).</li>
<li>Jensen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+lung+de-cellularization+protocol+supports+embryonic+stem+cell+differentiation+in+vitro+and+following+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid lung de-cellularization protocol supports embryonic stem cell differentiation in vitro and following implantation.</a> Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (8), 632-646 (2012).</li>
<li>Longmire, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+purified+lung+and+thyroid+progenitors+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of purified lung and thyroid progenitors from embryonic stem cells.</a> Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).</li>
<li>Wong, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+mature+airway+epithelia+expressing+functional+CFTR+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein.</a> Nat. Biotechnol. 30 (9), 876-882 (2012).</li>
<li>Gilpin, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Lung+Epithelial+Specification+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+on+Decellularized+Lung+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Annal.+Thorac.+Surg%22%5BJournal%5D)">Enhanced Lung Epithelial Specification of Human Induced Pluripotent Stem Cells on Decellularized Lung Matrix.</a> Annal. Thorac. Surg. 98, 1721-1729 (2014).</li>
<li>Cortiella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Acellular+Natural+Lung+Matrix+on+Murine+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation+and+Tissue+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation.</a> Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).</li>
<li>Princivalle, M., De Agostini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+roles+of+heparan+sulfate+proteoglycans%3A+a+comparative+review+in+Drosophila%2C+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental roles of heparan sulfate proteoglycans: a comparative review in Drosophila, mouse and human.</a> Int. J. Dev. Biol. 46, 267-278 (2002).</li>
<li>Thompson, S. M., Jesudason, E. C., Turnbull, J. E., Fernig, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+in+lung+morphogenesis%3A+The+elephant+in+the+room%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+Part+C%2C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate in lung morphogenesis: The elephant in the room.</a> Birth Defects Res. Part C, Embryo Today. 90 (1), 32-44 (2010).</li>
<li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+reproducibility+in+preparing+precision-cut+liver+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices.</a> Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).</li>
<li>Ying, Q. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Fox, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Culture+and+FGF+Signaling+Drive+Differentiation+of+Murine+Pluripotent+Cells+to+Distal+Lung+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Culture and FGF Signaling Drive Differentiation of Murine Pluripotent Cells to Distal Lung Epithelial Cells.</a> Stem Cells Dev. 24 (1), 21-35 (2014).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546(2010).</li>
<li>Shojaie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+lung+scaffolds+direct+differentiation+of+endoderm+to+functional+airway+epithelial+cells%3A+requirement+of+matrix-bound+HS+proteoglycans%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Acellular lung scaffolds direct differentiation of endoderm to functional airway epithelial cells: requirement of matrix-bound HS proteoglycans.</a> Stem Cell Reports. 4, 1-12 (2015).</li>
<li>Kubo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+definitive+endoderm+from+embryonic+stem+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture.</a> Development. 131 (7), 1651-1662 (2004).</li>
<li>Longmire, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Derivation+of+Purified+Lung+and+Thyroid+Progenitors+from+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Efficient Derivation of Purified Lung and Thyroid Progenitors from Embryonic Stem Cells.</a> Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).</li>
<li>Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3D+mouse+embryo+atlas+based+on+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT.</a> Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).</li>
</ol>

אין אינטרסים כלכליים מתחרים להכריז.

הפרוטוקול המתואר כאן מייצר epithelia דרכי נשימת ESC נגזרת בוגר באמצעות פיגומי ריאות טבעיות רק כדי לכוון בידול ללא השלמה אחרת. התקנת תרבות זו מוגדרת, סרום ללא, זול, לשחזור. ללא השלמה גורמת גדילה של תקשורת בידול הבסיס נדרשת. בעבר שיטות שפורסמו להפקת תאי אפיתל ריאות תאים שמקורם גזע השתמשו באסטרטגיות 2 ממדים עם תוספת גורם הגדילה לקדם הגבלת שושלת 3,4,8,18,19. הטכניקה המתוארת כאן יש יתרון על פני שיטות אלה מכמה סיבות, כולל: תנאי תרבות מוגדרת, יעילות בידול גבוהות לתאי דרך נשימה...

בידול בימוי של תאים פלוריפוטנטיים אל שושלת ריאות תלויה אירועים איתות מדויק במיקרו-סביבה של 1,2. בשל האופי הדינמי של תהליך זה כבר מאתגר לחקות את האירועים המדויקים של organogenesis ריאות במבחנה. הדיווחים אחרונים השתמשו באסטרטגיות הגבלת שושלת חכמת צעד עם תוספת גורם גדילה המסיסה של תרבויות דו ממדים כדי להשיג בידול ריאות 3-8. בפרוטוקולי בידול צעד חכם, תאים פלוריפוטנטיים, אם תאי גזע עובריים (ESC) או תאי גזע מושרים, הובדלו ראשון שכבת ניבט האנדודרם הסופית. תאי Endodermal מכן נדחפו אל גורל endoderm קדמי ואילך כדי ובתאים ריאות, כפי שהוגדרו על ידי הביטוי של NKX2-1 גורם שעתוק המכיל homeodomain. אבות ריאות אלה הובדלו נוספים הפרוקסימלית (דרך נשימה) או דיסטלי (alveolar) לתאי האפיתל ריאות wiה המשיכה תוספת גורם גדילה. 2-ממד אסטרטגיות כאלה היו כמה הצלחה ביצירת תאי אפיתל ריאות, אולם ישנם מספר מגבלות כולל יעילות ברורה, זיהום אפשרי משורות endodermal אחרות, חוסר מבנה 3-ממדי (3D), ובחלק ממקרים להשתמש תרבויות מוגדרות עם תוספת בסרום. תרבות של pluripotent או תאים מובחנים על פיגומי ריאות decellularized משמשת יותר ויותר כמו assay כדי להעריך את פוטנציאל ההתחדשות של תאי זרע להרכיב מבני ריאות אפיתל 3,5,6,8,9. תרבות דוחות כאלה זורעים תאים על פיגומים עם גורם הגדילה המשך או בתוספים בסרום. פיתוח ריאות כרוכה החלוקה, הגירה, ביטוי גנים והתמיינות של תאים בודדים בתגובה לגירויים סביבתיים. המטריצה ​​הסלולר הנוספת (ECM) היא סריג של גליקופרוטאינים כי בנוסף לספק תמיכה מבנית, מפנה tissuדואר morphogenesis ידי שילוב והסדרת תהליכים אלה 10,11. באמצעות פיגום ECM הריאות כפלטפורמה טבעית לתרבות endoderm טוב יותר לחקות את המילייה התפתחותי in vivo הריאות, יצרנו תאי גזע אפיתל דרכי נשימת תאים שמקורם בתוך 3D-תרבות מוגדרת הגדרה ביעילות שחזור גבוהות. פיגומי ECM עכברוש ריאות נוצרו על ידי decellularization וכן עכבר ESC שמקורם בתאי endodermal נוצרו ובהמשך זורעים על פיגומים אלה. ביטוי כפול של CXCR4 &amp; חלבוני c-KIT מסמן זהות תא האנדודרם סופית ותאי חיובי לשני Sox2 &amp; ביטוי NKX2-1 המזוהים דרכי נשימה (ריאות הפרוקסימלי) ובתאים. תאי האנדודרם מכריעים היו בתרבית בשעת ממשק נוזל האוויר (ALI) לתקופה של עד שלושה שבועות כדי לייצר תאי אפיתל דרכי נשימה פונקציונלית במבחנה. פרוטוקול זה מקדם בידול שושלת ריאות של definiendoderm מופרזת מוקדם ככל 7 ימים, ציין עם הופעתה של NKX2-1 + / Sox2 + אבות ריאות הפרוקסימלי מוקדם. במשך היום 14 ו -21 של אוכלוסיות תאי אפיתל דרכי הנשימה בוגרות תרבות לצוץ כולל ריסים (TUBB4A +), מועדון (SCGB1A1 +), ואת בסיס (TRP63 +, KRT5 +) תאים עם דמיון מורפולוגית ופונקציונלי כדי איירווייז עכבר ילידים. פרוטוקול זה מדגים את החשיבות של microenvironment 3D-מטריקס להשגת בידול חזק כדי Airway לתאי האפיתל.

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת זלוף</td><td>סיגמא</td><td>H0777</td><td>10 U/ml הפרין</td></tr><tr><td>תמיסת זלוף</td><td>Gibco</td><td>מומסת 14170112</td><td>בתמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS-)</td></tr><tr><td>תמיסת דה-סלולריזציה</td><td>BioShop</td><td>CHA003</td><td>8&nbsp; mM CHAPS</td></tr><tr><td>פתרון דה-סלולריזציה</td><td>סיגמא</td><td>E9884</td><td>25&nbsp; </td></tr><tr><td>פתרון דה-סלולריזציה</td> mM EDTA <td>BioShop</td><td>SOD002</td><td>1&nbsp; תמיסת</td></tr><tr><td>דה-סלולריזציה</td> M NaCl <td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>מומסת ב-PBS</td></tr><tr><td>Benzonase nuclease</td><td>Novagen</td><td>70664-3</td><td>90&nbsp; U/ml בנזונאז נוקלאז&nbsp;</td></tr><tr><td>בנזונאז נוקלאז</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>מדולל</td></tr><tr><td>בתמיסה אנטי-מיקרוביאלית PBS&nbsp;</td><td>ג'יבקו</td><td>15140</td><td>200&nbsp; U/ml פניצילין סטרפטומיצין</td></tr><tr><td>תמיסה אנטי-מיקרוביאלית&nbsp;</td><td>גיבקו</td><td>15290</td><td>25&nbsp; &mu; גרם/מ"ל אמפוטריצין B</td></tr><tr><td>תמיסה אנטי-מיקרוביאלית&nbsp;</td><td>גיבקו</td><td>14190-144</td><td>מדולל</td></tr><tr><td>בטריפסיניזציה של PBS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td>TrypLE</td></tr><tr><td>סרום חופשי מדיית בידול (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>IMDM 2440-053, F12 11765-054</td><td>יחס 3:1 של IMDM וחזיר' s שונה F12 בינוני</td></tr><tr><td>מדיית בידול ללא סרום (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td>תוסף B27 (דילול פי 50)</td></tr><tr><td>מדיית התמיינות ללא סרום (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>תוסף N2 (דילול פי 100)</td></tr><tr><td>מדיית בידול ללא סרום (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>0.05% (Fraction V) אלבומין סרום בקר</td></tr><tr><td>מדיית בידול ללא סרום (SFDM)</td><td>ג'יבקו</td><td>35050-061</td><td>200&nbsp; mM Glutamax</td></tr><tr><td>סרום חומרי התמיינות חופשיים (SFDM)</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td>4&nbsp; &mu; M מונותיוגליצרול</td></tr><tr><td>חומר התמיינות חופשי בסרום (SFDM)</td><td>Sigma</td><td>A4403&nbsp;</td><td>0.05&nbsp; מ"ג/מ"ל חומצה אסקובית</td></tr><tr><td>אינדוקציה אנדודרם</td><td>מו"פ D</td><td>338-AC/CF</td><td>Activin A</td></tr><tr><td>נוגדנים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDH1</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>עכבר, לא מצומד, 1:100</td></tr><tr><td>C-KIT</td><td>BD BIOSCIENCES</td><td>558163</td><td>חולדה, PE-Cy7, 1:100</td></tr><tr><td>CXCR4</td><td>BD Biosciences</td><td>558644</td><td>חולדה, APC, 1:100</td></tr><tr><td>KRT5</td><td>Abcam</td><td>ab24647</td><td>ארנב, לא מצומד, 1:1,000</td></tr><tr><td>NKX2-1</td><td>Abcam</td><td>ab76013</td><td>ארנב, לא מצומד, 1:200</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB300-144</td><td>ארנב, לא מצומד, 1:200</td></tr><tr><td>SCGB1A1</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-9772&nbsp;</td><td>עז, לא מצומד, 1:1,000</td></tr><tr><td>SOX2</td><td>מו"פ D Systems</td><td>AF2018&nbsp;</td><td>עז, לא מצומד, 1:400</td></tr><tr><td>TRP63</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8431</td><td>עכבר, לא מצומד, 1:200</td></tr><tr><td>TUBB4A</td><td>BioGenex</td><td>MU178-UC</td><td>Mouse, לא מצומד, 1:500</td></tr><tr><td>IgG עזים&nbsp;</td><td>חמור Invitrogen</td><td>A-11055</td>, <td>Alexa Fluor 488, 1:200</td></tr><tr><td>עכבר IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21202</td><td>חמור, Alexa Fluor 488, 1:200</td></tr><tr><td>עכבר IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>חמור, Alexa Fluor 647, 1:200</td></tr><tr><td>ארנב IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>חמור, Alexa Fluor 488, 1:200</td></tr><tr><td>IgG ארנב&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31573</td><td>חמור, Alexa Fluor 647, 1:200</td></tr><tr><td><חזק>חומרים אחרים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחות דבקות נמוכות</td><td>Nunc</td><td>Z721050&nbsp;</td><td>לוחות קשירת תאים נמוכים,&nbsp; 6 בארות&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>ממברנות ממשק אוויר-נוזל&nbsp;</td><td>Whatman</td><td>110614</td><td>קרום נוקלאופור הידרופובי, 8&nbsp; &mu; גודל נקבוביות m</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S&nbsp;</td><td>לייקה ויברטום</td></tr><tr><td>דבק רקמות</td><td>טד פלה</td><td>10033</td><td>דבק רקמות פלקו</td></tr></tbody></table>

דור של אפיתל דרכי נשימת עכבר נגזרות esc תאי שימוש decellularized פיגומי ריאות

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

בידול שושלת ריאות מחייב שילוב של רמזים סביבתיים מורכבים הכוללים איתות גורם גדילה, תאי תאי אינטראקציות ויחסי גומלין התא-מטריקס. בשל מורכבות זו, חזרה על התפתחות ריאות במבחנה לקדם התמיינות תאי גזע לתאי האפיתל ריאות כבר מאתגר. בפרוטוקול זה, פיגומים ריאות decellularized משמשים לחקות את הסביבה 3-מימדי של הריאה וליצור תאים בדרכי הנשימה אפיתל גזע תאים שמקורם. תאי גזע עוברי עכבר הם מובחנים ראשונים בשושלת endoderm באמצעות גוף embryoid (EB) שיטת תרבות עם תאי האנדודרם Activin א אז הם זורעים על פיגומי decellularized ותרבותי על ממשק אוויר נוזלי עד 21 ימים. טכניקה זו מקדמת בידול של תאים שנזרעו לתאי האפיתל בדרכי נשימה תפקודיות (תאי ריסים, תאי מועדון, ותאי הבזליים) ללא תוספת גורם צמיחה נוספת. התקנת תרבות זו מוגדרת, Seruמ &#39;חופשי, זול, לשחזור. למרות שיש זיהום מוגבל משורות endoderm הלא-ריאה בתרבות, פרוטוקול זה רק מייצר אוכלוסיות אפיתל דרכי הנשימה ואינו להצמיח לתאי האפיתל מכתשיים. epithelia Airway שנוצר עם פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור אינטראקציות מטריקס התא במהלך organogenesis ריאות עבור מודלים המחלה או פלטפורמות גילוי תרופות של פתולוגיות הקשורות בדרכי הנשימה כגון סיסטיק פיברוזיס.

כפי שמתואר בפרוטוקול זה, בידול חזק של האנדודרם סופי להבשיל דרכי נשימה תא אפיתל יכול להיות מושגת באמצעות תרבות המורחבת של תאים שנזרעו על סעיפי decellularized פיגום ריאות. מומלץ פיגומי decellularized להתאפיין על מנת להבטיח (1) תאי מארחים יוסרו לחלוטין, ו (2) חלבונים תאים מטריקס נשמרים לפני שימוש פיגומים לבידול. Decellularization ניתן להעריך באמצעות מכתים רקמות עם hematoxylin ו eosin (H &amp; E) ו -4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), כפי שמודג...

פרוטוקול זה מפנה ביעילות עכבר גזע עוברי תא נגזרות האנדודרם סופי להבשיל דרכי נשימה תא אפיתל. טכניקת בידול זה משתמשת 3 ממדי פיגומי ריאות decellularized לכוון מפרט שושלת ריאות, באווירת התרבות מוגדרת, סרום ללא.

דור של אפיתל דרכי נשימת עכבר נגזרות ESC תאי שימוש decellularized פיגומי ריאות

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להכווין את הגזירה (differentiation) של תאי גזע עובריים של עכבר לתאי אפיתל בוגרים של דרכי הנשימה, תוך שימוש במערך תרבית תלת-ממדי עם פיגומים של ריאות שעברו דקלולריזציה (decellularized lung scaffolds). שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום התפתחות הריאה, כגון תפקיד התכווצויות המטריקה התאית ואותות גורמי גדילה במהלך גזירת שורת הריאה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא השימוש במערכת תרבית תלת-ממדית בתנאים מוגדרים ללא סרום, והשגת גזירה חזקה של אפיתל דרכי הנשימה עם זיהום מוגבל משורות אנדודרם אחרות. לאחר קטילת חולדה בוגרת מסוג wistar, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, קבעו את בעל החיים למשטח ניתוח על ידי קיבוע כפות הרגליים הקדמיות והרגליים האחוריות, והשתמשו ב-70% ethanol כדי לרסס את החזה והבטן. בצעו חתך ממש מתחת לכלוב הצלעות. חתכו דרך העור וחשפו את הסרעפת. לאחר מכן, בצעו חתכים קטנים דרך הסרעפת, כדי לגרום לריאות לסגת, ובכך להפחית את הסיכון לדקירה של הריאות. בשלב הבא, בצעו חתך אנכי לאורך עצם הסטרנום, ופתחו את חלל בית החזה כדי לגשת ללב ולריאות. לאחר מכן, בעזרת תפר, קשרו את הווריד הנבוב התחתון (inferior vena cava), והשתמשו במספרי ניתוח קטנים כדי לבצע חתך קטן בעלייה השמאלית. באמצעות מזרקה של 10ml מוכנה עם מחט gauge 25 מלאה בתמיסת מלח של Hank's עם הפרין, התחילו את פרפוזיי

generation-esc-derived-mouse-airway-epithelial-cells-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

פיתחנו מטריצה ​​ריאות decellularized תאיים ו bioreactor הרומן biomimetic שניתן להשתמש בהם כדי לייצר רקמת הריאה תפקודית. על ידי זריעת תאים לתוך המטריצה ​​ו culturing ב bioreactor, אנו מייצרים רקמה מדגים חילוף הגזים יעיל כאשר מושתלים in vivo לתקופות קצרות של זמן.

נוהל הנדסה ריאות

בסרטון זה, אנו מדגימים את ההכנה של פיגום ושט חזיר decellularized, עם הארכיטקטורה הביוכימית שלו והרכבו נשמר, עבור יישומים בהנדסת רקמות.

הכנת פיגום ושט חזירי נטול תאים: טכניקה ליצירת פיגום אצלולרי מוושט חזיר

דה-סלולריזציה של איברים שלמים מייצרת פיגומים ביולוגיים טבעיים שעשויים לשמש לרפואה רגנרטיבית. מוצג תיאור של מודל פרימטים לא אנושי של התחדשות ריאות שבו ריאות שלמות עוברות דה-סלולריזציה ולאחר מכן נזרעות עם תאי גזע בוגרים ותאי אנדותל בביו-ריאקטור המאפשר זרימת כלי דם ואוורור מדיה נוזלית.

דה-סלולריזציה של ריאות פרימטים לא אנושיים ורסלולריזציה באמצעות ביו-ריאקטור מיוחד לאיברים גדולים

פרוטוקול זה נועד לבטל את הלב והריאות של עכברים. ניתן לחסן ולדמות את הפיגומים החוץ-תאיים (ECM) המתקבלים כדי למפות את המיקום והטופולוגיה של הרכיבים שלהם.

דקלולריזציה של קומפלקס הקרדיו-ריאות מורין

המאמר מתאר הבחנה מכוונת צעד של תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים לאורגנואידים תלת ממדיים שלמים של ריאות המכילים תאי ריאה אפיתל פרוקסימליים ודיסטליים יחד עם מזנכיים.

ייצור אורגנוידים של ריאות שלמות תלת-ממדיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים למידול ביולוגיה התפתחותית של ריאות ומחלות

פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת רקמות ריאה מהונדסות בקנה מידה קטן הניתנות לשחזור, על-ידי אכלוס מחדש של פרוסות ריאה שעברו דה-תאיזציה מדויקת עם תאי אפיתל מסוג 2, פיברובלסטים ותאי אנדותל.

רקמות ריאה מהונדסות שהוכנו מפרוסות ריאה נטולות תאים

הפרוטוקול מתאר ביוריאקטור התומך בהדמיה המאפשר הסרה סלקטיבית של האפיתל האנדוגני מקנה הנשימה של החולדה והתפלגות הומוגנית של תאים אקסוגניים על פני השטח של לומן, ולאחר מכן תרבית חוץ גופית ארוכת טווח של מבנה רקמת התא.

ביוריאקטור מונחה הדמיה ליצירת רקמת נתיב אוויר מהונדסת ביולוגית

ההתקדמות האחרונה בפרוטוקולי התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם מאפשרת נגזרת מדורגת של סוגי תאים ספציפיים לאיברים. כאן, אנו מספקים שלבים מפורטים לתחזוקה והרחבה של תאי בסיס של דרכי הנשימה שמקורם ב-iPSC והתמיינותם לאפיתל רירית בתרביות ממשק אוויר-נוזל.

יצירת תרביות ממשק אוויר-נוזל של תאי אפיתל דרכי הנשימה מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

מאמר זה מתאר את היצירה של מודל מחסום דרכי נשימה מורכב ורב-תאי המורכב מאפיתל ריאות שמקורו בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC), מזנכימה, תאי אנדותל ומקרופאגים בתרבית ממשק אוויר-נוזל.

תרבית משותפת של תאי אפיתל, מזנכימליים, אנדותלים ומערכת החיסון שמקורה ב-iPSC כדי להדגים את שלמות מחסום דרכי הנשימה בבריאות ומחלות ריאות

מאמר זה מתאר כיצד ליצור ריאות עכבר מהונדסות ביולוגית באמצעות שיטות דה-סלולריזציה ורה-סלולריזציה. הוא גם מפרט השתלת ריאות אורתוטופית לאחר מכן.

השתלת ריאות מהונדסות ביולוגית באמצעות ריאות עכבר נטולות תאים ותאי אנדותל אנושיים ראשוניים

למד שיטה להפקת תאי אפיתל דרכי נשימה בשלים מתאי גזע עובריים של עכבר באמצעות פיגומי ריאה מופחתי-תאיות תלת-ממדיים. הפרוטוקול משתמש בתנאי תרבית מוגדרים ללא סרום לייעול תהליך ההתמיינות.

דור של אפיתל דרכי נשימת עכבר נגזרות ESC תאי שימוש decellularized פיגומי ריאות

גלה סרטונים נוספים