Name: הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: למדו כיצד לבצע הקלטות תיקון מהדק כל תא בפרוסות מוח טריות. שיטה זו מאפשרת לחקור את הפעילות החשמלית של נוירונים ולהעריך תפקודים נוירונליים במעגלים מוחיים שלמים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מחקר זה מומן על ידי קרנות ההפעלה Southwestern UT (SK).

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Cahalan, M., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques: an overview.</a> Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).</li>
<li>Staley, K. J., Otis, T. S., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+properties+of+dentate+gyrus+granule+cells%3A+comparison+of+sharp+microelectrode+and+whole-cell+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Membrane properties of dentate gyrus granule cells: comparison of sharp microelectrode and whole-cell recordings.</a> J Neurophysiol. 67 (5), 1346-1358 (1992).</li>
<li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).</li>
<li>Pusch, M., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+diffusional+exchange+between+small+cells+and+a+measuring+patch+pipette%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette.</a> Pflugers Arch. 411 (2), 204-211 (1988).</li>
<li>Kandel, E. R., Dudai, Y., Mayford, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+systems+biology+of+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The molecular and systems biology of memory.</a> Cell. 157 (1), 163-186 (2014).</li>
<li>Kourrich, S., Bonci, A. Chapter 5: Synaptic and Neural plasticity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKourrich%2C+S+%22Neurobiology+of+Mental+Illness.+4th+edn%22">Neurobiology of Mental Illness. 4th edn</a>. , Oxford University Press. (2013).</li>
<li>Mozzachiodi, R., Byrne, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+synaptic+plasticity%3A+role+of+nonsynaptic+plasticity+in+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">More than synaptic plasticity: role of nonsynaptic plasticity in learning and memory.</a> Trends Neurosci. 33 (1), 17-26 (2010).</li>
<li>Zhang, W., Linden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+other+side+of+the+engram%3A+experience-driven+changes+in+neuronal+intrinsic+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The other side of the engram: experience-driven changes in neuronal intrinsic excitability.</a> Nat Rev Neurosci. 4 (11), 885-900 (2003).</li>
<li>Kourrich, S., Calu, D. J., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+plasticity%3A+an+emerging+player+in+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Intrinsic plasticity: an emerging player in addiction.</a> Nat Rev Neurosci. 16 (3), 173-184 (2015).</li>
<li>Luscher, C., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-evoked+synaptic+plasticity+in+addiction%3A+from+molecular+changes+to+circuit+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drug-evoked synaptic plasticity in addiction: from molecular changes to circuit remodeling.</a> Neuron. 69 (4), 650-663 (2011).</li>
<li>McEwen, B. S., Morrison, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+on+stress%3A+vulnerability+and+plasticity+of+the+prefrontal+cortex+over+the+life+course%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The brain on stress: vulnerability and plasticity of the prefrontal cortex over the life course.</a> Neuron. 79 (1), 16-29 (2013).</li>
<li>Sandi, C., Haller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+the+social+brain%3A+behavioural+effects+and+neurobiological+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stress and the social brain: behavioural effects and neurobiological mechanisms.</a> Nat Rev Neurosci. 16 (5), 290-304 (2015).</li>
<li>Kim, S. J., Linden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitous+plasticity+and+memory+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ubiquitous plasticity and memory storage.</a> Neuron. 56 (4), 582-592 (2007).</li>
<li>Ganguly, K., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+neural+plasticity+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent neural plasticity from bench to bedside.</a> Neuron. 80 (3), 729-741 (2013).</li>
<li>Kullmann, D. M., Moreau, A. W., Bakiri, Y., Nicholson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Plasticity of inhibition.</a> Neuron. 75 (6), 951-962 (2012).</li>
<li>Bar-Yehuda, D., Korngreen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Space-clamp+problems+when+voltage+clamping+neurons+expressing+voltage-gated+conductances%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Space-clamp problems when voltage clamping neurons expressing voltage-gated conductances.</a> J Neurophysiol. 99 (3), 1127-1136 (2008).</li>
<li>Williams, S. R., Mitchell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+somatic+voltage+clamp+errors+in+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons.</a> Nat Neurosci. 11 (7), 790-798 (2008).</li>
<li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+for+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments.</a> Methods Enzymol. 207, 123-131 (1992).</li>
<li>Defelice, L. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDefelice%2C+LJ+%22Electrical+Properties+of+Cells-Patch+Clamp+for+Biologists%22">Electrical Properties of Cells-Patch Clamp for Biologists</a>. , Plenum Press. (1997).</li>
<li>Kornreich, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+patch+clamp+technique%3A+principles+and+technical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vet+Cardiol%22%5BJournal%5D)">The patch clamp technique: principles and technical considerations.</a> J Vet Cardiol. 9 (1), 25-37 (2007).</li>
<li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMolleman%2C+A+%22Patch+Clamping%3A+An+Introductory+Guide+To+Patch+Clamp+Electrophysiology%22">Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. (2003).</li>
<li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+patch+clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Am%22%5BJournal%5D)">The patch clamp technique.</a> Sci Am. 266 (3), 44-51 (1992).</li>
<li>Richerson, G. B., Messer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+composition+of+experimental+solutions+on+neuronal+survival+during+rat+brain+slicing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing.</a> Exp Neurol. 131 (1), 133-143 (1995).</li>
<li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> J Neurosci Methods. 171 (1), 118-125 (2008).</li>
<li>Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+studies+in+the+CNS+illustrate+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+neurons+in+rat+brain+slices%3A+glycerol+replacement+of+NaCl+protects+CNS+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons.</a> J Neurosci Methods. 158 (2), 251-259 (2006).</li>
<li>Kourrich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+interaction+between+sigma-1+receptor+and+Kv1.2+shapes+neuronal+and+behavioral+responses+to+cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic interaction between sigma-1 receptor and Kv1.2 shapes neuronal and behavioral responses to cocaine.</a> Cell. 152 (1-2), 236-247 (2013).</li>
<li>Kourrich, S., Klug, J. R., Mayford, M., Thomas, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPAR-Independent+Effect+of+Striatal+aCaMKII+Promotes+the+Sensitization+of+Cocaine+Reward%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">AMPAR-Independent Effect of Striatal aCaMKII Promotes the Sensitization of Cocaine Reward.</a> J Neurosci. , (2012).</li>
<li>Kourrich, S., Rothwell, P. E., Klug, J. R., Thomas, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+experience+controls+bidirectional+synaptic+plasticity+in+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cocaine experience controls bidirectional synaptic plasticity in the nucleus accumbens.</a> J Neurosci. 27 (30), 7921-7928 (2007).</li>
<li>Kourrich, S., Thomas, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+neurons%2C+opposite+adaptations%3A+psychostimulant+experience+differentially+alters+firing+properties+in+accumbens+core+versus+shell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Similar neurons, opposite adaptations: psychostimulant experience differentially alters firing properties in accumbens core versus shell.</a> J Neurosci. 29 (39), 12275-12283 (2009).</li>
<li>Rothwell, P. E., Kourrich, S., Thomas, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+novelty+causes+stress-like+adaptations+at+nucleus+accumbens+synapses%3A+implications+for+studying+addiction-related+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Environmental novelty causes stress-like adaptations at nucleus accumbens synapses: implications for studying addiction-related plasticity.</a> Neuropharmacology. 61 (7), 1152-1159 (2011).</li>
<li>Rothwell, P. E., Kourrich, S., Thomas, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+adaptations+in+the+nucleus+accumbens+caused+by+experiences+linked+to+relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Synaptic adaptations in the nucleus accumbens caused by experiences linked to relapse.</a> Biol Psychiatry. 69 (11), 1124-1126 (2011).</li>
<li>Koya, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+synapses+in+selectively+activated+nucleus+accumbens+neurons+following+cocaine+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Silent synapses in selectively activated nucleus accumbens neurons following cocaine sensitization.</a> Nat Neurosci. 15 (11), 1556-1562 (2012).</li>
<li>Conrad, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+accumbens+GluR2-lacking+AMPA+receptors+mediates+incubation+of+cocaine+craving%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving.</a> Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).</li>
<li>Kruskal, P. B., Jiang, Z., Gao, T., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+patch+clamp%3A+nanotechnologies+for+intracellular+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Beyond the patch clamp: nanotechnologies for intracellular recording.</a> Neuron. 86 (1), 21-24 (2015).</li>
<li>Novak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale-targeted+patch-clamp+recordings+of+functional+presynaptic+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Nanoscale-targeted patch-clamp recordings of functional presynaptic ion channels.</a> Neuron. 79 (6), 1067-1077 (2013).</li>
</ol>

יש אף אחד מהמחברים אינטרסים מתחרים או אינטרסים מנוגדים.

פרוטוקול זה מתאר את ההליך הבסיסי ביצוע ניסויים תיקון- clamp כל תא על נוירונים פרוסות המוח. עם זאת, המורכבות, הפוטנציאל והרגישות של הטכניקה הזו לא יכולים להיות מתוארת בצורה מושלמת במאמר זה. הנה, יש לנו ניסינו להתוות את הצעדים הבסיסיים ביותר מדגיש פרמטרים חשובים חייבים להיות מבוקר להשגת הקלטות מוצלחות וקפדניות כל תא. ללמידה תיאורטיים נוספים, ספרים ומאמרים רבים פורסמו בשני הקלטה כל תא תיקון- clamp פרוסות המוח 3,21-24 ועל שיטות שיכולות לשפר את פתרונות המשמשים 25-27</su...

טכניקת תיקון- clamp, טכניקת אלקטרו אשר פותחה בסוף שנתי ה -1970 1,2, היא כלי עיקרי ללימוד פונקציות ערוץ יון בודדים או מספר רבות של רקמת חיה. בין תצורות תיקון השונות שניתן להשיג, כל תא הקלטות תיקון- clamp לאפשר בחקר ההתנהגות החשמלית של חלק ניכר של הנוירון. קלאסי, טכניקה זו מבוצעת במבחנה או על פרוסות המוח, נוירונים ניתק טרי, או על מודלים תרבית תאים 3. כאשר מבוצע על נוירונים פרוסות המוח, טכניקה זו מציגה מספר יתרונות. בפרט: (i) נוירונים נרשמים מעגלים במוח נשמרו יחסית כי במידה מסוימת, ולעומת הכנות תרבית תאים, לספק סביבה כי היא פיזיולוגית 3 רלוונטית. זה מאפשר לכיד מוקדם, או אפילו ניטור בזמן אמת, אירועים תאיים ומולקולריים שמופעלים על ידי כל סוג של pharmacolog החריפהמניפולציות iCal - החלטה זמנית כי לא יכול להיות מושגת באמצעות קלסי בתנאי vivo; (ii) יכולת לזהות באופן ויזואלי איזורים במוח אצל פרוסות מוח מאפשרת סגולי תיכון אזורי 3 הם באזור המוח למד נוירונים ספציפיים כשהם מבטאים סמני ניאון; (iii) גישה למרחב התאי של התא על ידי פתיחת חלק ניכר של קרום הפלזמה (בניגוד ניקוב הקרום עם micropipette חדה להקלטות תאיות) 4. לעומת זאת, זה מאפשר את התוכן או הריכוז של יונים ספציפיים להלחין הפתרון הפנימי להיות שונה כל כך מטרות מולקולריות או מנגנונים תאיים ניתן ללמוד בתנאים שונים. לדוגמה, על הקמת תצורה כל תא, כל סוכן תרופתי ספציפי (למשל, אנטגוניסטים) כי אחד יכול להוסיף את micropipette הקלטה (פיפטה תיקון) פתרון יהיה מפוזר ישירות לתוך הציטופלסמה ולפעול על putat שלהive מטרות תאיות מבלי לשנות את פונקצית יעד תאי שכנים. בנוסף, לעומת הקלטת micropipette חדה, הפתיחה הגדולה בקצה האלקטרודה מהדק תיקון מספקת התנגדות נמוכה, פחות רעש מתחרות, ולכן גישת חשמל טובה יותר לחלק הפנימי של התא 4. עם זאת, יש לציין כי הפתח הגדול בקצה פיפטה עלול להוביל דיאליזת תא, ובכך אובדן המנגנון מולקולרי תאי שעשויה להיות קריטי עבור הביטוי של התופעות הביולוגיות שאינן תחת 5,6 מחקר. במקרה זה, הקלטות אלקטרודה חד עשויות להיות מתאימות יותר. סוג זה של הקלטות דורש micropipettes עם נקבוביות כי הוא הרבה יותר מאלו המשמשים להקלטות כל תא, ובכך למנוע את רוב חילוף היונים בין שטח תאיים הפתרון פיפטה הפנימי. כל צורה של ניסיון (אקוטי או כרוני), כולל לימוד 7-10, חשיפה לתרופות של התעללות 11,12, מתח 13,14, וכו &#39;, יכול לשנות היבטים שונים של תפקוד עצבי באזורי מוח ספציפיים. בגלל שינויים אלה לעתים קרובות דורשים זמן לפתח (שעות עד ימים), כל תא הקלטות פרוסות מוח מחיות שעברו חוויה ספציפית מאפשרות לחוקרים לזהות את השינויים האלה. בעיקרון, רב (אם לא כל) רכיבים להשתתף פונקציות עצביות (למשל, תעלות יונים המופעל ליגנד, תעלות יונים מגודרות מתח, מובילי הנוירוטרנסמיטר), ובכך מוח מעגל פעילות והתנהגות, ניתן לשנות על ידי ניסיון (ניסיון תלוי פלסטיות) 10,15-17. ברמה העצבית, פעילות במעגל המוח עולה מן האינטראקציות מתמידות בין הסינפטי (למשל, העברת גלוטמט) וגורם רגישות הסלולר מהותית (למשל, תעלות יונים הדנדריטים-axosomato: נתרן, Na +; אשלגן, K +; וסידן, Ca 2 + ). בתנאים ספציפיים באמצעות וולדואר התא תיקון- clamp טכניקות אלקטרו, שינויי אות שמקורם במיוחד משינויים הרגישים מהותי לעומת הסינפטי יכול להיות מבודד. ברוב המקרים, רגישות הסינפטי נבחנת באמצעות טכניקת מתח- clamp כל התא. מצב הקלטה זה מאפשר מדידה של זרמי יון [למשל, בתיווכו של קולטני חומצת α-אמינו-3-הידרוקסי-5-מתיל-4-isoxazolepropionic ( קולטני AMPA) ואת הקולטנים חומצה N-Methyl-D-אספרטית (קולטני NMDA)] דרך הממברנה פלזמה העצבית תוך כדי לחיצה על פוטנציאל הממברנה במתח סט. הנה, הנסיינים להשתמש בפתרונות micropipette פנימיים המכילים צזיום (Cs +), חוסם רחב של K + ערוצים (גורמים רגישים מהותיים מפתח). עם הקמתה של תצורה כל תא, דיפוזיה של Cs + בחלל תאי תחסום K + ערוצים, ובכך תאפשר גם מהדק שטח יעיל יחסית וטרוםלפרוק השפעת הגורמים רגישים מהותיים על מדידות אחרות. סוגיות שטח מהדק, כלומר, קושי מתח- clamp התא כולו, להתעורר בעת הקלטת תאים בצורה סדירה (למשל, נוירונים), ובמיוחד נוירונים עם הדנדריטים עצומים ומורכב סוכת 18,19. כיוון שבקרות גרועות מהדק מתח סומטיים מתח בעץ הדנדריטים של נוירונים, היבטים שונים של אותות חשמליים הדנדריטים נחקרים מעוותים באופן מרחק תלויה הדנדריטים. בשילוב עם כלים תרופתיים כגון (חומצת גמא-aminobutyric, GABA אנטגוניסט לקולטן) picrotoxin או חומצת kynurenic (חוסם רחב של קולטני גלוטמט) מומסים הפתרון התאי (נוזל מלאכותי שדרת Cerebro, ACSF), טכניקה זו מאפשרת המדידה של גלוטמט receptor- ו GABA A R בתיווך זרמים בהתאמה. לעומת זאת, רגישות מהותית בדרך כלל נבחנת במצב הקלטה הנוכחית מהדקת.בניגוד הקלטת מתח- clamp, מצב הקלטה זו מאפשר המדידה של וריאציות פוטנציאלי קרום המושרים על ידי זרמי יון זורמים דרך קרום התא העצבי. בדרך כלל, שינוי ב רגישות מהותית נבחן באמצעות שינויי יכולת נוירונים כדי ליצור פוטנציאל פעולה, מחייב הוא Na + ו- K + ערוצים. לכן, בעת ביצוע הקלטות מהדק הנוכחי, micropipettes מלא פתרון פנימי המכיל K + במקום Cs +. בשילוב עם סוכנים תרופתיים החוסמות גלוטמט GABA A זרמי קולטן בתיווך מומס ACSF, תכנון הניסוי הזה מאפשר מדידת התרומה של גורמים פנימיים (למשל, K + ערוצים) כדי ירי עצבי מבלי מזוהם שינויים פוטנציאליים רגיש הסינפטי גורמים. מאמר זה יתאר את השלבים פרוצדורליים צורך בסיסי to (i) להכין פרוסות מוח בריאות; (Ii) להשיג תצורת כל תא, וכן (iii) לפקח פרמטרים בסיסיים להעריך הסינפטי רגיש מהותי.

<table><tbody><tr><td>מחולל גירוי דופק מבודד</td><td>A.M.P.I</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>יחידת בידוד (ISO-Flex)</td> <td>מגבר מבוקר מחשב A.M.P.I</td><td>ISO-FLEX</td><td></td></tr>&<tr><td>NBSP;</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>מערכת רכישה</td><td>דיגיטלית התקנים מולקולריים</td><td>Digidata 1500</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>BX-51</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>מכשירי סאטר</td><td>MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>מחמם תא ומקוון</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>פורס ויברטום</td><td>לייקה&nbsp;</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת הדמיה</td><td>Q הדמיה</td><td>QIClick-F-M-12</td><td></td></tr><tr><td>חולץ פיפטה Narishige PC-10</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית</td><td>WPI</td><td>TW150F-3</td><td></td></tr><tr><td>פרוסה החזקה (נבל)</td> <td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>64-0255</td><td></td></tr><tr><td>פרוסה קאמרי</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>מחט מזרק לא מתכתית</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G67-5</td><td></td></tr><tr><td>מסנני מזרק</td><td>Nalgene</td><td>176-0045</td><td></td></tr><tr><td>אקדח דבק</td><td>הום דיפו</td><td></td> צינור פיזור גז שונים <td></td></tr><tr><td></td><td>אייס זכוכית בע"מ</td>מספריים <td>שונים</td><td></td></tr><tr><td>לעריפת ראש</td><td>הום דיפו</td><td>100649198</td><td></td></tr><tr><td>ידית אזמל #3</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>מספריים קטנים וישרים חדים</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>14218</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים לקנולציה של כלי שיט&nbsp;</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>500453</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים המוסטטיים מעוקלים</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>501288</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה חסכונית #3</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>501976-6</td><td></td></tr><tr><td>מרית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14357Q</td><td></td></tr><tr><td>מרית גריפה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>פישר מדעי</td><td>08-747B</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון</td><td>Lab Depot</td><td>CFP1-110</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Solutions</td></tr><tr><td colspan="4">Cs-Gluconate Internal Solution (pH 7.2&ndash; 7.3, 280&ndash; 290 mOsm)</חומצה חזקה></td></tr><tr><td>D-גלוקונית 50%&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'/שונים</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>צזיום-OH (CsOH) 50%&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'/</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>שונים NaCl, 2.8 מ"מ</td><td>סיגמא אולדריץ'/שונים</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 20 מ"מ</td><td>סיגמא אולדריץ'/</td><td>שונים H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA, 0.4 מ"מ</td><td>סיגמא אולדריץ'/שונים</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>טטרה אתילאמוניום-Cl, 5 מ"מ</td><td>סיגמא אולדריץ'/שונים</td><td>T2265</td><td></td></tr><tr><td>Na2GTP, 0.3 מ"מ</td><td>סיגמא Aldrich/שונים</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>MgATP, 2 מ"מ</td><td>סיגמא אולדריץ'/שונים</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" ><תמיסה פנימית חזקה>K-גלוקונאט (pH 7.2&ndash; 7.3, 280&ndash; 290 mOsm)</חזק></td></tr><tr><td>K D-גלוקונט, 120 מ"מ</td><td>סיגמא אולדריץ'/</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>KCl שונים, 20 מ"מ</td><td>סיגמא אולדריץ'/שונים</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 10 מ"מ</td><td>סיגמא אולדריץ'/שונים</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA, 0.2 מ"מ</td><td>סיגמא אולדריץ'/שונים</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>MgCl<תת>2</תת></td><td>סיגמא אולדריץ'/שונים</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Na2GTP, 0.3 מ"מ</td><td>סיגמא אולדריץ'/</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>MgATP שונים, 2 מ"מ</td><td>סיגמא אולדריץ'/שונים</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>נוזל מוחי מלאכותי סטנדרטי (ACSF, אוסמולריות ואסימיפ; 300-310 mOsm)</חזק></td></tr><tr><td>KCl, 2.5 מ"מ</td><td>סיגמא אולדריץ'/שונים</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaCl, 119 מ"מ</td><td>סיגמא אולדריץ'/ </td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&#8226; H2O, 1 מ"מ</td><td>סיגמא אולדריץ'/</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO<תת>3, 26.2 מ"מ</td><td>סיגמא אולדריץ'/סוגים</td><td>שונים S8875</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז, 11 מ"מ</td><td>סיגמא אולדריץ'/</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4-7H2O, 1.3 מ"מ</td><td>סיגמא אולדריץ'/230391</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שונים CaCl2- 2H2O, 2.5 מ"מ</td><td>סיגמא אולדריץ'/שונים</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>תרכובות נוספות המשמשות להכנת תמיסות</חזק></td></tr><tr><td>KOH</td><td></td> חומצה קינורנית שונות <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>סיגמא אולדריץ'/שונות</td><td>K3375</td><td></td></tr></tbody></table>

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

הקלטה כל תא מהדק תיקון היא טכניקה אלקטרו המאפשרת חקר את התכונות החשמליות של חלק ניכר של הנוירון. בתצורה זו, את micropipette נמצא בקשר הדוק עם קרום התא, אשר מונע דליפה נוכחית ובכך מספק מדידות זרם יוניות מדויקות יותר מאשר שיטת הקלטת אלקטרודה חד התאית השתמשה בעבר. קלאסי, הקלטה כל תא יכול להתבצע על נוירונים בסוגים שונים של ההכנות, כולל דגמים תרבית תאים, נוירונים ניתק, נוירונים פרוסות המוח, בבעלי חיים שלמים בהרדמה או ער. לסיכום, טכניקה זו תרמה מאוד להבנת מאפייני biophysical פסיביים ואקטיביים של תאים להתרגש. יתרון עיקרי של שיטה זו הוא בכך שהוא מספק מידע על איך מניפולציות ספציפיות (למשל, תרופתית, הנסיין נגרמת פלסטיות) רשאיות לשנות פונקציות עצביות ספציפיות או גhannels בזמן אמת. בנוסף, פתיחה משמעותית של קרום הפלזמה מאפשרת פתרון פיפטה הפנימי לפזר בחופשיות לתוך הציטופלסמה, מתן אמצעים לתרופות מציגות, למשל, אגוניסטים או אנטגוניסטים של חלבונים תאיים ספציפיים, מניפולצית מטרות אלה מבלי לשנות את תפקידיהן תאי שכנים. מאמר זה יתמקד הקלטה כל התא מבוצע על נוירונים פרוסות מוח, הכנה כי יש את היתרון של קלטת הנוירונים מעגלים עצביים במוח השתמרות טובה יחסית, כלומר, בהקשר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. בפרט, כאשר הוא משולב עם פרמקולוגיה מתאים, טכניקה זו היא כלי רב עצמה המאפשר זיהוי של neuroadaptations הספציפי שאירע לאחר כל סוג של חוויות, כגון למידה, חשיפה לתרופות של התעללות, ומתח. לסיכום, כל תא הקלטות תיקון- clamp פרוסות המוח לספק אמצעים למדוד כהכנה vivo לשעבר שינויים ארוכי טווחבפונקציות עצביות שהתפתח חיות ערות ללא פגע.

טמפרטורה, גורם נשלטת בקלות על ידי הנסיין, משפיע על מאפייני biophysical של תעלות יונים ו קולטנים, ובכך צורת הגל של זרמים פוסט-סינפטי (PSCs) (EPSC ו iPSCs) ואת היכולת של נוירונים לעורר קוצים. איור 3 ואיור 4 מראים את השפעת הטמפרטורה על הירי העצבי ושיפוע EPSCs עורר (eEPSCs) בהתאמה. דפוס ירי (איור 3) (כלומר, חביון ספייק 1 st, ספייק מספר, תדירות, ואת צורת הגל פוטנציאל פעולה) מעוצבת על...

פרוטוקול זה מתאר צעדים פרוצדורליים בסיסיים לביצוע הקלטות תיקון- clamp כל תא. טכניקה זו מאפשרת חקר ההתנהגות החשמלית של נוירונים, וכאשר ביצע פרוסות המוח, מאפשר הערכה של פונקציות עצביים שונים מתא עצב שעדיין משולבים מעגלים במוח השתמרות טוב יחסית.

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לתאר כיצד לבצע הקלטות patch-clamp של תא שלם (whole-cell) בנתחים של מוח שחולקו לאחרונה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון כיצד מניפולציות של בקרה ניסויית משנות את פעילותם של נוירונים ספציפיים באזורי מוח ספציפיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת את האמצעי לזיהוי שינויים ארוכי טווח בתפקודי נוירונים שהתפתחו בבעלי חיים ערים ושלמים בתוך הכנה ex vivo.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי תפקודי נוירונים בחתכים של מוח, ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות, כגון תאים בתרבית ונוירונים in vivo. את הפרוצדורה ידגים פרנסיסקו גרסיה-אוסקוס, סטודנט מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, בעזרת פיפט העברה מפלסטיק עם קצה חתוך, שאבו בעדינות פלח מוח אחד מתא ההתאוששות.הנח את פיפט ההעברה בתא ההקלטה, וסגור בעדינות את הפיפט כדי להוציא את הפרוסה אל על לביגסית (cover slip) המניחה בתחתית התא. לאחר מכן, באמצעות עדשת אובייקטיב 4x של המיקרוסקופ, מקם את הפרוסה כך שהאזור הרצוי ימוקם בדיוק במרכז תא ההקלטה. לאחר שהושג המיקום הרצוי, קבע את מיקום פרוסת המוח באמצעות תפס הפרוסה (slice hold down), הידוע גם כנבל (harp).לאחר מכן, עברו לעדשה של 40x, והורידו את העדשה בעדינות עד שתבוא במגע עם ה-ACSF בתא. לאחר מכן, השתמשו בגלגל הכיוון העדין כדי להביא את הרקמה לפוק

whole-cell-patch-clamp-recordings-in-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים את טכניקת הידוק המדבקה של כל התא בפרוסת מוח של עכבר. טכניקה זו יוצרת קשר יציב בין מיקרופיפטה לקרום הנוירון, אשר משתבש עוד יותר כדי ליצור תצורה של תא שלם כדי לחקור את בריאות הנוירון ואת תגובותיו הפיזיולוגיות.

יצירת תצורת תא שלם באמצעות שיטת Patch Clamp

סרטון זה מדגים טכניקה להקלטת מהדק טלאי מפני השטח של הממברנה הדנדריטית. זה עוזר לבחון ישירות את התכונות החשמליות של דנדריטים ותעלות יונים מגודרות מתח בסיסיות בנוירונים דופמינרגיים.

הקלטות מהדק טלאי מהדנדריט של נוירון דופמינרגי בפרוסת מוח

סרטון זה מדגים מיקום פיפטה מחודדת דקה ליד פרוסות מוח, ויוצר חותם עם תא עצבי. היניקה שוברת את קרום התא, ובכך יוצרת מהדק טלאי של התא כולו המאפשר מדידות נוכחיות לניסויים אלקטרופיזיולוגיים.

קביעת תצורת מהדק-מתח של תא שלם לרישומים אלקטרופיזיולוגיים בפרוסות מוח

סרטון זה מדגים את ההליך לביצוע רישומים אלקטרופיזיולוגיים בתאי עצב מסוג substantia gelatinosa (SG) של פרוסות חוט השדרה, תוך שימוש בטכניקות של מהדק טלאי של תאים שלמים כדי לנתח דפוסי ירי של נוירונים. שיטה זו מאפשרת לחקור תגובות עצביות לגירויים בנוירוני SG של חוט השדרה.

רישום מהדק טלאי של תא שלם בנוירון ג'לטינוזה מהותי של פרוסת חוט השדרה

סרטון זה מדגים את ההליך למיפוי קשרים סינפטיים על ידי אבטחת פרוסת מוח, מיקום פיפטות להשגת תצורות של תאים שלמים, וגירוי נוירונים קדם-סינפטיים להקליט תגובות פוסט-סינפטיות, ובכך להבהיר קישוריות עצבית.

רישום מהדק טלאי זוגי של הקשרים העצביים בפרוסות מוח חריפות

הקלטות מהדק טלאי ומילוי ביוציטין תוך-תאי בו זמנית של נוירונים מצומדים סינפטית בפרוסות מוח חריפות מאפשרים ניתוח מתואם של תכונותיהם המבניות והתפקודיות. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר את השלבים הטכניים החיוניים של רישום אלקטרופיזיולוגי ממיקרו-מעגלים עצביים והניתוח המורפולוגי שלהם לאחר מכן.

אלקטרו ומורפולוגי אפיון של שבבים עצביים במוח חריף Slices שימוש מותאם Patch-קלאמפ הקלטות

פרוטוקול זה מדגים יישום אופטימיזציה N-מתיל-D-glucamine (NMDG) שיטת שחזור מגן המוח פרוסה ההכנה. ניסוח מדיה בודד משמש להשיג באופן אמין פרוסות המוח בריא של בעלי חיים בכל גיל, וגם עבור יישומים שונים ומגוונים ניסיוני.

הכנת פרוסות המוח חריפה באמצעות אופטימיזציה N-מתיל-D-שיטת שחזור מגן glucamine

הקלטות מהדק טלאי תת-תאיות מציעות את האפשרות לחקור את התכונות הפונקציונליות של דנדריטים. עם זאת, מבנים עדינים אלה אינם נגישים בקלות בשל קוטרם הקטן. הפרוטוקול המתואר כאן נועד להקל על איסוף הקלטות יציבות ואמינות מהדנדריטים של נוירוני דופמין בפרוסות במבחנה.

הקלטות תיקון מהדק subcellular מן האחוזה Somatodendritic של נוירונים Nigral דופמין

טכניקת מלחציים תיקון פרוסה היא שיטה יעילה עבור ניתוח השינויים הנוצרות על-ידי למידה מאפיינים פנימיים, הפלסטיות של הסינפסות סינאפסות או מעכבות.

פרוסה תיקון קלאמפ טכניקת ניתוח הנוצרות על-ידי למידה פלסטיות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת תפקודית הריבוי סינפטית באמצעות תיקון שלם-תא קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה פרוסות המוח חריפה.

הערכה של ריבוי סינפטית באמצעות תאים כל תיקון-קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע מהדק טלאי של תאים שלמים על פרוסות מוח המכילות נוירוני קיספפטין, המודולטור העיקרי של תאי הורמון משחרר גונדוטרופין (GnRH). על ידי הוספת ידע על פעילות נוירוני קיספפטין, כלי אלקטרופיזיולוגי זה שימש בסיס להתקדמות משמעותית בתחום הנוירואנדוקרינולוגיה במהלך 20 השנים האחרונות.

נוירוני קיספפטין היפותלמיים כיעד להקלטות מהדק טלאי של תאים שלמים

למדו כיצד לבצע הקלטות תיקון מהדק כל תא בפרוסות מוח טריות. שיטה זו מאפשרת לחקור את הפעילות החשמלית של נוירונים ולהעריך תפקודים נוירונליים במעגלים מוחיים שלמים.

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

גלה סרטונים נוספים