הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח
15 ביוני 2016
פרוטוקול זה מתאר צעדים פרוצדורליים בסיסיים לביצוע הקלטות תיקון- clamp כל תא. טכניקה זו מאפשרת חקר ההתנהגות החשמלית של נוירונים, וכאשר ביצע פרוסות המוח, מאפשר הערכה של פונקציות עצביים שונים מתא עצב שעדיין משולבים מעגלים במוח השתמרות טוב יחסית.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לתאר כיצד לבצע הקלטות של מהדק טלאי של תא שלם בפרוסות מוח שזה עתה נותחו. שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון כיצד מניפולציות בקרה ניסיוניות משנות את הפעילות של נוירונים ספציפיים באזורים מסוימים במוח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מספקת את המדיום לזיהוי תכשיר X vivo שינויים ארוכי טווח בתפקודי הנוירונים שהתפתחו בבעלי חיים ערים שלמים.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תפקודים עצביים בפרוסות מוח, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות, כגון תאים בתרבית ונוירונים in vivo. מי שידגים את ההליך יהיה פרנסיסקו גרסיה-אוסקוס, סטודנט מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בהליך זה, באמצעות פיפטת העברה מפלסטיק, משוך בעדינות פרוסת מוח אחת מתא ההתאוששות.
הנח את פיפטת ההעברה בתא ההקלטה, וסחט בעדינות את הפרוסה מהפיפטה אל בטנת החלקת המכסה בתחתית החדר. לאחר מכן, באמצעות מטרת המיקרוסקופ 4x, מקם את הפרוסה כך שהאזור הרצוי ימוקם בדיוק במרכז תא ההקלטה. לאחר השגת המיקום הרצוי, אבטח את מיקום פרוסת המוח עם אחיזת הפרוסה כלפי מטה, המכונה גם נבל.
לאחר מכן, עבור למטרה 40x, והורד את העדשה בעדינות עד שהיא תיצור קשר עם ה-ACSF בתא. לאחר מכן, השתמש בגלגל הכוונון העדין כדי להביא את הרקמה למיקוד. כאשר המוקד הוא ברמת הרקמה, התבונן בתאים באזור הממוקד.
כעת, חפש תא מטרה. סמן אותו על מסך המחשב על מנת לסייע בהנחיית המיקרו-פיפטה של ההקלטה. הרם את עדשת האובייקט כדי לאפשר מספיק מקום למיקום המיקרופיפטה ההקלטה.
בשלב זה בעזרת מזרק מיליליטר אחד, מחט מיקרו-מזרק לא מתכתית ומסנן ייעודי, מלאו מיקרופיפטה בתמיסה הפנימית שהוכנה מראש. ודא שאין בועות אוויר במיקרופיפטה. לאחר מכן הנח את המיקרופיפטה במחזיק אלקטרודה, כך שהתמיסה תבוא במגע עם אלקטרודת התיל המצופה כלוריד כסף
.הדק את מכסה הפיפטה, כך שמכונת הכביסה של החרוט תיצור אטימה סביב המיקרופיפטה. לאחר מכן, הפעל לחץ חיובי עם המזרק המלא באוויר המחובר למחזיק הפיפטה לפני טבילת המיקרופיפטה ב-ACSF כדי למנוע כניסת פסולת לתוכו. בעזרת המיקרו-מניפולטור, הנח את הפיפטה למטה לתא כך שהיא תהיה בערך מתחת למרכז המטרה השקועה.
תוך כדי הזזת המיקרופיפטה עם המיקרו-מניפולטור במהירות בינונית עד גבוהה, אתרו את המיקרופיפטה על מסך המחשב, והנחו את המיקרופיפטה לעבר מיקום התא על ציר ה-XY. בינתיים, מדוד את התנגדות המיקרופיפטה על ידי הפעלת שלב מתח. הפעל לחץ חיובי על מנת להסיר בועות אוויר או חפצים זרים אחרים החוסמים את המיקרופיפטה.
לאחר ניקוי המיקרופיפטה, בצע היסט מתח כדי להפחית את זרם הפיפטה לאפס. בעזרת גלגל המיקוד העדין של המיקרוסקופ, התחל להתמקד כלפי מטה תוך הורדת המיקרופיפטה בהדרגה. התמקד תמיד תחילה למטה ולאחר מכן הורד את המיקרופיפטה למישור המיקוד כדי להבטיח שקצה המיקרופיפטה לא יחדור בפתאומיות לתוך הפרוסה.
כאשר המיקרופיפטה באה במגע עם פני השטח של הפרוסה, האט את מהירות המיקרו-מניפולטור למצב בינוני נמוך. הפעל בעדינות לחץ חיובי קל כדי לנקות כל פסולת על השביל. לאחר מכן התקרב לתא, או לסירוגין עם כפתורי הבקרה XYZ או על ידי התקרבות באלכסון כאשר שני צירי ה-XZ משתנים עם סיבוב כפתור ציר ה-Z.
כאשר המיקרופיפטה קרובה מספיק לתא, תופיע גומה על פני התא. כעת יש למרוח יניקה חלשה וקצרה דרך הצינור המחובר לצינור היניקה של מחזיק הפיפטה על מנת ליצור איטום. בזמן שנוצר ג'יגה-אטם, השתמש במפקד המגבר הנשלט על ידי מחשב כדי להביא את פוטנציאל החזקת התאים לפוטנציאל המנוחה הפיזיולוגי על מנת למנוע שינויים פתאומיים, ברגע שהממברנה נקרעת.
לאחר היווצרות הג'יגה-אטם, פצו על הקפסיטונים המהירים או האיטיים. כאן חשוב מאוד שהיניקה המופעלת לא תהיה חזקה מדי. אחרת, הממברנה עלולה להיקרע לפני הקמת החותם.
אם האיטום נשאר יציב ומעל ג'יגהום אחד, הפעל יניקה קצרה וחזקה כדי לקרוע את קרום הפלזמה. היניקה חייבת להיות קצרה וחזקה יותר מהלחץ המופעל בעת הקמת איטום. על מנת לקרוע כראוי את הממברנה, ולהשיג תצורה יציבה של תא שלם.
מעבר למצב תא במבחן הממברנה, צפה בפרמטרים שונים של התא, כגון התנגדות כניסה, התנגדות סדרה וקבלי ממברנה. לאחר השגת תצורת התא השלם, המשך לעקוב אחר פרמטרים אלה במהלך ההקלטה. מוצגת כאן, דוגמה לשיפוע ה-EPSCs המעורר ממעטפת גרעין אקומבנס יחיד MSN.
העלאת הטמפרטורה מ-24 ל-28 ול-32 מעלות צלזיוס, מגדילה את השיפוע של EPSCs מעוררים. כאן משרעת ה- EPSCs המעוררת מוערכת במצב מהדק המתח במינוס 80 מילי-וולט. כאשר ההתנגדות הסדרתית גדלה, המשרעת של EPSCS מעורר פוחתת.
והנה, דוגמה לעקבות משני נוירונים המראים את ההשפעה של התנגדות הקלט על יכולת הנוירון לייצר קפיצות. נוירונים מהודקים ומוחזקים במינוס 80 מילי-וולט. כאשר התנגדות הקלט עולה, מספר פוטנציאל הפעולה גדל גם כן.
בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שיצירת פרוסות מוח בריאות היא קריטית. חשוב גם לעקוב אחר הפרמטרים שעשויים להשפיע על צורת הגל של האות החשמלי, כגון התנגדות הסדרה, התנגדות הכניסה והטמפרטורה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב את ההיבט הבסיסי של טכניקת הקלטת תאים שלמים בפרוסות מוח.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את השלבים לביצוע הקלטות patch-clamp בתצורת whole-cell בתוך פרוסות מוח שנותחו לאחרונה. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד את ההתנהגות החשמלית של נוירונים ולהעריך תפקודי נוירונים שונים בתוך מעגלים מוחיים שלמים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
רקע
- הקלטות patch-clamp של תא שלם הן חיוניות להבנת הפעילות הנוירונלית.
- ניתן ליישם שיטה זו על פרוסות מוח, תאים בתרבית ונוירונים in vivo.
- היא מאפשרת לבחון כיצד מניפולציות משפיעות על נוירונים ספציפיים.
מטרת המחקר
- להדגמת הפרוצדורה להקלטות patch-clamp של תא שלם.
- לבחינת תפקודים עצביים בחתכי מוח.
- לספק תובנות לגבי שינויים ארוכי טווח בתפקודי נוירונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דיסקציה של פרוסות מוח מתאי ההתאוששות.
- שימוש בפיפטת העברה פלסטית עם קצה מקוצץ לטיפול בפרוסות.
- ביצוע מניפולציות של בקרת ניסוי.
- הקלטה של פעילות חשמלית של נוירונים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי דפוסי פעילות נוירונלית בחתכי מוח.
- הערכה של האופן שבו מניפולציות ספציפיות משנות את תפקודי הנוירונים.
- תובנות לגבי האינטגרציה של נוירונים בתוך מעגלי מוח.
מסקנות
- הקלטות patch-clamp של התא השלם הן כלי רב עוצמה במדעי העצבים.
- שיטה זו משפרת את ההבנה של התנהגות נוירונלית במערכות שלמות.
- ניתן להתאימה למערכי ניסוי שונים מעבר לפרוסות מוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הקלטות patch-clamp של תא שלם בחתכי מוח מאפשרות מדידה מדויקת של תכונות חשמליות נוירונליות בהקשר רלוונטי פיזיולוגית, ובכך תומכות בהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS). טכניקה זו מספקת נתונים ברמת דיוק גבוהה על האופן שבו מניפולציות פרמקולוגיות או גנטיות משנות את התפקוד הנוירונלי, ובכך תורמת ישירות לתיקוף המטרה ולביטחון החזוי בפיתוח תרכובות נוירו-אקטיביות. הגישה של ה-ex vivo מגשרת על הפער בין בדיקות in vitro למודלים in vivo, ובכך מחזקת את הרצף התרגומי לאורך תהליך הגילוי.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של התגובה הנוירונלית לתרכובות מועמדות או למודיפיקציות גנטיות.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) באמצעות כימות שינויים בתכונות סינפטיות ואינטרינזיות.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד התאמות נוירונליות ספציפיות בעקבות מניפולציות ניסוייות.
- מעניק ביטחון חיזוי לקידום מטרות בעלות חתימות אלקטרופיזיולוגיות חזקות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מבסס הכנות מאומתות של פרוסות מוח לצורך סריקה פרמקולוגית בהמשך.
- מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור, כגון התנגדות קלט (input resistance), התנגדות טורית (series resistance) וזרמים סינפטיים מעוררים.
- מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה לצורך השוואות בין מחקרים שונים ובין תרכובות שונות.
- תומך בהערכה מהימנה של השפעות תרכובות על עירור נוירונלי והעברה סינפטית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מקשר בין ממצאים ex vivo לבין נוירו-אדפטציות in vivo, ובכך תומך בפיתוח ביומרקרים תרגומיים.
- מספק המשכיות משלבי מניפולציות בשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מנגנוני CNS.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם-סיכון המבוססות על תגובות נוירונליות רלוונטיות פיזיולוגית.
- תומך בזיהוי שינויים נוירונליים ארוכי טווח הרלוונטיים למחלה או להתערבות טיפולית.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
טכניקת patch-clamp של תא שלם בפרוסות מוח ממוקמת בין שלב הגילוי המוקדם לבין התיקוף הפרה-קליני, ומאפשרת מחקרים מכניסטיים התורמים הן לבחירת המטרה והן לאופטימיזציה של תרופות מובילות בקווי פיתוח של תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת בחינת השערות על תפקוד נוירונלי ועל מודולציה של מסלולים בעקבות התערבויות ניסוייות.
- סריקה: מספקת פלטים אלקטרופיזיולוגיים כמותיים וניתנים לשחזור לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות ברזולוציה גבוהה של תכונות סינפטיות ונוירונליות אינהרנטיות לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין תובנות מכניסטיות ex vivo לבין התאמות עצביות in vivo, ובכך תומכת בהלימה של ביומרקרים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר לצורך תיקוף מטרות ב-CNS ואפיון תרכובות במגוון תוכניות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ערך תפעולי: מאפשר ביצוע של בדיקות אלקטרופיזיולוגיות סטנדרטיות, הניתנות לשחזור ובקנה מידה רחב.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי אספקת נתונים תפקודיים חזקים בשלבים מוקדמים של התהליך.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בסדירת עדיפויות מותאמת סיכון ובקידום של תוכניות CNS בהתבסס על תוצאות תפקודיות של נוירונים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות והכשרה בתחום האלקטרופיזיולוגיה לצורך רכישת נתונים מהימנה.
- דורש מכשור מדויק, הכולל מגברי patch-clamp ומיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדת בין צוותים שונים לגבי הכנת הפרוסות ופרמטרי ההקלטה.
- התאמה לאזורי מוח שונים או למינים שונים עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- איכות הנתונים רגישה לבריאות הפרוסה, לבקרת הטמפרטורה ולניטור ההתנגדות.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:59
Slice Placement and Visualization
2:15
Micropipette Placement and Positioning
3:45
Final Approach, Seal Formation, and Obtaining the Whole-cell Configuration
5:56
Results: Effect of Temperature, Series Resistance, and Input Resistance on the Waveform of the Electrical Signal
6:47
Conclusion
